TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à augmenter la production de chimère sans l’utilisation de nouveaux équipements. Un changement d’orientation simple de l’embryon pour injection peut augmenter le nombre d’embryons obtenus et potentiellement réduire la chronologie à la transmission de la lignée germinale.

Résumé

Dans le but d’accroître l’efficacité dans la création de souris génétiquement modifiées par l’intermédiaire de méthodes ES cellules, nous présentons une adaptation à l’actuel protocole d’injection de blastocyste. Nous rapportons ici qu’une simple rotation de l’embryon et l’injection à travers une masse cellulaire interne-Trans (TICM) a augmenté le pourcentage de souris chimériques de 31 % à 50 %, sans équipement supplémentaire ou une formation plus spécialisée. 26 différentes lignées autofécondées clones et 35 totales clones ont été injectés sur une période de 9 mois. Il n’y avait aucune différence significative dans les taux de grossesse ou les taux de récupération d’embryons entre des techniques d’injection traditionnelles et TICM. Par conséquent, sans aucune modification majeure dans le processus d’injection et un positionnement simple du blastocyste et injecter par l’intermédiaire de l’ICM, libérant les cellules ES dans la cavité du blastocèle peut potentiellement améliorer la quantité de production chimérique et ultérieures transmission de la lignée germinale.

Introduction

Depuis près de 25 ans, la création de souris génétiquement ciblées est un processus lent, souvent entravé par un goulot d’étranglement au stade de blastocystes ES cellules microinjection pour la génération de la lignée germinale transmettant des chimères. Des avancées récentes, y compris CRISPR/Cas9^1,2 , le ciblage des cellules ES et ES haut débit cell consortiums de génération comme KOMP, ont amélioré la génération/disponibilité des cellules génétiquement modifiées. Cependant, la génération de la lignée germinale chimères reste un goulot d’étranglement dans la création de souris génétiquement modifiées de ces ES cellules^3,4. Projets de production de haut débit ES cellules ont été en proie à la grande variabilité dans la qualité de cellules ES, ce qui est essentielle pour le succès de la création de chimères de la lignée germinale. En outre, certains des lignées de cellules ES couramment utilisées sont connus pour aneuploïdie élevée et la production difficile de germline chimères compétentes⁵.

Plusieurs méthodes ont été développées pour la création de souris avec une chimère soit supérieure ou complètement ES cellule dérivée souris^6,7,8,9,10. Alors que chacun de ces systèmes a ses propres mérites, ils ont aussi leurs défauts. La génération de chimères tétraploïdes, tout en générant des cellules ES 100 % provenant de souris, est inefficace et généralement limité à des lignes non consanguins ^5,6. Des méthodes plus récentes de l’injection de morula peuvent céder le pourcentage élevé de chimères, approchant les 100 %, mais généralement nécessitent un équipement supplémentaire significatif (lasers ou piezos) et la formation^10,11. Dans les laboratoires où ces techniques sont déjà en place, cette nouvelle méthode ne peut pas être nécessaire.

Cette étude avait pour but de trouver une méthode qui utilise les techniques courantes et des équipements disponibles pour augmenter le taux de génération de chimère, augmentant les chances de transmission de la lignée germinale de l’allèle mutant pour établir la colonie de souris ultérieures.

Protocole

Toutes les opérations ont été effectuées dans le cadre du fonctionnement normal de l’installation du NIEHS Knock Out souris Core. Toutes les souris ont été maintenus sur un 12:12 cycle h lumière : obscurité et ont été donner une nourriture de NIH-31 et de l’eau ad libitum. Toutes les expériences ont été effectuées conformément à la protection des animaux et le Comité d’urbanisme de l’Institut National de Environmental Health Sciences.

1. la préparation animaux

1. Race de souris de donateurs, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J souris femelles à 8-10 semaines d’âge naturellement à B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J souris mâles entre 8 et 26 semaines d’âge. Bouchons de vérifier visuellement le lendemain matin (E0.5).
2. Nichent souris destinataires, Swiss Webster souris femelles entre 6 et 9 semaines d’âge sont naturellement élevés à des souris mâles Swiss Webster vasectomisés. Bouchons de vérifier visuellement le lendemain matin (E0.5).

