Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erhöhung der Chimäre Produktion ohne den Einsatz von neuen Geräten. Eine einfache Orientierung Änderung des Embryos zur Injektion kann erhöhen Sie die Anzahl der erzeugten Embryonen und potenziell reduzieren die Timeline Germline Übertragung.

Zusammenfassung

In dem Bemühen zur Steigerung der Effizienz bei der Erstellung von genetisch veränderten Mäusen über ES Zelle Methoden präsentieren wir Ihnen eine Anpassung an das aktuelle Protokoll der Blastozyste-Injektion. Hier berichten wir, dass eine einfache Drehung des Embryo und Injektion durch Trans-innere Zellmasse (TICM) der Anteil der chimeric Mäuse von 31 % bis 50 %, ohne zusätzliche Ausrüstung stieg oder Ausbildung weiter spezialisiert. 26 verschiedene Inzucht Klone und 35 insgesamt Klone wurden über einen Zeitraum von 9 Monaten injiziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied in Schwangerschaftsrate oder Verwertungsquote von Embryonen zwischen traditionellen Injektionstechniken und TICM. Daher kann ohne jede große Veränderung in der Einspritzvorgang und eine einfache Positionierung der Blastozyste und Injektion durch das ICM, Freisetzung von ES-Zellen in den blastocöl Hohlraum möglicherweise die Menge der Chimären Produktion und anschließende verbessern Germline Übertragung.

Einleitung

Die Schaffung von genetisch gezielte Mäusen ist seit fast 25 Jahren ein langsamer Prozess, oft durch einen Engpass im Blastozysten ES Zell Mikroinjektion-Stadium für die Generation der Keimbahn Übertragung von Chimären behindert. Neue Zuführungen, darunter CRISPR/Cas9^1,2 targeting in ES-Zellen und Hochdurchsatz-ES Handy-Generation Konsortien wie KOMP, haben die Generation/Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten ES-Zellen verbessert. Die Generation der Keimbahn Chimären bleibt jedoch einen Engpass bei der Schaffung von genetisch veränderter Mäusen aus diesen ES Zellen^3,4. Hochdurchsatz-ES Zelle stromerzeugungsprojekte haben durch hohe Variabilität in ES-Zellen-Qualität, die entscheidend für die erfolgreiche Erstellung der Keimbahn Chimären ist geplagt. Darüber hinaus sind einige der häufig verwendeten ES-Zelllinien für hohe Aneuploidie und schwierige Produktion der Keimbahn zuständigen Chimären⁵bekannt.

Viele Methoden wurden entwickelt für die Erstellung von Mäusen mit entweder eine höhere Chimäre oder komplett ES Zelle abgeleitet Mäuse^6,7,8,9,10. Während jedes dieser Systeme seine eigenen Vorzüge hat, haben sie auch ihre Schwächen. Die Generation der tetraploiden Chimären, während generieren 100 % ES Zelle Mäuse, abgeleitet ist ineffizient und in der Regel beschränkt auf fremd-Linien ^5,6. Neuere Methoden der Morula Injektion können Ausbeute hohen Prozentsatz Chimären, annähernd 100 %, aber erfordern in der Regel erhebliche zusätzliche Ausrüstung (Laser oder Piezos) und Training^10,11. Im Labor, wo diese Techniken bereits vorhanden sind, kann diese neue Methode nicht erforderlich sein.

Ziel dieser Studie war es, eine Methode zu finden, die gängige Techniken und leicht verfügbare Ausrüstung zur Erhöhung der Chimäre-Generation, die Chance der Keimbahn Übertragung des mutierten Allels, die anschließende Maus Kolonie zu erhöhen verwendet.

Protokoll

Alle Arbeiten erfolgten im Rahmen des normalen Betriebs des NIEHS Knock Out Maus Core Facility. Alle Mäuse blieben auf einem 12:12 h Licht: Dunkel-Zyklus, und waren eine Diät von NIH-31 und Wasser ernähren ad libitum. Alle Versuche wurden im Einklang mit der Animal Care und Gebrauch von dem National Institute of Environmental Health Sciences durchgeführt.

(1) tierische Vorbereitung

1. Züchten Spender Mäuse, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j weiblichen Mäusen bei 8-10 Wochen alt natürlich bis B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j männliche Mäuse zwischen 8 und 26 Wochen alt. Sichtkontrolle Stecker am nächsten Morgen (E0.5).
2. Züchten Sie Empfänger Mäuse, Schweizer Webster weibliche Mäuse zwischen 6 und 9 Wochen alt natürlich vasektomierten Schweizer Webster männlichen Mäusen gezüchtet werden. Sichtkontrolle Stecker am nächsten Morgen (E0.5).

