Verwendung von hochauflösendem Ultraschall zu Monitor Tumor auftreten und Wachstum in gentechnisch Bauchspeicheldrüsenkrebs Modelle

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von hochauflösenden Ultraschall bei Mäusen gentechnisch Bauchspeicheldrüsenkrebs. Das primäre Ziel ist, eine detaillierte Anleitung zur Erkennung und Bewertung der endogenen Tumoren der Bauchspeicheldrüse zu bieten.

Zusammenfassung

LSL-Kras^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; PDX-1-Cre (KPC) Maus-Modell stellt eine etablierte und am häufigsten verwendeten transgenen Modell, neuartige Therapien bei Bauchspeicheldrüsenkrebs zu bewerten. Tumor-Beginn ist variabel in der KPC-Modell zwischen 8 Wochen und mehreren Monaten. Nicht-invasive imaging-Tools sind daher verpflichtet, Bildschirm für Tumor auftreten und Monitor für ansprechen auf die Behandlung. Um dieses Problem zu beheben, sind verschiedene Ansätze in den letzten Jahren entstanden. Hochauflösendem Ultraschall hat entscheidende Vorteile wie nicht-Invasivität, schnelle Sitzungszeiten und einer hohen Bildauflösung ohne Strahlenbelastung. Jedoch Ultraschall bei Mäusen ist nicht trivial und ausreichend anatomische Kenntnisse und praktische Fähigkeiten sind erforderlich, um erfolgreich hochauflösendem Ultraschall in präklinischen Bauchspeicheldrüsenkrebs Modellen durchführen. Mit der folgende Artikel ist eine detaillierte praktische Anleitung für Bauch-Ultraschall in murinen Modellen mit besonderem Schwerpunkt auf endogene Bauchspeicheldrüsenkrebs Modelle vorgestellt. Darüber hinaus erfolgt eine Zusammenfassung der häufigsten Fehler und wie man sie vermeidet.

Einleitung

Gentechnisch veränderte Mausmodelle gewannen zunehmende an Bedeutung in der Krebsforschung aufgrund ihrer Fähigkeit, die komplexe Natur des menschlichen Karzinogenese^1,2,3eng zu rekapitulieren. Eines der wichtigsten häufig Modelle verwendet, um Bauchspeicheldrüsenkrebs Entwicklung zu studieren, Progression und therapeutische Reaktion zeichnet sich durch eine aktivierende Mutation in der Kras-Onkogen, kombiniert mit einer Inaktivierung von Tumorsuppressor p53⁴. Diese LSL-Kras^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; PDX-1-Cre (KPC) Maus-Modell ahmt die schrittweise Weiterentwicklung von Pre-invasive Pankreas intraepitheliale Neoplasie (PanIN) Läsionen zu invasives Karzinom. Phänotypisch, entwickeln fast alle Mäuse PDAC innerhalb der ersten sechs Monate nach der Geburt. Ergibt sich jedoch im Vergleich zu transplantierten Modelle, die KPC-Modell einen sehr variabel Tumor Beginn ab 8 Wochen bis mehreren Monaten⁴. Sobald Pankreastumoren erreichen eine bestimmten Größe (5 – 9 mm Durchmesser), Tumorwachstum beschleunigt rasant und Mäuse müssen in präklinischen Studien⁵eingeschrieben sein. Daher ist die genaue Erfassung der Tumor-Entstehung und Größe des Tumors eine wesentliche Voraussetzung für die präklinische Studie Logistik und Therapieüberwachung. In der Regel mehrere Ansätze wie Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)⁶, Scannen,^7,8,9 oder hochauflösendem Ultraschall Computertomographie kann eingesetzt werden, um Tumor Screening durchzuführen und Therapie¹⁰. Jede Technik hat ihre vor- und Nachteile. Obwohl MRT- oder Computertomographie (CT)-Bildgebung ermöglicht hochauflösende Datenerfassung sowie exakte Volumenberechnung, längere Untersuchungszeit unter allgemeinen Beruhigung, und sehr teure Ausrüstung erforderlich ist, und erlaubt keine häufigen Scannen über einen langen Zeitraum hinweg. Kleine tierische Sonographie ist dagegen eine etablierte Methode, die eingesetzt werden kann, für abdominale Pathologien in Mäusen¹¹auf den Bildschirm. Vorteile dieses bildgebenden Verfahrens sind kurze Scanzeiten, hohe Auflösung und die Möglichkeit, doppler-Ultraschall oder den Kontrast verbessert Ultraschall (CEUS), Durchblutung der Organe parallel zu visualisieren. Allerdings sind anatomische Kenntnisse, 3D Phantasie und gründliche praktische Ausbildung für korrekte Bildinterpretation erforderlich.

