Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para aumentar a produção da Quimera sem o uso de novos equipamentos. Uma mudança de orientação simples do embrião para injeção pode aumentar o número de embriões produzidos e potencialmente reduzir a linha do tempo de transmissão da linha germinal.

Resumo

Em um esforço para aumentar a eficiência na criação de ratos geneticamente modificados através de metodologias de célula ES, apresentamos uma adaptação para o atual protocolo de injeção de blastocisto. Aqui nós relatamos que uma simples rotação do embrião e injeção através de massa celular de Trans-interior (TICM) aumentou a porcentagem de ratos quiméricoes de 31% para 50%, sem nenhum equipamento adicional ou formação mais especializada. e mais uns 26 diferentes clones, e 35 totais clones foram injetados ao longo de um período de 9 meses. Não houve nenhuma diferença significativa entre as técnicas tradicionais de injeção e TICM na taxa de gravidez ou taxa de recuperação de embriões. Portanto, sem qualquer alteração importante no processo de injeção e um simples posicionamento do blastocisto e injetando através do ICM, liberando as células ES na cavidade blastocoel pode potencialmente aumentar a quantidade de produção quimérico e subsequente transmissão da linha germinal.

Introdução

Por quase 25 anos, a criação de camundongos geneticamente alvo tem sido um processo lento, muitas vezes prejudicado por um gargalo na fase de microinjeção de blastocistos ES celular para a geração de germline transmitindo quimeras. Recentes avanços, incluindo CRISPR/Cas9^1,2 direcionamento em pilhas do ES e elevado-throughput ES celulares consórcios de geração como KOMP, melhoraram a geração/disponibilidade de células ES geneticamente modificadas. No entanto, a geração de quimeras germline continua a ser um gargalo na criação de ratos geneticamente modificados destas células de ES^3,4. Projetos de geração de célula do elevado-throughput ES tem sido atormentados por alta variabilidade na qualidade de célula ES, que é fundamental para a criação bem sucedida do germline quimeras. Além disso, algumas das linhas celulares ES comumente utilizadas são conhecidas por aneuploidia alta e difícil produção do germline quimeras competente⁵.

Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a criação de ratos com uma quimera ou superior, ou completamente ES células derivadas ratos^6,7,8,9,10. Enquanto cada um desses sistemas tem seus próprios méritos, eles também têm suas falhas. A geração de quimeras tetraploide, enquanto gerar células de ES 100% derivado de ratos, é ineficiente e geralmente limitado a linhas outbred ^5,6. Novos métodos de injeção de mórula podem gerar alta porcentagem de quimeras, quase 100%, mas geralmente requerem equipamento adicional significativo (lasers ou piezos) e formação de^10,11. Nos laboratórios onde estas técnicas já estão em vigor, esta nova metodologia pode não ser necessária.

O objetivo do presente estudo foi encontrar um método que usa técnicas comuns e equipamentos disponíveis para aumentar a taxa de geração de Quimera, aumentando a chance de transmissão do germline do alelo mutante para estabelecer a colônia de rato subsequentes.

Protocolo

Todas as operações foram feitas como parte da operação normal da instalação NIEHS Knock Out Mouse Core. Todos os ratos foram mantidos em um 12:12 ciclo h luz: escuro e foram alimentar uma dieta de NIH-31 e água ad libitum. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o Comité de utilização do nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental e cuidado Animal.

1. preparação animal

1. Raça de ratos do doador, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J ratos fêmeas em 8-10 semanas de idade naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J camundongos machos entre 8 e 26 semanas de idade. Verificar visualmente se conecta na manhã seguinte (E0.5).
2. Raça de ratos destinatários, Swiss Webster ratos fêmeas entre 6 e 9 semanas de idade são naturalmente criados para camundongos machos de Swiss Webster vasectomizados. Verificar visualmente se conecta na manhã seguinte (E0.5).