2. ES Handy Vorbereitung

1. Kultur für 129-Derieved-AB2.2 ES-Zellen, Zellen in DMEM ergänzt mit 15 % FBS, 1 % Glutamin, 1 % Penn/Strep und 0,1 % β-Mercaptoethanol. Andere ES-Zellen pro ES Zelle Lieferant Anweisungen, ihre empfohlene Protokolle mit Kultur.

(3) Embryo Collection

1. Tierische Dissektion
   1. Bereiten Sie mehrere 60 mm Schalen, ca. 1 pro 5 Mäusen plus 3 Extra, mit 10 mL Sammlung Strahlmittel (BCM) (10 % FBS IN DMEM), und einem 4 Schüssel gut mit 0,5 mL BCM pro Bohrloch. Equilibrate bei 37 ° C, 5 % CO₂.
   2. Einschläfern B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j weiblichen Mäusen bei 3,5 mit CO₂ Erstickung, mit einer Flussrate von 10 %.
   3. Legen Sie nach euthanizing die Mäuse in der Rückenlage und nass des Bauches gründlich mit 70 % Ethanol.
   4. Den erste Schnitt durch die Haut nur, in der Mitte des Bauches, so dass die Öffnung so weit wie möglich zu machen. Als nächstes öffnen Sie durch die Bauchdecke wieder den Schnitt so weit wie möglich zu machen.
      Hinweis: Dabei in zwei Schritten hilft, verringern oder beseitigen Fell Verschmutzungen.
   5. Ein Eierstock ab und hält die Fettpolster des Eierstocks mit stumpfen Pinzette entfernen Sie vorsichtig die Eierstöcke, Eileiter und Gebärmutter, wobei besonders vorsichtig, um das Fettgewebe auf ein Minimum zu reduzieren. Die Gebärmutter zu entfernen, als eine einzelne Einheit oder als einzelne Hörner, ohne Änderung in der folgenden Prozedur.
   6. Legen Sie nach der Entfernung die Gebärmutter in eine 60 mm Schale mit Strahlmittel Sammlung
2. Embryo-Entfernung
   1. Bereiten Sie eine 10 mL Spritze mit BCM gefüllt und mit einer 25 G Nadel passen.
   2. Eine Gebärmutter in einer Zeit, entfernen Sie sie aus der Schale der Abhaltung von BCM, Tupfen Sie sie auf ein Gewebe zu entfernen überschüssiges Blut, und legen Sie in einer 60 mm Petrischale unter einer niedrigen Vergrößerung Mikroskop seziert.
   3. Halten Sie vorsichtig und sanft die Gebärmutter direkt unter dem distalen Ende (in der Nähe der Eileiter) mit Zange sezieren, fügen Sie die Nadel in der Mitte der Gebärmutter in als Parallel ein Flugzeug wie möglich. Stechen Sie die Nadel direkt hinter den Spitzen der Zange.
   4. Einigen Druck auf die Zange, die Gebärmutter, die Nadel zu halten, und etwa 1 mL der BCM durch das Horn des Uterus zu vertreiben.
      Hinweis: Bei diesem Schritt Vorsicht ist da zu viel Druck auf die Spritze einen unkontrollierbaren Stream Medien, führt oft verlassen das Gericht.
   5. Nach dem Spülen der Gebärmutter bis zu 5 ganze Uteri pro 60 Millimeter-Teller, legen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator bis zur Abholung.
3. Embryo-Sammlung
   1. Mit einer Hand gezeichnete Glaspipette und einen Mund Pipette Apparat, sammeln Sie Blastozysten einen sezierenden Rahmen bis 25 X 35 X festgelegt. (Abbildung 1).
      Hinweis: Mund Pipette Apparatur besteht aus 30-40 cm Schlauch, unter 5 mm I.D. Legen Sie ein 1 000 µL PIPETTENSPITZE, zuerst in an einem Ende und befestigen Sie die Glaspipette drin. Fügen Sie an das andere Ende mit einer angehängten 1 cc Spritzenzylinder, keine Kolben, als ein Mundstück handeln Spritze Filter hinzu.
   2. Gerichte aus dem Inkubator zu entfernen und mit einem gittermuster untersuchen Sie jeden Teil der Schale für Embryonen. Embryonen werden gepflückt, einzeln auf und legen Sie auf die Tropfen BCM in eine zweite Schüssel.
   3. Nach dem Sammeln von allen Gerichten, waschen Sie die Embryonen noch einmal in einem Tropfen frisch BCM, und platzieren Sie die 4 gut Gericht Injektion zu erwarten.