In dem folgenden Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Nutzung von hochauflösendem Ultraschall in der KPC-Modell zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus sind standard Ultraschallbilder dargestellt und beschriftet mit organstrukturen zur Erleichterung der Orientierung für die Ermittler.

Protokoll

Dieses Protokoll ist gemäß den Richtlinien der Pflege der Tiere an der Universität medizinische Zentrum Göttingen, Deutschland (33,9-42502-04-15/2056). Je nach spezifischen Anforderungen des einzelnen Tieres überprüfen Bretter, einige der Schritte Protokoll könnte entsprechend angepasst werden.

1. abdominale Palpation der KPC Mäuse

1. Zur Vermeidung von unnötigen Ultraschalluntersuchungen palpieren des Maus Bauches um Mäuse zu identifizieren, die könnten möglicherweise eine intraabdominellen Läsion tragen und sollten anschließend Bauch-Ultraschall unterziehen.
   1. Durchführen Sie abdominale Palpation wöchentlich ab 8 Wochen alt in der KPC-Maus-Modell. Hochauflösendem Ultraschall kann auch in transplantierten Tumormodellen (z.B. Orthotopics) oder andere gentechnisch veränderter Mausmodelle angewendet werden.
      Hinweis: Je nach Tumor Kinetik und Studie Ziel (Prävention Studie, therapeutische Intervention Study) Machbaren Erkennung von sehr kleinen Tumoren (1-2 mm) bis zum Monitor Tumor auftreten vor Tumoren getastet werden können.
2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Käfig Gitter und heben Sie die Maus am Schwanz und ertasten Sie den Bauch, indem Sie sanft nach oben und unten mit Index und Daumen die Nichtfestsetzung Hand (Abbildung 1).
3. Wenn die Maus weichen Palpation toleriert, fortfahren Sie, indem Sie langsam den Druck zu erhöhen. Ein größeren Widerstand kann leicht in die oberen und unteren Bauch erkannt werden. Manchmal harter Kot können fälschlicherweise als ein Tumor interpretiert werden Masse.

2. Vorbereitung des Arbeitsbereichs

1. Bieten Platz für mindestens drei verschiedenen Arbeitseinheiten: Pre-Scan-Bereich, Bühne und Erholung Käfig scannen. Benötigte Material sind in Abbildung 2dargestellt.
2. Die wichtigsten Arbeitsplatte reinigen (z.B. mit 70 % Ethanol) und schalten Sie die Heizung-Plattform vor dem Scannen (Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass die soll-Temperatur von 38-40 ° C erreicht wird, bevor die erste Maus übertragen wird.
3. Das Ultraschallgerät schalten Sie ein und erstellen Sie einen neuen Ordner für die erfassten Daten (Abbildung 4). Die B-Modus-Einstellung ist für die abdominale Bildgebung angewendet. Darüber hinaus sicherstellen Sie, dass die Bauch Wandler in der aktiven Port des Computers angeschlossen ist. Beheben Sie die Wandler-Kopf am oberen Rand der Arbeitsschritt mithilfe der Wandlers Montagesystem.
4. Bereiten Sie einen Recovery-Käfig auf einer Heizplatte oder Thermo Mat (oder Verwendung Wärmelampe), Post-prozedurale Thermoregulation und baldige Genesung von gescannten Mäusen zu gewährleisten. Legen Sie eine dünne Schicht des Gewebes als Kissen an der Unterseite von diesem Käfig, Aspiration von Bettwäsche mit Erstickungsgefahr (Abbildung 5) zu vermeiden.

