高解像度モニター腫瘍発症と遺伝子組み換えの膵癌モデルの成長に超音波を利用しました。

要約

この記事では、膵がんの遺伝子組み換えマウスの高分解能超音波の利用について説明します。主な目的は、内因性膵腫瘍の検出と評価の詳細な指示を提供するためにです。

要約

LSL Kras^G12D/+;LSL Trp53^R172H/+;Pdx 1 Cre (KPC) マウス モデルは膵臓癌の新規治療法を評価するための確立され、頻繁に使用されるトランスジェニック モデルを表します。腫瘍の発症は、8 週間と数ヶ月間 KPC モデルの変数です。したがって、非侵襲的イメージング ツールが腫瘍発症のスクリーンと治療に対する反応のモニターに必要です。この問題を解決するには、別のアプローチは最後の年にわたって浮上しています。高解像度超音波には、非侵襲、高速セッション時間および放射線被曝なし高画像解像度などの主要な利点があります。しかし、マウスの超音波ではない些細なと十分な解剖学的知識、臨床膵癌モデルにおける高分解能超音波を正常に実行するために必要な実践的なスキル。次の記事では、内因性の膵癌モデルの特定のフォーカスを持つマウスモデルでの腹部超音波検査の詳細な実践的なガイドが表示されます。さらに、よくある間違いとその回避方法の概要を提供します。

概要

遺伝子組み換えマウス モデルは、がん研究能力に密接にヒトの発がん^1,2,3の複雑な性質を要約するための増加する重要性を得ています。膵癌の開発を研究するモデルを頻繁に使用、ほとんどの 1 つ、進行と治療反応は腫瘍のサプレッサー p53⁴の不活化と組み合わせて Kras 遺伝子の活性化変異によって特徴付けられます。このの LSL Kras^G12D/+;LSL Trp53^R172H/+;Pdx 1 Cre (KPC) マウス モデル事前侵襲的な膵上皮内腫瘍 (パニン) 病変から浸潤癌への段階的進行を模倣しています。表現型は、ほぼすべてのマウスは出生後最初の 6 ヶ月以内 PDAC を開発します。ただし、移植モデルと比較して、KPC モデルはいくつかのヶ月⁴から 8 週間非常に可変腫瘍発症を明らかにします。膵臓の腫瘍が特定のサイズ (直径 5-9 mm) に達すれば、腫瘍の成長が急速に加速してマウスが前臨床試験⁵に登録する必要があります。したがって、腫瘍発生、腫瘍サイズの正確な検出は、ロジスティクス前臨床研究と治療の監視のための必須の前提条件です。一般に、いくつかのアプローチが好き磁気共鳴画像 (MRI)^67,8,9または高解像度超音波スキャン コンピューター断層撮影は腫瘍のスクリーニングを行うために使用できる、療法¹⁰。各テクニックは、その利点と欠点。MRI のコンピューター断層撮影 (CT) または -イメージングにより、正確な体積計算同様、一般的な鎮静下で長期にわたる試験時間の高解像度データ集録と非常に高価な機器が必要で、頻繁には許しません。長い期間にわたってスキャン。対照的に、小動物の超音波検査は、画面のマウス¹¹で腹部の病理学を用いることができる確立されたメソッドです。このイメージング法の利点は、短い時間、高解像度のスキャンとドップラー超音波またはコントラストを使用する可能性を強化 (CEUS) 超音波を用いた並列で臓器の灌流を可視化します。ただし、解剖学的知識、3 D の想像力と徹底した実践的なトレーニングは、正しいイメージの解釈の必要です。

次の記事では、KPC モデルの高分解能超音波を利用するための詳しいプロトコルが提供されます。さらに、標準的な超音波画像を描かれている、調査官の向きを容易に臓器の構造を持つラベルします。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

このプロトコルは大学医療センター ゲッティンゲン、ドイツ (33.9-42502-04-15/2056) で動物のケアのガイドラインに従ってです。個々 の動物の特定の要件に応じて板を確認し、プロトコルの手順のいくつかは適宜変更する可能性があります。

1. 腹部触診 KPC マウスの

1. 不要な超音波スキャンを避けるためには、腹腔内の病変を負担する可能性があるかもしれないし、腹部超音波検査を受ける必要がありますその後マウスを識別するためにマウスの腹部を触診します。
   1. KPC マウス モデルの年齢の 8 週間から腹部の触診を毎週実行します。高解像度超音波は、移植腫瘍モデル (例えばorthotopics) または他の遺伝子組み換えマウスのモデルにも適用できます。
      注: 腫瘍動態研究目標 (予防研究、治療的介入の研究)、によって非常に小さな腫瘍 (1-2 mm) の検出可能ですモニター腫瘍発症する腫瘍を触知することができます前に。
2. ケージ グリッド上にマウスを置くとそっとしっぽをマウスを持ち上げ、優しくインデックスと非固定手 (図 1) の親指を上下に行くことによって腹部を触診します。
3. マウスは、柔らかい触診を容認する場合、は、ゆっくり圧力を高めることによって進みます。大きい抵抗は、上・下腹部で簡単に検出できます。腫瘍とハードの糞便を誤って解釈ことができる時に、質量です。