2. preparação da pilha ES

1. Para as células de AB2.2 ES 129-derieved, cultura de células em DMEM suplementado com 15% FBS, 1% glutamina, 1% Penn/estreptococos e 0,1% β-Mercaptoetanol. Cultura de todas as outras células ES segundo as instruções do fornecedor de celular ES, usando seus protocolos recomendados.

3. embrião coleção

1. Dissecação de animais
   1. Preparar vários pratos de 60 mm, aproximadamente 1 por 5 ratos mais 3 extra, com mídia de coleção de explosão de 10 mL (BCM) (10% FBS em DMEM), e um 4 bom prato com 0,5 mL BCM por bem. Equilibrar a 37 ° C, 5% de CO₂.
   2. Eutanásia em B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J camundongos fêmeas no E3.5 usando asfixia de CO₂ , com um caudal de 10%.
   3. Após a eutanásia, coloque os ratos na posição supina e molhar o abdômen completamente com etanol a 70%.
   4. Façam a primeira incisão através da pele somente, no ponto médio do abdômen, fazendo a abertura tão ampla quanto possível. Em seguida abra através da parede abdominal, fazendo a incisão tão ampla quanto possível.
      Nota: A fazer isto em dois passos ajuda a reduzir ou eliminar a contaminação da pele.
   5. Começando com um ovário e segurando do tecido do ovário com fórceps rombudo, remover cuidadosamente o ovário, oviduto e útero, tomar cuidado extra para manter o tecido adiposo a um mínimo. Remova o útero como uma única unidade, ou como chifres individuais, com nenhuma mudança no procedimento a seguir.
   6. Após a remoção, coloque o útero em um prato de 60 mm que contém a mídia de coleção de explosão.
2. Remoção do embrião
   1. Preparar uma seringa de 10ml cheia de BCM e se encaixam com uma agulha de 25 G.
   2. Um útero de cada vez, removê-los do prato de exploração do BCM, exterminá-los em um lenço de papel para remover o excesso de sangue e coloque em um prato de 60 mm em um pequeno aumento, microscópio de dissecção.
   3. Mantendo cuidadosamente e suavemente o útero, logo abaixo da extremidade distal (perto do oviduto) com pinça de dissecação, introduza a agulha para o centro do útero em como paralelo um avião quanto possível. Insira a agulha passando as pontas da pinça.
   4. Aplicar alguma pressão a pinça para segurar o útero para a agulha e expulsar aproximadamente 1 mL de BCM através do corno do útero.
      Nota: Tenha cuidado neste passo, como muita pressão na seringa causará um fluxo incontrolável de mídia, muitas vezes deixando o prato.
   5. Após a lavagem do útero, útero todo até 5 por prato de 60 mm, coloque o prato de volta na incubadora até coleção.
3. Colheita de embriões
   1. Usando uma pipeta de vidro estirado de mão e um aparelho de pipeta de boca, recolha blastocistos sob um escopo de dissecação, situado entre 25 X e 35 X. (Figura 1).
      Nota: Aparelho de pipeta boca consiste em 30-40 cm de tubo flexível, abaixo dos 5 mm identificação inserir um 1, 000 ponta da pipeta µ l, aponte primeiro em para uma extremidade e apor a pipeta de vidro nele. Adicione um filtro de seringa para a outra extremidade, com um anexo 1 cc seringa barril, sem atuador, para atuar como um pedaço da boca.
   2. Retirar pratos da incubadora e usando um padrão de grade, examinam cada parte do prato para embriões. Os embriões são escolhidos acima individualmente e coloque sobre a gota de BCM em um prato secundário.
   3. Após a coleta de todos os pratos, lavar os embriões mais uma vez em uma gota de BCM fresco e coloque no prato bem 4 para aguardar a injeção.