2. préparation de cellules ES

1. 129-derieved AB2.2 CSEh, culture des cellules en DMEM supplémenté avec 15 % FBS, 1 % de Glutamine, 1 % Penn/strep et 0,1 % β-mercaptoéthanol. Culture de toutes les autres cellules ES selon les instructions du fournisseur de cellules ES, à l’aide de leurs protocoles recommandés.

3. la collecte des embryons

1. Dissection animale
   1. Préparer plusieurs boîtes de 60 mm, environ 1 par 5 souris plus 3 extra, avec 10 mL blast collection médias (BCM) (10 % BF en DMEM), et un 4 bien plat avec 0,5 mL BCM / puits. Equilibrer à 37 ° C, 5 % de CO₂.
   2. Euthanasier B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J souris femelles à E3.5 à l’aide de CO₂ asphyxie, avec un débit de 10 %.
   3. Après l’euthanasie, placez les souris en décubitus dorsal et mouiller l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.
   4. Faire la première incision à travers la peau seulement, au milieu de l’abdomen, rendant l’ouverture aussi large que possible. Ensuite, ouvrez à travers la paroi abdominale, encore une fois faire l’incision aussi large que possible.
      Remarque : Ce faisant en deux étapes permet de réduire ou éliminer la contamination de la fourrure.
   5. À partir de l’ovaire et tenant de la garniture de l’ovaire avec une pince émoussée, retirer soigneusement l’ovaire, oviducte et utérus, prendre des précautions supplémentaires pour maintenir le tissu adipeux au minimum. Enlever l’utérus comme une seule unité ou cornes individuels, sans changement dans la procédure suivante.
   6. Après le retrait, placez l’utérus dans un plat de 60 mm contenant les médias collection blast.
2. Élimination de l’embryon
   1. Préparez une seringue de 10 mL remplie de BCM et dotée d’une aiguille 25 G.
   2. Un utérus à un moment, retirer le plat de la tenue du BCM, les éponger sur un mouchoir en papier pour enlever le sang excédentaire et placer dans un plat de 60 mm sous un grossissement faible binoculaire.
   3. Tenez soigneusement et délicatement l’utérus juste en dessous de l’extrémité distale (près de l’oviducte) avec pinces de dissection et insérez l’aiguille au centre de l’utérus en parallèle un avion que possible. Insérer l’aiguille juste au-delà de l’extrémité de la pince.
   4. Appliquer une pression à la pince pour maintenir l’utérus à l’aiguille et d’expulser environ 1 mL de BCM à travers la corne de l’utérus.
      Remarque : Il faut à cette étape, trop de pression sur la seringue qui provoquerait un flux incontrôlable de médias, laissant souvent le plat.
   5. Après le rinçage de l’utérus, l’utérus entiers jusqu'à 5 par plat de 60 mm, placer la capsule dans l’incubateur jusqu’en collection.
3. Collecte des embryons
   1. À l’aide d’une pipette de verre dessiné de main et un appareil de pipette de bouche, recueillir des blastocystes sous une dissection étendue, situé entre 25 X et 35 X. (Figure 1).
      Remarque : Appareil de pipette de bouche se compose de 30-40 cm de tuyau flexible, moins de 5 mm ø int. Insérer un 1, 000 de pipette µL, pointez tout d’abord à une extrémité et d’apposer la pipette de verre dedans. Ajouter un filtre de seringue à l’autre extrémité, avec un joint 1 cc seringue, sans piston, d’agir comme un embout buccal.
   2. Enlèvement des contenants de l’incubateur et à l’aide d’un quadrillage, examinent chaque partie du plat pour les embryons. Les embryons sont pris individuellement vers le haut et placez sur la goutte de BCM dans un plat secondaire.
   3. Après le rassemblement de tous les plats, laver les embryons une fois de plus une baisse des frais BCM et ensuite placer dans le plat bien 4 pour attendre l’injection.