4. Embryo Injektion

1. ES-Zellen holen Sie einzeln mit der Injektionsnadel basierend auf Bestätigung ab.
   1. Bereiten Sie eine Injektion Gericht durch Zugabe von 5-7 mL Injektion Medien (DMEM, 10 % FBS und 20 mM HEPES) zur Injektion Glasschale unten. Injektionen sind bei Raumtemperatur durchgeführt.
   2. Verwenden entweder eine Luft oder Öl Microinjector, Vakuum auf der Injektionsnadel Embryonaler Stammzellen zu zeichnen, anwenden. Achten Sie darauf, um so wenig Raum wie möglich zwischen den Zellen zu halten. Die ES-Zellen zu zählen, hier oder bei der Injektion Schritt.
   3. Wählen Sie Embryonische Stammzellen, die Mittel bis klein im Vergleich zur allgemeinen Bevölkerung der Zellen, mit glatter Oberfläche und ohne offensichtliche Mängel wie Vakuolen sind.
      Hinweis: ES-Zell-Populationen variieren stark in morphologischen Qualität und Standards verwendet musst mit ihnen anpassen.
2. Injizieren Sie Embryonen mit ca. 15 ES-Zellen (Abbildung 1).
   1. Anhängen einer haltepipette Tipp: um eine zweite Luft-Microinjector und einen Embryo in der Nähe der Öffnung des Inhabers zu positionieren. Gelten Sie Vakuum um den Embryo an den Inhaber zu sichern.
   2. Für die Z-Achse von der haltepipette oben oder unten zu verschieben, so dass der Embryo nur die Folie, gefolgt von Feinfokussierung auf die Zona berührt einstellen. Als nächstes einstellen Sie die Z-Achse von der Injektionsnadel so, dass ES-Zellen in der Nähe der Spitze im Mittelpunkt stehen.
   3. Passen Sie den Embryo nun durch leichten Druck aus der Injektionsnadel an der Ober- oder Unterseite, drehen es um ICM in die gewünschte Position setzen.
   4. Legen Sie die Injektionsnadel durch die Zona und ICM oder Trophoblast, einen festen, aber kontrollierten Push verwenden. Leichten Druck auf die Microinjector der Injektionsnadel zu helfen, das blastocöl vor dem Kollaps.
   5. Sobald die Nadel das blastocöl eingedrungen ist, üben Sie Druck aus der Microinjector, ES-Zellen auf das blastocöl des Embryos zu übertragen. Pause kurz als die schräge der Nadel beginnt, verlassen Sie den Embryo um den Druck des Embryos zurück zu normal, Beibehaltung der Zellen zu ermöglichen.
      Hinweis: Referenz-Gruppe-ES-Zellen wurden normalerweise injiziert, Anschluss an eine traditionelle ES Handy Injektion Protokoll⁹, kümmert sich nicht um das ICM zu berühren. ES-Zellen wurden auch durch das ICM, schieben die Nadel direkt durch das ICM (TICM) (Abbildung 2ergänzende Film) injiziert.

5. Übertragung von eEmbryos

1. Transferieren Sie die Embryonen an Schweizer Webster Mäuse am E2.5, mit einem nicht-chirurgische Embryo Transfer Gerät pro Verfahren der Herstellung. Dieses nicht-chirurgische Verfahren erfordert keine Anästhesie oder spezielle postoperative Pflege. Hausmäuse individuell nach dem Transfer der Embryonen und durch Lieferung und anschließende absetzen.

Ergebnisse

Zell-Linie als des random-Effekts zu behandeln, wurde ein lineares Modell gemischte Effekte verwendet, zum Analysieren der Daten in der Software (z.B. SAS (Version 9.2)). Jede Analyse für die Anzahl der übertragenen Embryonen und die Zell-Linie gesteuert. Die zweite Analyse auch für die Anzahl der Welpen, die überlebt gesteuert.

Für diese Studie jedes ES Zelllinie und Klon wurde sowohl mit traditionellen injiziert und TICM ...

Diskussion

Es hat lange gedacht, dass jede Störung des ICM aktuellen Blastozyste Mikroinjektion Protokolle warnen noch dieser^12,13zur Sterblichkeit, in der Tat führen könnte. Was wir hier gezeigt haben ist, die Mikroinjektion durch das ICM ist nicht schädlich für den Embryo und erhöht den Ertrag der Chimären.

Der genaue Mechanismus für diesen Effekt wurde nicht festgestellt. Allerdings sollte die mechanische Beeinträchtigung der ICM und ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ES Cell injection needle	Humagen	MSC-20-0
NSET device	Paratechs	60010
DMEM	Gibco (life technologies)	11965-092
FBS	Gibco (life technologies)	10439-024	lots should be individually tested for ES Cell compatibility.
HEPES	Sigma	H0887
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Micro manipulator	Leica	Micro manipulator
micro injector	Eppendorf AG	Cell Tram Air 5176
Microscope	Leica	DM IRB
4 well dish	Thermo Scientific	176740
60 mm dish	Sarstedt	83.3901
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J	Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA	000058
Swiss Webster mice	Taconic, USA	Tac:SW
Injection Dish	MatTek Corp.	P50G-0-30-F