应用高分辨率超声监测基因工程胰腺癌的肿瘤发病和生长

摘要

本文介绍了高分辨率超声在基因工程胰腺癌小鼠中的应用。其主要目的是为内源性胰腺肿瘤的检测和评价提供详细的指导。

摘要

LSL Kras^G12D/+;LSL-Trp53^R172H/+;Pdx-1-Cre (KPC) 小鼠模型代表了一种建立和常用的转基因模型来评价胰腺癌的新疗法。在8周和几个月间, 科索沃保护团模型中的肿瘤发病是可变的。因此, 非侵入性成像工具需要筛查肿瘤发病和监测反应治疗。为解决这一问题, 在过去几年中出现了各种不同的办法。高分辨率超声具有无侵袭、速度快、图像分辨率高、无辐射照射等优点。然而, 超声在小鼠是不琐碎的, 充分的解剖学知识和实际技能, 需要成功地执行高分辨率超声在前胰腺癌模型。在下面的文章中, 详细介绍了腹部超声在小鼠模型中的具体操作指南, 特别着重于内源性胰腺癌模型。此外, 还提供了常见的错误和如何避免它们的摘要。

引言

基因工程鼠模型在癌症研究中得到了越来越重要的地位, 因为它们能够密切重述人类致癌的复杂性质^1,2,3。研究胰腺癌发展、进展和治疗反应的最常用模型之一是 Kras 癌基因的活化突变和抑癌 p53⁴的灭活。此LSL Kras^G12D/+;LSL-Trp53^R172H/+;Pdx-1-Cre (KPC) 小鼠模型模拟了从前侵袭性胰腺上皮内肿瘤 (PanIN) 病变到浸润性癌的步进式进展。表型, 几乎所有的老鼠在出生后的头六月内发育 PDAC。然而, 与移植模型相比, KPC 模型揭示了一个高度可变的肿瘤发病时间从8周到几个月的⁴。一旦胰腺肿瘤达到一定的大小 (直径5-9 毫米), 肿瘤生长迅速加速, 小鼠将不得不在临床前试验中注册⁵。因此, 准确检测肿瘤发病和肿瘤大小是临床前期研究后勤和治疗监测的必要前提。一般而言, 几种方法如磁共振成像 (MRI)⁶, 计算机断层扫描^7,8,9或高分辨率超声可用于进行肿瘤筛查和治疗¹⁰。每种技术都有其优点和缺点。虽然 MRI 或计算机断层扫描 (CT) 成像允许高分辨率的数据采集和准确的体积计算, 在一般镇静下延长检查时间和非常昂贵的设备是必需的, 不允许频繁扫描了很长一段时间。相比之下, 小动物超声是一种已建立的方法, 可用于筛查小鼠的腹部病理¹¹。这种成像方法的优点是扫描时间短, 分辨率高, 并且有可能使用多普勒超声或造影增强超声 (CEUS) 来可视化器官的灌注。然而, 正确的图像解释需要解剖学知识、3D 想象力和彻底的实践训练。

本文给出了在 KPC 模型中利用高分辨率超声的详细协议。此外, 标准的超声图像被描绘和标签的器官结构, 以促进方向的调查。

研究方案

这个协议是根据动物关心指南在大学医疗中心格廷根, 德国 (33.9-42502-04-15/2056)。根据个别动物评审委员会的具体要求, 一些协议步骤可以相应地加以修改。

1. 科索沃保护团小鼠的腹部触诊

1. 为了避免不必要的超声扫描, 触及小鼠腹部, 以确定可能有腹腔病变的小鼠, 并随后接受腹部超声检查。
   1. 每周从8周开始, 在 KPC 的小鼠模型中进行腹部触诊。高分辨率超声也可以应用于移植的肿瘤模型 (例如, orthotopics) 或其他基因工程老鼠模型。
      注: 根据肿瘤的动力学和研究目标 (预防研究, 治疗干预研究), 检测非常小的肿瘤 (1-2 毫米) 是可行的, 以监测肿瘤发病前肿瘤可以触及。
2. 将鼠标放在笼栅格上, 然后用不固定手的索引和拇指轻轻地上下移动鼠标, 并触及腹部 (图 1)。
3. 如果鼠标耐受软触诊, 继续缓慢增加压力。更大的抵抗可以很容易地被发现在上腹部和下腹。有时, 硬粪可以被错误地解释为肿瘤肿块。