3. Einatmen Anästhesie

1. Fahren Sie fort, indem man eine Maus in der Induktion-Kammer. Öffnen Sie das Ventil für Träger Gasfluss (1 L/min Sauerstoff oder Luft) und Isofluran Konzentration auf 4 %, so dass eine langsam zunehmende Sättigung der Induktion Kammer. Stellen Sie sicher, dass richtige Isofluran Aufräumvorgang (passive oder aktive Filterung) vorhanden ist. Nach ca. 2-4 min werden die Maus in der Regel tiefer Sedierung.
   1. Sedierung durch die Gabe von 2 % Isofluran durch die bugnase auf der Bühne arbeiten zu erhalten.
2. Übertragen Sie sorgfältig das Tier aus der Induktion Kammer in den funktionsfähigen Zustand. Überprüfen Sie die bugnase für einen konstanten Gasfluss. Setzen Sie die Maus Schnauze in die bugnase des Anästhesie-Linie Outlets. Die reguläre Position für den ersten Scan ist die Rückenlage. Die Maus kann auch auf die Rechte oder linke Seite zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Pankreaskopf oder Schweif Tumoren (Abbildung 6) platziert werden.
3. Bauch-Ultraschall ist, zwar nicht schmerzhaft schlechthinführen Sie den Fuß Prise Test als Indikator für ein Schmerz frei Allgemeinbefinden und Tiefe Narkose. Wenn die Maus ist immer noch aktiv oder aktiv bewegen, Rückübertragung das Tier zurück in die Induktion Kammer für wiederholte und lang anhaltenden Induktion.
4. Verwenden Sie Schutz Augensalbe, um Hornhaut Verletzungen durch Flüssigkeitsverlust zu verhindern.
5. Während der Narkose verwenden Sie ein monitoring-System. EKG und rektale Temperatur wird jedoch nicht regelmäßig verwendet für das Scannen von Bauch-Ultraschall. Vor allem verlieren Mäuse die Fähigkeit, unter Narkose thermoregulate. Daher, genau zu beobachten, klinische Anzeichen für Unterkühlung oder Atemnot wie Keuchen oder Apnoe. Wenn jedes Symptom offensichtlich Stop Isoflurane und statt der Maus in den Recovery-Käfig sofort.

4. Ultraschall-Einstellungen

1. Schalten Sie das Ultraschallsystem, wie von des Herstellers beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die primäre Einstellung auf allgemeine Bildgebung mit dem Bauch Paket aktiviert ist. In der Regel wird B-Modus-Bildgebung für die Datenerfassung als Standard verwendet.
2. Erzielen Sie optimale Bildqualität mit folgenden Parametern: Frequenz 40 MHz, 2D-Gewinn 25-30 dB, Bild Tiefe 10 mm, Breite 10 mm, 3 fokale Zonen mit Zentrum zwischen 3-6 mm.

(5) Maus-Vorbereitung

1. Fixieren Sie die obere und Untere Extremität mit Klebeband. Werden Sie so vorsichtig wie möglich, Verletzungsgefahr für das Tier durch Fixierung (Abbildung 7).
2. Entfernen Sie alle Bauch-Fell mit elektronischen Haustier Clippers. Aufgrund der Fell-Textur starten von der unteren Bauch bis zu den Brustkorb. Achten Sie darauf bei der Processus Xiphoideus , Verletzungen der Haut in diesem Bereich zu vermeiden.
   Hinweis: Maus Fell reflektiert Ultraschallwellen und Sichtbarkeit verringert.
3. Verwenden Sie Enthaarungscreme, um eine optimierte Haut Vorbereitung und vollständige Entfernung des Pelzes durchzuführen. Verwalten Sie eine dünne Schicht Creme auf den rasierten Bauch mit Wattestäbchen (Abbildung 8). Entfernen Sie die Creme (nach 30 s oder später abhängig von der Creme verwendet) mit trockenem Gewebe, gefolgt von viel Wasser, alle Reste (Bild 9, Bild 10, Bild 11) vollständig zu entfernen. Creme-Reste könnte dazu führen, dass Haut und Schleimhaut Reizungen nach dem Ultraschall und können somit Auswirkungen auf die Gesundheit.
4. Bedingungen gelten dafür angemessene Scannen viel Ultraschallgel auf den Bauch (Abbildung 12). Warmen Ultraschallgel dient in der Regel um Unterkühlung für die Maus zu minimieren.
5. Manuell wenden Sie eine dünne Schicht von Ultraschallgel auf den Schallkopf Kopf an. Führen Sie einen Test durch Berührung am Ende Wandler mit der Kerbe. Am Bildschirm kann ein Signal auf der linken oberen Seite gesehen werden, wenn die Wandler richtig positioniert ist.