4. embryon Injection

1. Ramasser les cellules ES individuellement avec l’aiguille d’injection basée sur la confirmation.
   1. Préparer un plat d’injection en ajoutant 5-7 mL des fluides d’injection (DMEM, 10 % FBS et 20 mM HEPES) à un plat en verre fond injection. Les injections sont effectuées à température ambiante.
   2. Microinjector un air ou huile, appliquez au vide à l’aiguille d’injection pour dessiner des cellules ES dans. Prenez soin de garder en tant que peu d’espace que possible entre les cellules. Compter les cellules ES ici, ou à l’étape de l’injection.
   3. Sélectionnez les cellules ES qui sont des moyennes et petites dimensions par rapport à l’ensemble de la population de cellules, avec une surface lisse et sans défauts apparents tels que les vacuoles.
      Remarque : Les populations de cellules ES varient considérablement en qualité morphologique et les normes utilisées devront s’adapter avec eux.
2. Injecter des embryons avec environ 15 cellules ES (Figure 1).
   1. Attacher une pipette holding astuce pour un deuxième microinjector d’air et un embryon près de l’ouverture du titulaire du poste. Appliquer le vide pour fixer l’embryon au titulaire.
   2. Réglage de l’axe z en déplaçant la pipette tenue vers le haut ou vers le bas afin que l’embryon est juste toucher la lame, suivie d’une mise au point fine sur le zona. Ensuite, ajustez l’axe Z de l’aiguille d’injection afin que les cellules ES près de la pointe sont en discussion.
   3. Réglez maintenant l’embryon en poussant doucement de l’aiguille d’injection en haut ou en bas, tournant pour mettre l’ICM dans la position désirée.
   4. Insérer l’aiguille d’injection par le zona et l’ICM ou par le trophoblaste, à l’aide d’une pression ferme mais contrôlée. Exercer une légère pression sur le microinjector de l’aiguille d’injection pour aider à empêcher le blastocèle de s’effondrer.
   5. Une fois l’aiguille a pénétré le blastocèle, appliquer une pression de la microinjector pour transférer les cellules ES vers le blastocèle de l’embryon. Pause brièvement comme le biseau de l’aiguille commence à sortir de l’embryon pour laisser descendre la pression dans l’embryon pour revenir à la normale, tout en conservant les cellules.
      NOTE : Suite à un traditionnel ES cellules injection protocole⁹, prenant soin de ne pas pour toucher l’ICM, référence groupe ES des cellules ont été injectées normalement. Les cellules ES étaient aussi injectés par le biais de l’ICM, poussant l’aiguille directement grâce à l’ICM (TICM) (Figure 2film supplémentaire).

5. transfert d’eEmbryos

1. Transfert des embryons de souris Swiss-Webster à E2.5, à l’aide d’un dispositif de transfert d’embryon non chirurgical, par des procédures de la manufacture. Cette procédure non-chirurgicale ne nécessite aucune anesthésie ou soins postopératoires spéciaux. Souris domestiques individuellement après le transfert d’embryons et par livraison et sevrage ultérieur.

Résultats

Traitement de lignée cellulaire comme l’effet aléatoire, un modèle linéaire à effets mixtes a été utilisé pour analyser les données dans le logiciel (p. ex. SAS (version 9.2)). Chaque analyse contrôlée pour le nombre d’embryons transférés et la lignée cellulaire. La deuxième analyse également contrôlée pour le nombre de chiots qui ont survécu.

Pour cette étude, chaque lignée cellulaire ES et clone a ét?...

Discussion

On a longtemps pensé que toute perturbation de l’ICM pourrait conduire à la mortalité, en effet, les protocoles actuels de microinjection de blastocyste toujours avertissent de cette^12,13. Ce que nous avons montré ici est que la microinjection par le biais de l’ICM ne nuire pas à l’embryon et augmente le rendement de chimères.

Le mécanisme exact de cet effet n’a pas été identifié. Cependant, la rupture mécanique de l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ES Cell injection needle	Humagen	MSC-20-0
NSET device	Paratechs	60010
DMEM	Gibco (life technologies)	11965-092
FBS	Gibco (life technologies)	10439-024	lots should be individually tested for ES Cell compatibility.
HEPES	Sigma	H0887
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Micro manipulator	Leica	Micro manipulator
micro injector	Eppendorf AG	Cell Tram Air 5176
Microscope	Leica	DM IRB
4 well dish	Thermo Scientific	176740
60 mm dish	Sarstedt	83.3901
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J	Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA	000058
Swiss Webster mice	Taconic, USA	Tac:SW
Injection Dish	MatTek Corp.	P50G-0-30-F