ניצול אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה על צג תחילת גידול וצמיחה מודלים מהונדס גנטית לסרטן הלבלב

Summary

מאמר זה מתאר את הניצול של אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה בעכברים מהונדסים גנטית לסרטן הלבלב. המטרה העיקרית היא לספק הדרכה מפורטת של זיהוי, הערכה של הלבלב גידולים אנדוגני.

Abstract

LSL-קראס ^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; Pdx-1-Cre (KPC) העכבר מודל מייצג מודל הטרנסגניים הוקמה ומשמש לעתים קרובות כדי להעריך טיפולים בסרטן הלבלב. תחילת הגידול הוא משתנה במודל KPC בין 8 שבועות מספר חודשים. לכן, כלי הדמיה לא פולשנית נדרשים מסך עבור תחילת הגידול ולפקח על התגובה לטיפול. כדי לטפל בבעיה זו, גישות שונות הופיעו במהלך השנים האחרונות. אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יש יתרונות חשובים כגון אי-invasiveness, הפעלה מהירה פעמים רזולוציה תמונה גבוהה ללא חשיפה לקרינה. עם זאת, אולטרסאונד בעכברים אינו טריוויאלי ומספיק ידע אנטומי, מיומנויות מעשיות נדרשים לבצע בהצלחה אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה במודלים פרה סרטן הלבלב. במאמר שלהלן מוצג מדריך מעשי מפורט עבור אולטרסאונד בטן במודלים מאתר עם דגש מיוחד בדגמים סרטן הלבלב אנדוגני. יתר על כן, סיכום של טעויות נפוצות, וכיצד להימנע מהם מסופק.

Introduction

מודלים מהונדס גנטית עכבר השיגו חשיבות הולך וגדל בחקר הסרטן, בשל היכולת שלהם מקרוב לסכם את המורכבות האנושית carcinogenesis^1,2,3. ביותר בשימוש תכוף מודלים ללמוד סרטן הלבלב התפתחות, התקדמות, תגובה טיפולית מאופיין של הפעלת מוטציה ב- אונקוגן קראס בשילוב של איון של הגידול p53 משתיק קול, או⁴. קראס-LSL הזה ^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; Pdx-1-Cre דגם העכבר (KPC) מחקה את התקדמות צעד חכם של נגעים טרום פולשנית neoplasia intraepithelial הנרתיק הלבלב (הייתה) כדי קרצינומה פולשנית. . Phenotypically, כמעט כל העכברים לפתח PDAC בתוך ששת החודשים הראשונים לאחר הלידה. עם זאת, לעומת מודלים המושתלים, המודל KPC מגלה של תחילת גידול משתנה מאוד מ- 8 שבועות חודשים מספר⁴. ברגע הלבלב גידולים מגיע בגודל מסוים (5-9 מ מ קוטר), הגידול מאיץ במהירות, עכברים יהיה חייב להיות רשום ניסויים פרה⁵. לכן, זיהוי מדויק של תחילת גידול וגודל הגידול הוא תנאי חיוני מחקר קליני הלוגיסטי וניטור הטיפול. באופן כללי, מספר גישות אוהב תהודה מגנטית (MRI)⁶, טומוגרפיה סריקה^7,8,9 או אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יכול להיות מועסק לערוך הקרנת הגידול, טיפול¹⁰. בכל שיטה יש את החסרונות והיתרונות שלה. למרות MRI- או טומוגרפיה ממוחשבת (CT)-הדמיה מאפשר רכישת נתונים ברזולוציה גבוהה כמו גם חישוב נפח מדויק, זמן ממושך הבדיקה תחת הרדמה כללית, וכן ציוד יקר מאוד נדרש, אינו מתיר בתדירות גבוהה סריקה על פני תקופה ארוכה של זמן. לעומת זאת, בדיקת אולטרה סאונד בעלי חיים קטנים היא שיטה ותיקה זה יכול להיות מועסק על המסך עבור פתולוגיות בטן עכברים¹¹. היתרונות של שיטת ההדמיה הם קצרים סריקה פעמים, ברזולוציה גבוהה, ואם האפשרות להשתמש אולטרסאונד דופלר או חדות משופרת אולטרסאונד (CEUS) כדי להמחיש זלוף איברים במקביל. עם זאת, ידע אנטומי דמיון תלת-ממד, הכשרה מעשית מקיפה נדרשים לפרשנויות התמונה הנכונה.

במאמר הבא, פרוטוקול מפורט עבור ניצול אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה במודל KPC מסופק. יתר על כן, תמונות אולטרסאונד רגיל מתואר, בלוחיות איברים מבנים כדי להקל על התמצאות עם החוקר.

