胚胎干细胞的跨内细胞质量注射导致嵌合体率增高

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以增加嵌合体生产不使用新设备。一个简单的方向改变的胚胎注射可以增加胚胎的数量, 并有可能缩短时间的生殖传播。

摘要

为了通过 ES 细胞方法提高转基因小鼠的效率, 我们提出了一种对目前囊胚注射协议的适应。在这里, 我们报告, 胚胎的简单旋转, 并通过跨内细胞质量 (TICM) 的注射增加了嵌合体小鼠的百分比从31% 到 50%, 没有额外的设备或进一步的专门训练。在9月内注射了26种不同的近交无性系克隆和35株总无性系。传统注射技术与 TICM 的妊娠率、胚胎恢复率均无显著性差异。因此, 如果没有任何重大改变的注射过程和简单的定位胚泡和注射通过 ICM, 释放 ES 细胞进入囊胚腔可以有可能提高嵌合生产的数量和随后生殖传输。

引言

近25年来, 基因靶向小鼠的产生一直是一个缓慢的过程, 经常受到胚胎干细胞微注射阶段的瓶颈的阻碍, 生殖传送合体的产生。最近的进展, 包括 CRISPR/Cas9^1、2针对 ES 细胞和高吞吐量 es 细胞生成联盟 (如 KOMP), 改善了基因改良 ES 细胞的生成/可用性。然而, 生殖合体的产生仍然是从这些 ES 细胞中创建基因修饰小鼠的瓶颈^3,4。高吞吐量 es 细胞生成项目受到 es 细胞质量高变异性的困扰, 这对于成功创建生殖合体至关重要。此外, 一些常用 ES 细胞系以高体检著称, 生殖主管合体⁵难以生产。

已经开发了许多方法来创建具有更高的嵌合体的老鼠, 或完全 ES 细胞衍生的老鼠^6,7,8,9,10。虽然这些系统都有自己的优点, 但也有其缺点。生成的二、四倍体杂交合体, 同时生成 100% ES 细胞派生的小鼠, 是低效的, 通常限于 outbred^线5, 6.新的注入桑椹胚的方法可以产生高百分比合体, 接近 100%, 但通常需要大量额外设备 (激光器或 piezos) 和训练 10, 11.在这些技术已经到位的实验室里, 可能没有必要采用这种新的方法。

本研究的目的是寻找一种利用常用技术和现成设备来提高嵌合体生成率的方法, 增加突变等位基因生殖传播的几率, 建立后续的小鼠群。

研究方案

所有操作都是作为 NIEHS 击出鼠标核心设施的正常操作的一部分进行的。所有的老鼠都保持在12:12 小时的光: 黑暗的循环, 并喂养 NIH-31 和水的饮食ad 随意.所有的实验都是按照国家环境健康科学研究所的动物护理和使用委员会进行的。

1. 动物制剂

1. 培育捐赠小鼠, B6 (cg)-Tyr < c-2J >/J 雌性小鼠在 8-10 周自然 B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j 雄性小鼠在8和26周的年龄。第二天早上 (E0.5) 目视检查插头。
2. 养殖受体小鼠, 瑞士韦氏雌性小鼠在6和9周的年龄是自然繁殖输精管切除术瑞士韦氏雄性小鼠。第二天早上 (E0.5) 目视检查插头。

2. ES 细胞制剂

1. 对于 129-derieved AB2.2 ES 细胞, DMEM 的培养细胞补充15% 的血清, 1% 谷氨酰胺, 1% 佩恩/链球菌, 0.1% β巯基乙醇。使用推荐的协议, 每 es 细胞供应商的说明中培养所有其他 es 细胞。

3. 胚胎采集

1. 动物解剖
   1. 准备60毫米的菜肴, 大约1每5小鼠加上3额外, 与10毫升爆炸收集媒体 (立方米) (10% DMEM) 和一个4个好菜与 0.5 mL 每井。平衡在37°c, 5% CO₂。
   2. 弄死 B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/J 母鼠 E3.5 使用 CO₂窒息, 流速为10%。
   3. euthanizing 后, 将小鼠置于仰卧位, 用70% 乙醇彻底湿润腹部。
   4. 通过皮肤的第一切口, 在腹部的中点, 使开口尽可能宽。接下来通过腹壁打开, 再次使切口尽可能宽。
      注意: 在两个步骤中做到这一点有助于减少或消除毛皮污染。
   5. 从卵巢开始, 用钝钳抱住卵巢的脂肪垫, 小心地移除卵巢、输卵管和子宫, 格外小心, 使脂肪组织保持最小。将子宫作为单个单位或单独的角移除, 以下过程不发生任何变化。
   6. 取出后, 将子宫放置在含有爆炸收集介质的60毫米盘中。
2. 胚胎切除
   1. 准备一个10毫升的注射器, 装满了立方米, 并配合25克针。
   2. 一次子宫, 将其从所持皿中取出, 将其涂抹在组织上以去除多余的血液, 并在低放大率解剖显微镜下放置在60毫米的盘子中。
   3. 当仔细地和轻轻地举在远端末端 (在输卵管附近) 与解剖钳的子宫, 插入针在子宫的中心在平行一架飞机尽可能。插入针只是在钳的尖端。
   4. 对镊子施加一些压力, 将子宫放到针上, 然后通过子宫角排出大约1毫升的立方米。
      注意: 在这一步必须小心, 因为太多的压力, 注射器会导致一个无法控制的媒体流, 经常离开盘子。
   5. 冲洗后的子宫, 多达5整个子宫每60毫米菜, 把菜放回孵化器, 直到收集。
3. 胚胎采集
   1. 使用手拉玻璃吸管和嘴吸管装置, 收集在解剖范围内的囊胚, 设置在25X 和35X 之间。(图 1)。
      注: 口吸管装置由 30-40 厘米的挠性油管组成, 在5毫米的 id 下插入1、000µL 吸管尖端, 首先指向一端, 并在其上贴上玻璃吸管。添加注射器过滤器到另一端, 附有 1 cc 注射器桶, 没有柱塞, 作为一个口片。
   2. 从孵化器中取出菜肴, 使用网格模式, 检查盘子中的每一部分是否有胚胎。胚胎被单独拾起, 并放置在第二道菜的一滴。
   3. 从所有的菜肴中收集后, 再在一滴新鲜的立方米中再洗一次, 然后放在4井的盘子里等待注射。