2. 工作空间的准备

1. 为至少三个不同的工作单元提供空间: 预扫描区域、扫描阶段和恢复笼。所需的材料在图 2中进行了描述。
2. 清洁主工作板 (例如70% 乙醇), 并在扫描前打开加热平台 (图 3)。确保在第一个鼠标转移之前达到38-40 °c 的目标温度。
3. 打开超声波机, 并为获取的数据创建一个新文件夹 (图 4)。B 模式设置用于腹部成像。另外, 确保将腹式换能器插入机器的主动端。使用传感器安装系统将传感器头固定在工作台上的顶部。
4. 在加热板或热垫上准备一个恢复笼 (或使用加热灯), 以确保扫描后的小鼠的程序体温和快速恢复。在这个笼子的底部放一层薄的纸巾作为垫子, 以避免床上有窒息的可能 (图 5)。

3. 吸入麻醉

1. 将鼠标放入感应腔内进行操作。打开气体载波流阀 (1 升/分氧或空气), 并将异氟醚浓度设置为 4%, 使感应腔的饱和度逐渐增加。请确保适当的异氟醚清除 (被动或主动过滤) 到位。大约2-4 分钟后, 老鼠通常会在深镇静下。
   1. 在工作台上通过鼻锥管理2% 异氟醚, 保持镇静。
2. 小心地将动物从感应室转移到工作台上。检查鼻锥是否有恒定的气流。把鼠标的鼻子放在麻醉线出口的鼻锥上。初始扫描的常规位置为仰卧位。鼠标也可以放置在其右侧或左侧, 以提高胰头或尾部肿瘤的可见性 (图 6)。
3. 虽然腹部超声不是痛苦的本身, 执行脚捏测试作为一个指标的疼痛自由状态和深层麻醉状态. 如果老鼠仍然活跃或活跃地移动, 转让动物回到诱导室为反复和延长的诱导。
4. 使用眼部保护软膏, 防止因液体流失引起的角膜损伤。
5. 在麻醉过程中, 使用监控系统。然而, 心电图和直肠温度不定期用于腹部超声扫描。重要的是, 老鼠失去了在麻醉下 thermoregulate 的能力。因此, 密切观察临床症状的体温过低或呼吸窘迫, 如喘息或窒息。如果任何症状明显停止异氟醚, 并立即将鼠标放在恢复笼中。

4. 超声波设置

1. 根据制造商的说明, 打开超声波系统。确保将主要设置放在常规成像与腹部包裹激活。通常, B 模式成像被用作数据获取的标准。
2. 通过以下参数实现优化的图像质量: 频率40兆赫, 2 d 增益 25-30 dB, 图像深度10毫米, 图像宽度10毫米, 3 焦带中心在3-6 毫米之间。

5. 鼠标准备

1. 用胶带固定上、下下肢。尽可能小心, 以避免对动物的任何伤害, 由于固定 (图 7)。
2. 使用电子宠物剪刀去除所有腹部毛皮。由于毛皮质地, 从下腹部开始到胸腔。在突 xiphoideus中保重, 以避免此区域的皮肤损伤。
   注: 鼠标皮毛反射超声波, 降低能见度。
3. 使用脱毛霜进行优化的皮肤准备和彻底去除毛皮。使用棉花尖 (图 8) 在剃掉的腹部上涂一层薄薄的奶油。除去奶油 (三十年代以后或以后取决于使用的奶油) 与干燥组织然后充足的水完全地去除所有残余 (图 9,图 10,图 11)。奶油残余可能导致皮肤和粘膜刺激后, 超声, 并可能因此影响健康。
4. 为了确保充分的扫描条件, 应用大量的超声波凝胶到腹部 (图 12)。通常, 使用温热超声凝胶, 以最大限度地减少对小鼠的体温过低。
5. 在传感器头上手动应用一层薄薄的超声波凝胶。通过触摸传感器端的凹槽来执行测试。在屏幕上, 如果传感器正确定位, 则可以看到左上侧的信号。

6. 腹部超声

1. 使用牢固的压力将传感器调整到腹部。大鼠腹部的压迫可能导致呼吸或循环损伤, 应该避免。
2. 向上和向下扫描。调整工作平台的框架和 x 轴和 y 轴的车轮。
3. 作为第一步确定两个肾脏。通常他们在下腹部出现作为 hyperechogenic 均匀结构。连接的腔 renalis可以很容易地找到, 进一步导致腔静脉下 (图 13)。
4. 使用腔 lienalis作为胰腺的标志性容器。尝试区分腔 renalis和腔 lienalis。在检测到腔 lienalis时, 胰腺可以完全定位。正常的胰腺, 而不是一个坚实的结构 (图 14 和图 15) 通过腹腔传播的膜。

