트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

요약

여기 우리는 새로운 장비를 사용 하지 않고 키메라 생산을 증가 하는 프로토콜을 제시. 주입에 대 한 배아의 단순한 방향 변경 생산, 배아의 수를 증가 하 고 잠재적으로 생식 전송 타임을 줄일 수 있습니다.

초록

ES 셀 방법론을 통해 유전자 변형된 생쥐의 창조에 효율성을 증가 하는 노력에서 선물이 현재 blastocyst 주입 프로토콜을 적응. 여기 우리 보고 배아, 그리고 트랜스 안 세포 질량 (TICM)를 통해 주입의 간단한 회전 50%, 추가 장비에 31%에서 공상 쥐의 비율을 증가 또는 추가 훈련을 전문. 26 다른 근 친 클론, 그리고 9 개월의 기간 동안 35 총 클론 주입 했다. 전통적인 주입 기술 및 TICM 사이 임신 속도 또는 배아의 회복 속도에 상당한 차이가 있었습니다. 따라서 주입 프로세스와는 blastocyst의 간단한 위치는 ICM을 통해 주입에 모든 주요 변경 없이 blastocoel 구멍에 ES 세포 방출 잠재적으로 향상 시킬 수 있습니다 공상 생산 이후 수량 생식 전송입니다.

서문

거의 25 년 동안, 유전자 표적으로 쥐의 창조 자주 키메라를 전송 하는 생식의 세대를 위한 blastocysts ES 세포 microinjection 단계에서 병목 현상에 의해 방해, 느린 과정 되었습니다. CRISPR/Cas9^1,2 ES 세포 및 높은 처리량 ES에 타겟팅을 포함 한 최근 전진 호 같은 세대 컨소시엄 세포, 유전자 변형된 ES 세포의 생성/가용성 향상. 그러나, 생식 키메라의 생성이 ES 세포^3,4에서 유전자 변형된 쥐를 만들기에 병목을 남아 있다. 높은 처리량 ES 세포 생성 프로젝트 생식 키메라의 성공적인 창조에 대 한 중요 한 ES 세포 품질 높은 가변성에 의해 괴 롭 혀 왔다. 또한, 일반적으로 이용한 ES 세포 선의 일부 높은 이수성, 및 생식 유능한 키메라⁵의 어려운 생산 알려져 있다.

어느 높은 키메라와 쥐를 만들기 위한 많은 방법은 개발 되었다 또는 완전히 ES 세포 파생 마우스^6,7,8,,910. 이러한 시스템의 각 그것의 자신의 공로 있다, 그러나 그들은 또한 그들의 결점 있다. Tetraploid chimeras, 마우스, 파생 된 100 %ES 세포를 생성 하는 동안 생성, 비효율적 이며 outbred 라인 ^5,6에 일반적으로 제한 된. Morula 주입의 새로운 방법 높은 백분율 chimeras, 100%에 접근을 얻을 수 있지만 일반적으로 상당한 추가 장비 (레이저 또는 piezos) 및 훈련^10,11필요로 합니다. 이러한 기술은 이미 자리에는 실험실,이 새로운 방법론 필요 없을 수 있습니다.

이 연구의이 목적은 키메라 세대, 이후 마우스 식민지를 설치 하는 돌연변이 체 대립 유전자의 생식 전송의 기회를 증가의 속도 높이기 위해 일반적인 기술과 쉽게 사용할 수 있는 장비를 사용 하는 메서드를 찾아야 했다.

프로토콜

모든 작업은 마우스 코어의 NIEHS 노크 밖으로 인해 시설 정상 작동의 일환으로 수행 되었다. 모든 마우스는 12시 12분에 유지 했다 h 빛: 다크 사이클, NIH-31와 물 다이어트를 공급 했다 ad libitum. 모든 실험 동물 관리 및 사용 위원회는 국립 연구소의 환경 건강 과학의 수행 했다.

1. 동물 준비

1. 기증자 쥐, b 6 번 식 (Cg)-Tyr < c-2J > b 6 자연스럽 게 나이의 8-10 주에 /J 여성 쥐 (Cg)-Tyr < c-2J > /J 남성 쥐 나이의 8과 26 주 사이. 시각적으로 플러그 다음 아침 (E0.5)을 확인 합니다.
2. 받는 사람 마우스, 스위스 웹스터 여성 쥐 나이의 6 그리고 9 주 사이 자연스럽 게 vasectomized 스위스 웹스터 남성 쥐 사육 번 식. 시각적으로 플러그 다음 아침 (E0.5)을 확인 합니다.