(6) Bauch-Ultraschall

1. Passen Sie den Schallkopf auf dem Bauch mit festem Druck. Starke Kompression des Bauches Maus zu Atem- oder Herz-Kreislauf Beeinträchtigung führen und sollte vermieden werden.
2. Scannen Sie rauf und runter. Passen Sie den Rahmen des Arbeitsplattform und die Räder für x- und y-Achse.
3. Als ersten Schritt identifizieren Sie beider Nieren. In der Regel werden sie als Hyperechogenic homogene Strukturen in den Unterleib. Die angeschlossenen Vena Renalis finden Sie leicht das führt weiter zu der Vena Cava Inferior (Abbildung 13).
4. Verwenden Sie die Vena Lienalis dient als Wahrzeichen Gefäß für die Bauchspeicheldrüse. Versuchen Sie, die Unterscheidung zwischen Vena Renalis und Vena Lienalis. Beim Erkennen von Vena Lienalis kann die Bauchspeicheldrüse genau lokalisiert werden. Die normalen Bauchspeicheldrüse ist eher eine Membran verteilt durch die Bauchhöhle als eine feste Struktur (Abb. 14 und Abb. 15).

(7) Pankreas-Tumor-Erfassung und Bewertung der Lautstärke

1. Pankreas Läsionen von allen umgebenden Strukturen zu identifizieren. Sie erscheinen in der Regel als echoarmen inhomogene Runde oder längliche Gewebe Massen (Abbildung 16). Der Tumor ist in der Regel fest und kann kaum von der Scankopf komprimiert werden. Hinweis von Zeit zu Zeit es möglicherweise schwierig, klar zu unterscheiden zwischen Tumor und einer Dünndarm-Schleife. Achten Sie auf die Darm-Peristaltik, die nicht in Tumoren der Bauchspeicheldrüse beachtet werden sollten.
2. Bei der Tumor-Erkennung Bildschirm rauf und runter zu bekommen einen Eindruck von der Gesamtgröße und Messen Sie den größten Durchmesser mithilfe des Ultraschall-Bremssattels. Sobald ein passendes Bild gefunden wird, friert der Bildschirm und das Messwerkzeug verwenden, um genau die Größe des Tumors zu bestimmen. Beachten Sie, dass für die spätere Verwendung ist es wichtig zu unterscheiden, ob ein Tumor in der Rute, Körper oder Kopf der Bauchspeicheldrüse lokalisiert ist.
3. Stellen Sie bevor Sie zurück, um live-Modus ändern sicher, Bilder speichern, um die Arbeit aufnehmen. Beachten Sie, dass beim Einfrieren des Bildes, das es passieren könnte, dass das Einstellrad ist freigegeben, und die Ultraschallsonde wird noch mehr auf den Maus-Bauch gedrückt. Also fix die Anpassung der Kompression vor dem Ändern des Modus zu frieren.
4. Drehen Sie nach Beendigung der Messung der ersten Ebene den Scankopf um 90° in Längsrichtung Position (Abbildung 17) oder schalten Sie die Maus auf die Seite, um die Längenausdehnung der Tumoren zu erkennen. Ändern der Position der Maus für ausreichende Sichtbarkeit erfordern einiger Tumoren. Für Bauchspeicheldrüsenkrebs Schweif Tumoren kann die Maus auf der rechten Seite (Abbildung 10 und Abbildung 19), für Tumoren der Bauchspeicheldrüse Kopf auf der linken Seite (Abb. 11 und Abb. 20) platziert werden.