7. 胰腺肿瘤的检测和容积评估

1. 识别所有周围结构的胰腺病变。它们通常显示为回声非均匀圆形或拉长的组织肿块 (图 16)。肿瘤通常是牢固的, 并且不可能由扫描头压缩。注意, 不时地区分肿瘤和小肠循环可能是很棘手的。注意在胰腺肿瘤中不应观察到的肠道蠕动。
2. 在肿瘤检测屏幕上向上和向下, 以获得总大小的印象和测量最大直径使用超声波钳。一旦找到合适的图像, 冻结屏幕, 并使用测量工具来精确确定肿瘤的大小。注意, 为以后使用它将是重要的区分肿瘤是否在胰腺的尾巴、身体或头被定位。
3. 在更改回实时模式之前, 请确保保存图片以记录工作。注意, 在冻结图像时, 可能会发生调整轮被释放, 而超声波探头甚至更压在鼠标腹部。因此, 在将模式更改为冻结之前, 请修复压缩的调整。
4. 完成第一个平面的测量后, 可以在纵向位置 (图 17) 旋转扫描头, 或者将鼠标转到其侧面, 以检测肿瘤的纵向扩张。有些肿瘤可能需要改变鼠标的位置以获得足够的能见度。对于胰尾肿瘤, 鼠标可以放在右侧 (图 10 和图 19), 用于左侧的胰头肿瘤 (图 11 和图 20)。

8. 肿瘤体积的量化

注意: 所有努力的一个主要目的是正确确定肿瘤体积。虽然有几个技术可利用一个演算方法包括椭球的惯例在大学医疗中心格廷根是优选的。

1. 配备所有三以前获得的直径, 计算相应肿瘤的近似体积 (图 21)。
2. 或者, 使用扫描头的马达系统对肿瘤区域进行自动扫描, 随后进行体积计算和3维重建。

9. 恢复

1. 扫描后, 小心取出所有胶带, 并仔细删除所有超声凝胶与干燥组织。
2. 小心地将鼠标转移到恢复笼中 (图 21)。避免 mouse´s 脸上的任何覆盖组织, 可能会导致呼吸障碍。应首选恢复的侧面位置。

结果

超声成像是一种多功能和非侵入性的技术, 用于解决小鼠模型的人类疾病的几个问题。与所有其他成像方法相比, 主要优点是高通量、成本效率高、采集时间短和实时成像。但是, 此工具需要专门知识才能生成准确、高质量的图像。特别是在不需要的文物的情况下, 至少有一些经验, 超声成像一般是非常有用的。关于胰腺癌, 这个工具允许确定肿瘤的发病、进展和对治疗的反?...

讨论

通过该协议, 给出了在基因工程小鼠模型中应用高分辨率腹部超声显像对胰腺肿瘤进行量化的详细描述。最近, Sastra et . 发表了一个详细的描述如何量化的胰腺肿瘤的小鼠模型, 但没有可视化的指示, 关于准备和处理作为先决条件的所有进一步步骤显示¹¹。本手稿的总体目标是为小鼠的高分辨率超声提供一个全面的视觉指导。

虽然我们对基因工程小鼠内?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Visual Sonics Vevo2100 High Resolution Ultrasound System, including imaging stage and anesthesia line	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11945
Vevo 2100 MicroScan Transducer MS-550-D (22-55MHz)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11874
Vevo Anesthesia System (anesthesia induction chamber with fresh and waste gas inlet)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-12055
Vevo Imaging Station (working stage with nose cone for anesthesia supply)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-11982
electronic pet clippers	Panasonic Marketing Europe, Germany	5025232484324	Panasonic ER-PA10-s
Labotect Hot plate	Labor tech Göttingen, Germany	13854
eye cream (ophthalmic ointment)	Schülke&Mayr, Germany	9080249
veterinary isoflurane	Abbvie, Germany	4831867
depilatory cream	RB healthcare UK, United Kingdom	8218535
70% ethanol (v/v) in distilled water	TH. Geyer, Germany	22941000
ultrasound gel	Asmuth, Germany	13477
tissue wipes	Kimberly-Clark Germany, Germany	7558
cotton tips	Meditrade, Germany	75481116
glass bowl for ultrasound gel	ARC France, France	H1149
water bowl	W & P Trading Co., USA	B00K2P6PLQ
gauze sponges	Fuhrmann, Germany	960504