2. ES 세포 준비

1. 129-derieved AB2.2 ES 세포에 대 한 문화 15 보충 DMEM 셀 %FBS, 1% 글루타민, 1% 펜/strep, 및 0.1% β-mercaptoethanol. 그들의 권장된 프로토콜을 사용 하 여 ES 셀 공급 업체의 지시 당 다른 모든 ES 세포 문화.

3. 배아 컬렉션

1. 동물 해 부
   1. 여러 가지 60mm 요리, 약 1 5 마우스 플러스 10 mL 폭발 컬렉션 미디어 (BCM)와 3 추가 준비 (10 %FBS DMEM), 그리고 한 4 잘 잘 당 0.5 mL BCM으로 접시. 37 ° C, 5% CO₂에서 equilibrate.
   2. B 6를 안락사 (Cg)-Tyr < c-2J > 10%의 유량과 CO₂ 질를 사용 하 여 E3.5에 /J 여성 쥐.
   3. Euthanizing, 후 부정사 위치에 쥐를 놓고 젖은 70% 에탄올으로 깨끗이 복 부.
   4. 가능한 넓은 개방을 만드는 복 부의 중앙에만, 피부를 통해 첫 번째 절 개를 확인 합니다. 다음 다시 가능한 광범위 한 절 개를 만드는 복 벽을 통해 열.
      참고:이 두 단계에 일을 줄이거나 모피 오염 제거에 도움이 됩니다.
   5. 난소에서 시작 하 고 무딘 집게와 난소의 지방 패드를 들고 조심 스럽게 난소, 수 란 관, 및 지방 조직을 최소로 유지 하 여분 배려를 복용 하는 자 궁을 제거. 하나의 단일 단위로 또는 다음 절차에서 변경 되지 않고 개별 뿔으로 자 궁을 제거 합니다.
   6. 제거 후 자 궁 폭발 컬렉션 미디어를 포함 하는 60 m m 접시에 놓습니다.
2. 배아 제거
   1. BCM, 가득 10 mL 주사기를 준비 하 고 25g 바늘으로 적합.
   2. 한 번에 한 자 궁 BCM의 지주 접시에서 그들을 제거, 과잉 혈액을 제거 하 고 해 부 현미경 저 배율에서 60 mm 접시에 배치 하는 조직에서 그들을 얼룩.
   3. 신중 하 고 부드럽게 집게 해 부와 (수 란 관) 근처 선단부 바로 아래 자 궁을 잡고, 병렬 가능한 비행기로에 자 궁의 중앙에 바늘을 삽입 합니다. 그냥 넘어는 집게의 끝에 바늘을 삽입 합니다.
   4. 바늘, 자 궁을 겸 자에 압력을 적용 하 고 약 1 mL의 자 궁 경적을 통해 BCM의 추방.
      참고: 합니다 주의이 단계에서 주사기에 너무 많은 압력, 미디어의 통제 스트림 하면로 자주 요리를 떠나.
   5. 60 mm 접시 당 최대 5 전체 uteri 자 궁 홍 후 컬렉션까지 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
3. 배아 컬렉션
   1. 손으로 그린된 유리 피 펫 및 입 피 펫 장치 using, blastocysts 25 X 35 X 사이의 설정 해 범위에서 수집 합니다. (그림 1)입니다.
      참고: 유연한 튜브의 30-40 cm의 입 피 펫 장치 구성, 5mm 미만 아이디 삽입 1, 000 µ L 피 펫 팁, 처음에 한쪽 끝을 가리키고 접사에 유리 피 펫. 연결 1 cc 주사기 배럴, 아니 플런저, 입 조각으로, 다른 끝에 주사기 필터를 추가 합니다.
   2. 인큐베이터에서 요리를 제거 하 고 격자 패턴을 사용 하 여 태아에 대 한 접시의 모든 부분을 검사 합니다. 배아 선택은 개별적으로 하 고 보조 접시에서 BCM의 드롭에.
   3. 모든 요리에서 수집 후 신선한 BCM, 한 방울에 배아를 한 번 더 세척 하 고 주입을 기다리고 4 잘 접시에 놓습니다.