4. o embrião injeção

1. Pegar as células ES individualmente com a agulha de injeção com base na confirmação.
   1. Preparar um prato de injeção pela adição de 5-7 mL de mídia de injeção (DMEM, 10% FBS e 20 mM HEPES) para um prato de injeção de fundo de vidro. As injeções são feitas à temperatura ambiente.
   2. Usando microinjector um ar ou óleo, aplica vácuo para a agulha de injeção para desenhar células ES no. Tome cuidado para manter-se como pouco espaço quanto possível entre as células. Conte as células ES aqui, ou na etapa de injeção.
   3. Selecione as células ES que são de médio a pequeno no tamanho em comparação com a população em geral de células, com uma superfície lisa e sem defeitos óbvios, tais como vacúolos.
      Nota: As populações de células ES variam grandemente em qualidade morfológica, e os padrões usados precisará ajustar com eles.
2. Injete embriões com aproximadamente 15 células ES (Figura 1).
   1. Anexar uma pipeta de exploração dica para uma segunda microinjector de ar e posicionar um embrião perto da abertura do titular. Aplica vácuo para fixar o embrião para o titular.
   2. Ajuste para o eixo z movendo a pipeta de exploração cima ou para baixo para que o embrião é apenas tocar o slide, seguido por bem, focando a zona. Em seguida, ajuste o eixo Z da agulha de injeção para que as células ES perto da ponta estão em foco.
   3. Ajuste o embrião agora empurrando suavemente desde a agulha de injeção na parte superior ou inferior, girando-o para colocar o ICM na posição desejada.
   4. Insira a agulha de injeção através da zona e o ICM ou o trofoblasto, usando uma pressão firme, mas controlada. Exercendo uma ligeira pressão para o microinjector da agulha de injeção para ajudar a manter o blastocoel de entrar em colapso.
   5. Uma vez que a agulha penetrou o blastocoel, aplica pressão do microinjector para transferir células ES para o blastocoel do embrião. Pausar brevemente como o bisel da agulha começa a sair o embrião para permitir que a pressão no embrião para voltar ao normal, mantendo ainda as células.
      Nota: Referência a células ES grupo foram injetada normalmente, seguindo um tradicional ES celular injeção protocolo⁹, tomando cuidado para não tocar o ICM. Pilhas do ES também foram injetadas através do ICM, empurrando a agulha diretamente através do ICM (TICM) (Figura 2filme suplementar).

5. transferência de eEmbryos

1. Transferência de embriões de camundongos Swiss Webster em E2.5, usando um dispositivo de transferência de embriões não-cirúrgico, por procedimentos de fabricação. Este procedimento não-cirúrgico requer sem anestesia ou cuidado especial no pós-operatório. Ratos de casa individualmente após a transferência de embriões e pela entrega e desmame subsequentes.

Resultados

Tratamento de linha celular como o efeito aleatório, um modelo linear de efeitos mistos foi usado para analisar os dados no software (por exemplo, SAS (versão 9.2)). Cada análise controlada para o número de embriões transferidos e a linha celular. A segunda análise também controlada para o número de filhotes que sobreviveram.

Para este estudo, cada linha celular do ES e o clone foi injetado em ambos com tradicionais e t?...

Discussão

Isso tem sido pensado que qualquer perturbação do ICM pode levar à mortalidade, na verdade, protocolos atuais de microinjeção de blastocisto ainda alertam para este^12,13. O que mostramos aqui é que microinjeção através do ICM não é prejudicial para o embrião e aumenta o rendimento de quimeras.

O mecanismo exato para este efeito não foi identificado. No entanto, a ruptura mecânica do ICM, e o hipoblasto que acompanha, deve...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ES Cell injection needle	Humagen	MSC-20-0
NSET device	Paratechs	60010
DMEM	Gibco (life technologies)	11965-092
FBS	Gibco (life technologies)	10439-024	lots should be individually tested for ES Cell compatibility.
HEPES	Sigma	H0887
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Micro manipulator	Leica	Micro manipulator
micro injector	Eppendorf AG	Cell Tram Air 5176
Microscope	Leica	DM IRB
4 well dish	Thermo Scientific	176740
60 mm dish	Sarstedt	83.3901
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J	Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA	000058
Swiss Webster mice	Taconic, USA	Tac:SW
Injection Dish	MatTek Corp.	P50G-0-30-F