Protocol

פרוטוקול זה הוא בהתאם להנחיות טיפול בבעלי חיים-אוניברסיטת רפואי מרכז גטינגן, גרמניה (33.9-42502-04-15/2056). בהתאם לדרישות ספציפיות לחיה הבודדת סקירה לוחות, חלק מהשלבים פרוטוקול יכול להיות שונה בהתאם.

1. בטן מישוש של KPC עכברים

1. כדי להימנע מיותרים-אולטרסאונד סריקות, ימשש את הבטן בעכבר כדי לזהות עכברים אשר אולי יכול לשאת הנגע intraabdominal, לאחר מכן כדאי לעבור אולטרסאונד בטן.
   1. לבצע מישוש הבטן לשבוע החל מגיל במודל עכבר KPC 8 שבועות. אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה ניתן להחיל גם הגידול המושתלים מודלים (למשל, orthotopics) או דגמים אחרים העכבר מהונדסים גנטית.
      הערה: בהתאם הגידול קינטיקה והלימוד המטרה (מניעת מחקר, מחקר התערבות טיפולית), זיהוי של גידולים קטנים מאוד (1-2 מ מ) הוא ריאלי לתחילת גידול צג לפני גידולים יכולים להיות palpated.
2. הנח את העכבר ברשת הכלוב בעדינות להרים את העכבר בזנבו, ימשש את הבטן על ידי בעדינות הולך למעלה ולמטה עם אינדקס והאגודל של היד הלא-תיקון (איור 1).
3. אם העכבר סובלנית מישוש רך, להמשיך על-ידי לאט הגברת הלחץ. התנגדות גדולה יותר ניתן להבחין בקלות על הבטן העליונים והתחתונים. לפעמים, צואה קשה אפשר בטעות לפרש גידול בנפח גדול.

2. הכנת מרחב העבודה

1. לספק מקום לפחות שלוש יחידות עבודה שונים: אזור הסריקה טרום, סריקה כלוב הבמה ושחזור. החומר הנדרש מתוארת באיור2.
2. לנקות את הצלחת העבודה הראשי (לדוגמה עם 70% אתנול) ולעבור על פלטפורמת חימום לפני סריקה (איור 3). ודא כי הטמפרטורה יעד של 38-40 ° C הוא הגיע לפני העברת העכבר הראשון.
3. . הפעילי את מכונת האולטרסאונד, צור תיקיה חדשה עבור הנתונים נרכשים (איור 4). ההגדרה B-מצב מוחל עבור הדמיה בטן. עוד יותר, ודא שמתמר הבטן מחובר הנמל הפעיל של המכונה. לתקן בראש מתמר בחלק העליון של השלב עבודה באמצעות מתמר הרכבה מערכת.
4. להכין כלוב ההתאוששות על צלחת חימום או שטיחוני חום (או שימוש מנורת חימום) כדי להבטיח הומיאותרמיות procedural החלמה מהירה של עכברים שנסרקו. לשים שכבה דקה של רקמה כמו כרית בתחתית הכלוב הזה כדי למנוע שאיפה של מצעים עם הסיכון של חנק (איור 5).

3. שאיפת הרדמה

1. המשך על ידי הצבת עכבר אל החדר אינדוקציה. לפתוח את השסתום לזרימה המוביל גז (1 ליטר/דקה חמצן או אוויר) ולהגדיר את הריכוז איזופלוריין 4% ומאפשר רוויה לאט גדל והולך של התא אינדוקציה. ודא כי ראוי איזופלוריין ניקוי (סינון פסיבי או אקטיבי) נמצא במקום. לאחר כ- 2-4 דקות העכבר יהיה בדרך כלל תחת הרדמה עמוקה.
   1. לשמור על הרגעה על ידי ניהול 2% איזופלוריין באמצעות קונוס האף על הבמה עבודה.
2. להעביר בזהירות את החיה מן החדר אינדוקציה לשלב עבודה. בדוק את האף חרוט זרימת גז קבוע טובה. הכניסו את החוטם העכבר האף חרוט לשקע הקו הרדמה. מיקום קבוע לצורך הסריקה הראשונית היא עמדה פרקדן. ניתן גם להניח את העכבר על צידו הימני או השמאלי כדי לשפר את הנראות של ראש הלבלב או זנב גידולים (איור 6).
3. למרות אולטרסאונד בטן אינו כואב כשלעצמה, לבצע הבדיקה קמצוץ רגל כמחוון תנאי ללא כאב, מצב עמוק הרדמה. אם העכבר עדיין פעיל או פעיל זז, retransfer החיה בחזרה התא אינדוקציה עבור אינדוקציה חוזרות וממושכת.
4. השתמש משחה הגנה העין כדי למנוע פציעות הקרנית בשל אובדן נוזלים.
5. במהלך ההרדמה, להשתמש מערכת ניטור. עם זאת, אק ג, טמפרטורה רקטלית לא בקביעות משמש עבור סריקת אולטרסאונד בטן. חשוב לציין, עכברים לאבד את היכולת thermoregulate תחת הרדמה. לכן, מתצפתים הסימנים הקליניים על היפותרמיה או מצוקה נשימתית כגון להשתנק או דום נשימה. אם כל סימפטום הוא עצור ברור איזופלוריין ומקום העכבר בכלובי ההתאוששות מיד.