2. 作業スペースの準備

1. 少なくとも 3 つの異なる作業台スペースを提供: スキャン前エリア、ステージと回復のケージをスキャンします。必要な材料は、図 2で描かれています。
2. メイン作業プレートをきれい (たとえば、70% エタノール) し (図 3) をスキャンする前に暖房プラットフォームに切り替えます。最初のマウスを転送する前に 38-40 ° C の温度が設定温度に達することを確認してください。
3. 超音波マシンに切り替え、集録したデータ (図 4) の新しいフォルダーを作成します。腹部画像診断の B モードの設定が適用されます。さらに、腹部のトランスデューサーがマシンのアクティブなポートに接続されていることを確認します。作業ステージの上部にシステムをマウント トランスデューサーを使用して、探触子の頭を修正します。
4. 手続き後の体温調節やスキャンしたマウスの迅速なリカバリを確保するため加熱プレートまたは温熱マット (または暖房ランプ) の回復ケージを準備します。クッションとして窒息 (図 5) のリスクと寝具の吸引を避けるためにこのケージの下部組織の薄い層を置きます。

3. 吸入麻酔

1. 誘導チャンバーにマウスを置くことによって進みます。ガスのキャリアの流れ (1 L/分の酸素、空気) のバルブを開き、イソフルラン麻酔濃度を徐々 に増加させる飽和誘導室を許可する 4% に設定します。適切なイソフルラン清掃 (パッシブまたはアクティブ フィルタ リング) されていることを確認します。約 2 〜 4 分後マウスは通常深い鎮静下になります。
   1. 作業段階に鼻の円錐形によって 2% イソフルランの投与による鎮静を維持します。
2. 慎重に作業段階に誘導室から動物を転送します。一定のガス流れ鼻の円錐形を確認します。麻酔ライン コンセントの鼻の円錐形のマウスの鼻を置きます。初期スキャンの定位置は仰臥位です。マウスは、膵頭部または尾部腫瘍 (図 6) の可視性を改善するために、左右どちらにも配置できます。
3. 腹部超音波検査は痛みを伴う自体、痛み無料条件と深い麻酔状態の指標として足ピンチ テストを実行します。マウスがまだアクティブ、または積極的に動き回る、転写動物は繰り返されると長時間誘導誘導室に戻る。
4. 体液の損失による角膜の損傷を防ぐために眼保護軟膏を使用します。
5. 麻酔中モニタリング システムを使用します。しかし、心電図、直腸温が常用される腹部超音波スキャンのため。重要なは、マウスは、麻酔下で thermoregulate する能力を失います。したがって、低体温症や呼吸困難にあえぎや無呼吸などの臨床徴候を観察します。症状はすぐに明白な停止イソフルランと回復ケージ内マウスの場所です。 場合、

4. 超音波の設定

1. 製造元の指示に従って超音波システムに切り替えます。アクティブに腹部のパッケージと一般的なイメージングをつける主な設定を確認します。通常 B モード画像は、標準のデータ集録に使用されます。
2. 次のパラメーターを最適化されたイメージの品質を達成するため: 周波数 40 MHz、2 D ゲイン 25-30 dB、イメージ深さ 10 ミリメートル、画像幅 10 mm、3-6 mm の間の中心の 3 つの焦点ゾーン。

5. マウス作製

1. 粘着テープを使用して上部および下肢を修正します。(図 7) 固定のため動物への損傷を避けるために可能な限り、注意してください。
2. 電子ペット バリカンを使用してすべての腹部の毛皮を削除します。毛皮テクスチャによる胸部まで下腹部から開始します。この分野での皮膚の損傷を避けるために大の剣状突起で世話をします。
   注: マウスの毛皮超音波を反映し、可視性を減少させます。
3. 脱毛クリームを使用すると、最適化された皮膚の準備と毛皮の完全な除去を実行できます。綿棒 (図 8) を使用して坊主の腹部にクリームの薄い層を管理します。多量の水を完全に削除すべての残骸 (図 9図 10図 11) 続いて乾燥組織 (30 s または使用クリームによってはそれ以降) の後、クリームを削除します。クリームの残党は超音波後皮膚や粘膜の炎症の原因し、こうして健康に影響を与える可能性があります。
4. 適切なスキャンに条件が適用されます (図 12) 腹部に超音波ゲルたっぷり。通常、暖かい超音波ゲルはマウスの低体温症を最小限にするために使用されます。
5. 手動でトランスデューサ ヘッドに超音波ゲルの薄い層を適用します。ノッチの探触子側に触れることにより、テストを実行します。画面では、探触子が正しく配置されている場合、左上の信号を見ることができます。