4. 胚胎注射

1. 根据确认的注射针分别取 ES 细胞。
   1. 通过加入 5-7 毫升的注射培养基 (DMEM, 10% 血清和20毫米 HEPES), 将注射盘准备成一个玻璃底部注射皿。注射是在室温下进行的。
   2. 使用空气或油 microinjector, 将真空应用于注射针, 以吸引 ES 细胞。注意尽量在细胞间保持尽可能少的空间。计算 ES 细胞在这里, 或在注射步骤。
   3. 选择与普通细胞相比, 大小适中的 ES 细胞, 表面光滑, 无明显的缺陷, 如空泡。
      注意: ES 细胞的形态质量有很大差异, 所使用的标准将需要与之进行调整。
2. 注射大约 15 ES 细胞的胚胎 (图 1)。
   1. 将持有吸管尖端连接到第二个空气 microinjector, 并将胚胎定位在支架的开口附近。应用真空将胚胎固定在支架上。
   2. 通过将保持吸管向上或向下移动来调整 z 轴, 这样胚胎才会接触到滑块, 然后细聚焦在透明的上。接下来, 调整注射针的 Z 轴, 使尖端附近的 ES 细胞处于焦点。
   3. 现在调整胚胎, 通过轻轻推从顶部或底部注射针, 旋转它把 ICM 在理想的位置。
   4. 使用一个坚定但控制的推力插入注射针通过透明的, 或者 ICM 或滋养层。对注射针的 microinjector 施加轻微的压力, 以帮助防止囊胚崩溃。
   5. 一旦针穿透囊胚, 施加 microinjector 的压力, 将 ES 细胞转移到胚胎的囊胚。短暂停顿, 因为针的斜角开始离开胚胎, 使胚胎中的压力恢复正常, 同时仍保留细胞。
      注: 参考组 es 细胞正常注射, 遵循传统 es 细胞注射协议⁹, 注意不要接触 ICM。ES 细胞也被注入通过 icm, 直接推针通过 icm (TICM) (图 2, 补充电影)。

5. eEmbryos 的转让

1. 在 E2.5, 使用非手术胚胎转移装置, 根据制造程序, 将胚胎移植到瑞士韦伯斯特小鼠体内。这种非手术程序不需要麻醉或特殊术后护理。在胚胎移植后, 通过分娩和随后的断奶, 单独喂养小鼠。

结果

以细胞系为随机效应, 采用混合效应线性模型分析软件中的数据 (如 SAS (9.2 版))。每种分析都控制着移植胚胎的数量和细胞系。第二种分析还控制了存活的幼崽数量。

在这项研究中, 每种 ES 细胞系和克隆均采用传统的和 TICM 的技术, 在每个胚胎后交替使用。注射后, 胚胎被隔离在盘子上, 并分组的转移, 一般在12和15胚胎每接受女?...

讨论

长期以来, 人们一直认为 ICM 的任何干扰都可能导致死亡率, 事实上, 目前的胚泡微注射协议仍然警告此^12,13。我们在这里显示的是, 通过 ICM 的显微注射不损害胚胎, 并增加合体的产量。

这种效果的确切机制尚未确定。然而, ICM 的机械干扰, 以及伴随的 hypoblast, 应将 ES 细胞的发病率增加到新形成的 ICM 后, 显微注射。最近在 iPSCs 领域的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ES Cell injection needle	Humagen	MSC-20-0
NSET device	Paratechs	60010
DMEM	Gibco (life technologies)	11965-092
FBS	Gibco (life technologies)	10439-024	lots should be individually tested for ES Cell compatibility.
HEPES	Sigma	H0887
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Micro manipulator	Leica	Micro manipulator
micro injector	Eppendorf AG	Cell Tram Air 5176
Microscope	Leica	DM IRB
4 well dish	Thermo Scientific	176740
60 mm dish	Sarstedt	83.3901
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J	Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA	000058
Swiss Webster mice	Taconic, USA	Tac:SW
Injection Dish	MatTek Corp.	P50G-0-30-F