4. אולטרסאונד הגדרות

1. לעבור על מערכת סאונד כפי שתואר על ידי הוראות היצרן. ודא כי ההגדרה הראשית הפעות דימות כללי עם החבילה בטן מופעל. בדרך כלל B-מצב-הדמיה משמשת כסטנדרט והקפאה.
2. להשיג איכות תמונה ממוטבת עם הפרמטרים הבאים: תדירות 40 מגה-הרץ, 2D-רווח של 25-30 dB, תמונת עומק 10 מ"מ, רוחב תמונה 10 מ"מ, 3 אזורי מיקוד עם מרכז בין 3-6 מ מ.

5. העכבר הכנה

1. לתקן את הגפיים העליונים והתחתונים באמצעות סרט דביק. להיזהר כמו ככל האפשר להימנע בכל פגיעה החיה עקב קיבוע (איור 7).
2. הסר כל פרווה בבטן באמצעות אלקטרונית קוצץ לחיות מחמד. בשל המרקם הפרווה, להתחיל בבטן התחתונה עד קשת הצלעות. . שמור על עצמך- processus xiphoideus כדי למנוע פציעות העור באזור זה.
   הערה: עכבר פרווה משקף גלי אולטרסאונד ומקטינות את הראות.
3. השתמש קרם depilatory כדי לבצע הסרה מלאה של פרווה והכנה של העור ממוטבת. לנהל שכבה דקה של קרם על גבי הבטן מגולח באמצעות טיפים כותנה (איור 8). הסר את השמנת (לאחר 30 s או מאוחר יותר בהתאם הקרם משמש) עם רקמות יבש ואחריה שפע של מים כדי להסיר לחלוטין את כל שאריות (איור 9, 10 איור, איור 11). שאריות קרם עלול לגרום גירויים העור ורירית לאחר האולטרסאונד, ובכך עלול להשפיע על הבריאות.
4. כדי להבטיח סריקה הולם תנאים להחיל הרבה ג'ל אולטרסאונד על הבטן (איור 12). בדרך כלל, סאונד חם ג'ל משמש כדי למזער היפותרמיה על העכבר.
5. באופן ידני למרוח שכבה דקה של אולטרסאונד ג'ל על הראש מתמר. לבצע בדיקה על-ידי נגיעה בקצה מתמר עם החריץ. על המסך סימן בצד העליון השמאלי ניתן לראות אם המתמר ממוקם כהלכה.

6. אולטרסאונד בטן

1. להתאים את המתמר על הבטן תוך שימוש בלחץ חזק. דחיסה כבד של הבטן העכבר עשוי להוביל לקות בדרכי הנשימה או במחזור הדם, יש להימנע.
2. סריקה למעלה ולמטה. להתאים את המסגרת של פלטפורמת העבודה ואת הגלגלים עבור ציר ה-x וציר ה-y.
3. בשלב הראשון לזהות שתי הכליות. בדרך כלל הם מופיעים כמבני הומוגנית hyperechogenic בבטן התחתונה. מחוברת vena renalis ניתן בקלות למצוא נוסף שמוביל הווריד הנבוב נחות (איור 13).
4. השתמש את מגישה vena lienalis ציון דרך קיבול עבור הלבלב. ניסיון להבחין בין vena renalis vena lienalis. על הגילוי של vena lienalis הלבלב יכול להיות בדיוק לשפות אחרות. הלבלב נורמלי הוא מעדיף קרום מתפשט דרך חלל הבטן מאשר מבנה מוצק (איור 14 ו- 15 איור).