6. 腹部超音波検査

1. 会社の圧力を使用して腹部に探触子を調整します。マウスの腹部の重い圧縮は、呼吸器や循環器系の障害につながる可能性があり、避けるべきであります。
2. 上下にスキャンします。作業台や x 軸と y 軸の車輪の枠を調整します。
3. 最初のステップとして、両方の腎臓を識別します。通常彼らは下腹部に同種の構造を hyperechogenic として表示されます。接続されている下大静脈 renalisは、さらに下大静脈(図 13) につながる簡単に見つけることができます。
4. 膵臓の画期的な容器として下大静脈 lienalis機能を使用します。Renalis 下大静脈と下大静脈 lienalisを区別しようとします。Lienalis 下大静脈の検出時に膵臓は正確にローカライズされました。通常の膵臓は、固体構造(図 14 と図 15) より腹腔内感染が広がる膜ではなくです。

7. 膵腫瘍検出とボリュームの評価

1. すべての周囲の構造から膵病変を識別します。彼らは一般に低エコー円形または長円形の不均質組織固まり (図 16) として表示されます。腫瘍は通常しっかりとスキャン ヘッドでは、ほとんど圧縮することができます。注は、時から腫瘍と小腸ループとの間を明確に区別するが難しいことがあります。膵腫瘍で、観察する必要があります腸の蠕動運動に注意を払います。
2. 時に腫瘍検出画面を上下に合計サイズの印象を受けるし、超音波のキャリパーを使用して最大の直径を測定します。適切なイメージが見つかったら、画面がフリーズし、正確に腫瘍の大きさを判断するものさしツールを使用します。尻尾や体膵頭部に腫瘍がローカライズされているかどうかを区別するために重要なことが後で使用できる注意してください。
3. ライブ モードに変更する前に、作業を記録する画像を保存することを確認します。それは調整のホイールがリリースされる、マウスの腹部に超音波プローブが押されたさらにもっと起こるかもしれない画像を凍結しながら注意してください。したがって、凍結するモードを変更する前に圧縮の調整を修正します。
4. 最初の面の測定を終えた後スキャン ヘッドを縦位置 (図 17) に 90 ° 回転するか、その側では、腫瘍の縦方向の拡張を検出するには、マウスを有効にします。いくつかの腫瘍は、十分な視認性のマウスの位置を変更する必要があります。膵尾部腫瘍は、その左側にある (図 11 と図 20) 膵頭部腫瘍のため(図 10 と図 19)、右側を下にマウスを配置できます。

8. 腫瘍体積の定量化

注: すべての努力の主要な目的のひとつ腫瘍体積の正しい決定であります。利用可能ないくつかのテクニックがありますが、楕円の式を含む計算法大学医療センター ゲッティンゲンでことが勧めします。

1. すべての 3 つの以前に取得した直径を装備し、対応する腫瘍 (図 21) のおおよその量を計算します。
2. また、後続のボリューム計算・ 3 D 再構成による腫瘍領域の自動スキャンを実行するのにスキャン ヘッドのモーター システムを使用します。

9. 回復

1. スキャンした後すべての粘着テープを慎重に取り外し、すべての超音波ゲルを丁寧に乾いたティッシュで。
2. 慎重に回復ケージ (図 21) にマウスを転送します。呼吸機能障害を引き起こす可能性があります mouse´s 顔であらゆるカバー ティッシュを避けてください。回復のための側の立場は、優先されるべき。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

超音波は、人間の病気のマウスモデルでいくつかの問題に対処するため汎用性と非侵襲的な手法です。すべてその他イメージングのアプローチの主要な利点と比較して、高スループット、コスト効率、短いアクイジション時間と実時間イメージング。ただし、このツールは、高精度、高品質の画像を生成するための専門知識を必要があります。不要な工芸品の特に超?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

このプロトコルでは、遺伝子組み換えマウス モデルにおける高分解能の腹部超音波画像を用いた膵腫瘍を定量化するための詳細な説明が提供されます。最近、論らどのようにマウス モデルでもない準備をし、以降のすべてのステップのための前提条件は、¹¹を示されていた処理の可視化について膵腫瘍を定量化する詳細な説明を出版しました。この原稿の全体的な目...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Visual Sonics Vevo2100 High Resolution Ultrasound System, including imaging stage and anesthesia line	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11945
Vevo 2100 MicroScan Transducer MS-550-D (22-55MHz)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11874
Vevo Anesthesia System (anesthesia induction chamber with fresh and waste gas inlet)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-12055
Vevo Imaging Station (working stage with nose cone for anesthesia supply)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-11982
electronic pet clippers	Panasonic Marketing Europe, Germany	5025232484324	Panasonic ER-PA10-s
Labotect Hot plate	Labor tech Göttingen, Germany	13854
eye cream (ophthalmic ointment)	Schülke&Mayr, Germany	9080249
veterinary isoflurane	Abbvie, Germany	4831867
depilatory cream	RB healthcare UK, United Kingdom	8218535
70% ethanol (v/v) in distilled water	TH. Geyer, Germany	22941000
ultrasound gel	Asmuth, Germany	13477
tissue wipes	Kimberly-Clark Germany, Germany	7558
cotton tips	Meditrade, Germany	75481116
glass bowl for ultrasound gel	ARC France, France	H1149
water bowl	W & P Trading Co., USA	B00K2P6PLQ
gauze sponges	Fuhrmann, Germany	960504