(8) Quantifizierung der Tumorvolumen

Hinweis: Ein wichtiges Ziel aller Bemühungen ist die korrekte Ermittlung der Tumorvolumen. Zwar gibt es verschiedene Techniken ist eine Berechnungsmethode, einschließlich der Formel eines ellipsoides bevorzugt an der University Medical Center Göttingen.

1. Ausgestattet mit allen drei zuvor erhaltenen Durchmessern, berechnen Sie das ungefähre Volumen des entsprechenden Tumors (Abbildung 21).
2. Alternativ verwenden Sie ein Motorsystem der Scankopf eine automatisierte Überprüfung der tumorregion mit nachfolgenden Volumenberechnung und 3-D-Rekonstruktion durchführen.

9. Verwertung

1. Nach dem Scannen, entfernen Sie vorsichtig alle Klebeband und entfernen Sie vorsichtig alle Ultraschallgel mit einem trockenen Tuch.
2. Übertragen Sie sorgfältig die Maus in den Recovery-Käfig ( Abbildung 21). Vermeiden Sie jede Verkleidung Gewebe an der Mouse´s Fläche, die respiratorische Beeinträchtigung verursachen könnten. Eine seitliche Position zur Wiederherstellung sollte bevorzugt werden.

Ergebnisse

Ultraschall-Bildgebung ist eine vielseitige und nicht-invasive Technik, die verwendet wird, um mehrere Probleme in murinen Modellen menschlicher Krankheiten. Im Vergleich zu allen anderen bildgebenden Ansätze Hauptvorteile sind Hochdurchsatz-, Kosten-Effizienz, kurzen Erfassungszeit und Echtzeit-Bildgebung. Dieses Tool benötigt jedoch Know-how, präzise, hochwertige Bilder zu erzeugen. Insbesondere bei unerwünschte Artefakte ist zumindest etwas Erfahrung mit Ultraschall-Bildgebung in d...

Diskussion

Mit diesem Protokoll ist eine detaillierte Beschreibung zur Quantifizierung der pankreatischer Tumoren mit hochauflösenden Bauch-Ultraschall-Bildgebung in gentechnisch veränderte Mausmodelle zur Verfügung gestellt. Vor kurzem veröffentlichte Sastra Et Al. einer detaillierten Beschreibung wie man quantifizieren Pankreastumoren in Mausmodellen, aber keine visualisierten Anweisungen über die Vorbereitung und den Umgang mit, da die Voraussetzung für alle weiteren Schritte wurden¹¹gezeig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Visual Sonics Vevo2100 High Resolution Ultrasound System, including imaging stage and anesthesia line	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11945
Vevo 2100 MicroScan Transducer MS-550-D (22-55MHz)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11874
Vevo Anesthesia System (anesthesia induction chamber with fresh and waste gas inlet)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-12055
Vevo Imaging Station (working stage with nose cone for anesthesia supply)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-11982
electronic pet clippers	Panasonic Marketing Europe, Germany	5025232484324	Panasonic ER-PA10-s
Labotect Hot plate	Labor tech Göttingen, Germany	13854
eye cream (ophthalmic ointment)	Schülke&Mayr, Germany	9080249
veterinary isoflurane	Abbvie, Germany	4831867
depilatory cream	RB healthcare UK, United Kingdom	8218535
70% ethanol (v/v) in distilled water	TH. Geyer, Germany	22941000
ultrasound gel	Asmuth, Germany	13477
tissue wipes	Kimberly-Clark Germany, Germany	7558
cotton tips	Meditrade, Germany	75481116
glass bowl for ultrasound gel	ARC France, France	H1149
water bowl	W & P Trading Co., USA	B00K2P6PLQ
gauze sponges	Fuhrmann, Germany	960504