4. 태아 주입

1. 확인에 따라 주사 바늘으로 개별적으로 ES 세포를 선택 합니다.
   1. 5-7 mL 주입 미디어를 추가 하 여 주입 접시를 준비 (DMEM, 10 %FBS 및 20 mM HEPES) 유리 하단 주입 접시. 주사는 상 온에서 수행 됩니다.
   2. 공기 또는 기름 microinjector를 사용 하 여 ES 세포를 주사 바늘을 진공을 적용 됩니다. 셀 사이의 가능한 작은 공간으로 유지 하는 것을 주의. 여기, 또는 사출 단계에서 ES 세포를 계산.
   3. ES 셀을 셀, 매끄러운 표면, 그리고 명백한 결함이 그들 등의 일반 인구에 비해 크기가 작은 매체를 선택 합니다.
      참고: ES 세포 인구 형태학 품질에 크게 변화 하 고 사용 되는 표준 그들과 함께 조정 해야 합니다.
2. 약 15 ES 세포 (그림 1)와 배아를 주사.
   1. 연결 지주 피 펫 팁 두 번째 공기 microinjector를 및 소유자의 오프닝 근처 태아 위치. 소유자에 게 태아를 보호 하는 진공을 적용 합니다.
   2. 태아는 구역에 잘 집중 하 여 다음 슬라이드를 만지고 그냥은 그래야 지주 피펫으로 위나 아래로 이동 하 여 z 축에 대 한 조정. ES 세포 끝 근처 초점이 되도록 다음, 주사 바늘의 Z 축을 조정 합니다.
   3. 부드럽게 주사 바늘 위쪽 이나 아래쪽으로 원하는 위치에 ICM을 넣어 회전에서 추진 하 여 지금 배아를 조정 합니다.
   4. 구역, 그리고 ICM 또는 확고 하지만 제어 푸시를 사용 하 여 trophoblast 통해 주사 바늘을 삽입 합니다. 붕괴에서 blastocoel를 유지 하기 위해 주사 바늘의 microinjector에 약간의 압력을 적용 됩니다.
   5. 바늘은 blastocoel를 침투 하 고, 일단 태아의 blastocoel ES 세포를 전송 하는 microinjector에서 압력을 적용. 바늘의 경사로 잠시 일시 중지 셀 유지 하면서 정상으로 돌아갑니다 배아에 압력을 허용 하는 배아를 종료 하기 시작 합니다.
      참고: 참조 그룹 ES 세포는 일반적으로 주입 했다, 전통에 따라 세포 주입 프로토콜⁹, ICM을 터치 하지 않도록 주의 복용. ES 세포 또한 ICM, 직접 통해는 ICM (TICM) (그림 2보충 영화) 바늘을 밀어를 통해 주입 했다.

5입니다. eEmbryos의 전송

1. 제조의 절차 당 비 외과 배아 전송 장치를 사용 하 여 E2.5에서 스위스 웹스터 마우스 배아를 전송 합니다. 이 아닌-수술 마 취 또는 수술에 특별 한 주의 요구 한다. 집 쥐의 배아, 그리고 배달 및 후속 이유를 통해 전송 후 개별적으로.

결과

임의 효과로 셀-선 치료, 혼합된 효과 선형 모델 소프트웨어 (예: SAS (버전 9.2))에서 데이터를 분석 하 사용 되었다. 각 분석 배아 전송 및 셀 라인의 수에 대 한 제어. 두 번째 분석 또한 살아남은 새끼의 수에 대 한 제어.

이 연구를 위해 각 ES 세포 선 및 복제 주입 했다 전통 둘 다 및 TICM 기법, 각 배아 후 두 가지 방법 사이의 교?...

토론

그것은 오래는 ICM의 어떤 소란 이어질 수 사망, 사실, 현재 blastocyst microinjection 프로토콜 여전히이^12,13의 경고 생각 되었습니다. 그것은 우리가 여기에 표시는 ICM 통해 microinjection는 태아에 게 해로운 고 키메라의 수확량을 증가.

이 효과 대 한 정확한 메커니즘 확인 하지 했다. 그러나, ICM와 함께 hypoblast의 기계적 장애 ES 세포 통합 mic...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ES Cell injection needle	Humagen	MSC-20-0
NSET device	Paratechs	60010
DMEM	Gibco (life technologies)	11965-092
FBS	Gibco (life technologies)	10439-024	lots should be individually tested for ES Cell compatibility.
HEPES	Sigma	H0887
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Micro manipulator	Leica	Micro manipulator
micro injector	Eppendorf AG	Cell Tram Air 5176
Microscope	Leica	DM IRB
4 well dish	Thermo Scientific	176740
60 mm dish	Sarstedt	83.3901
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J	Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA	000058
Swiss Webster mice	Taconic, USA	Tac:SW
Injection Dish	MatTek Corp.	P50G-0-30-F