7. בלבלב זיהוי והערכה נפח

1. לזהות נגעים הלבלב של כל המבנים שמסביב. הם בדרך כלל מופיעים כגושים רקמות עגול או מאורך inhomogeneous hypoechoic (איור 16). הגידול הוא בדרך כלל מוצק, ניתן לדחוס בקושי על ידי ראש הסריקה. הערה, מפעם לפעם שזה עלול להיות מסובך להבחין בבירור בין גידול לולאת המעי הגס קטן. שים לב הפריסטלטיקה המעי לא להתייחס בגידולים בלבלב.
2. על מסך זיהוי הגידול למעלה או למטה כדי לקבל רושם של הגודל הכולל ולמדוד את הקוטר הגדול ביותר על-ידי שימוש של caliper אולטרסאונד. ברגע דימוי ראוי נמצא, הקפאת המסך והשתמש בכלי מדידה כדי לקבוע במדויק את גודל הגידול. שימו לב, לשימוש מאוחר יותר, שיהיה חשוב להבדיל בין אם הגידול הוא מקומי הזנב, הגוף או הראש של הלבלב.
3. לפני שינוי חזרה לחיות במצב, הקפד לשמור תמונות כדי להקליט את העבודה. שימו לב, בעת הקפאת את התמונה שזה עלול לקרות כי הגלגל ההתאמה הוא שוחרר, החללית אולטרסאונד נלחץ עוד יותר בבטן העכבר. לכן, לתקן את ההתאמה של הדחיסה לפני שתשנה את מצב להקפיא.
4. לאחר שסיים את המדידה של המטוס הראשון לסובב את הראש סריקה 90 ° בעמדה האורך (איור 17), או להפעיל את העכבר על הצד שלו, כדי לזהות התרחבות האורך של הגידולים. כמה גידולים עשויים לדרוש שינוי המיקום של העכבר עבור ניראות נאותה. זנב הלבלב גידולים, ניתן להניח את העכבר בצד ימין שלה (איור 10 , איור 19), גידולים בראש הלבלב על צד שמאל שלו (איור 11 , באיור 20).

8. כימות של נפח הגידול

הערה: מטרתו העיקרית הינה של כל המאמצים היא הקביעה הנכונה של נפח הגידול. אמנם קיימות מספר טכניקות שיטת החישוב כולל את הנוסחה של אליפסואיד עדיף ב גטינגן במרכז הרפואי אוניברסיטת.

1. מצויד כל שלושה קטרים שהושג בעבר, לחשב נפח הגידול המתאימה (באיור 21).
2. לחלופין, השתמש של המערכת המוטורית של הראש סריקה כדי לבצע בסריקה אוטומטית של אזור הגידול עם נפח לאחר מכן חישוב ו 3-ממד-שחזור.

9. שחזור

1. לאחר סריקה, הסר בזהירות כל דבק, הסר בזהירות את כל הג'ל אולטרסאונד עם רקמות יבש.
2. בזהירות להעביר את העכבר לתוך הכלוב השחזור ( איור 21). הימנע כל רקמות המכסה את פני mouse´s שעלול לגרום ליקוי במערכת הנשימה. עמדה בצד עבור שחזור צריך להיות המועדפת.

תוצאות

אולטראסאונד הדמיה היא טכניקה צדדי, לא פולשנית, המשמש לטיפול בבעיות מספר דגמים מאתר של מחלות אנושיות. לעומת כל שאר הדמיה גישות יתרונות חשובים הן יעילות תפוקה גבוהה, עלות, זמן קצר רכישה הדמיה בזמן אמת. עם זאת, כלי זה צריך מומחיות כדי להפיק תמונות באיכות גבוהה, מדויקת. במיוחד ?...

Discussion

עם פרוטוקול זה, תיאור מפורט עבור לכימות הלבלב גידולים באמצעות דימות ברזולוציה גבוהה אולטרסאונד בטן במודלים של העכבר מהונדסים הינו מסופק. לאחרונה, Sastra. et al. לאור תיאור מפורט כיצד ניתן לכמת הלבלב גידולים העכבר דגמים, אבל אין הוראות מטמיעים אודות ההכנה וטיפול כמוצג תנאי מוקדם לקבלת צעדי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Visual Sonics Vevo2100 High Resolution Ultrasound System, including imaging stage and anesthesia line	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11945
Vevo 2100 MicroScan Transducer MS-550-D (22-55MHz)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11874
Vevo Anesthesia System (anesthesia induction chamber with fresh and waste gas inlet)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-12055
Vevo Imaging Station (working stage with nose cone for anesthesia supply)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-11982
electronic pet clippers	Panasonic Marketing Europe, Germany	5025232484324	Panasonic ER-PA10-s
Labotect Hot plate	Labor tech Göttingen, Germany	13854
eye cream (ophthalmic ointment)	Schülke&Mayr, Germany	9080249
veterinary isoflurane	Abbvie, Germany	4831867
depilatory cream	RB healthcare UK, United Kingdom	8218535
70% ethanol (v/v) in distilled water	TH. Geyer, Germany	22941000
ultrasound gel	Asmuth, Germany	13477
tissue wipes	Kimberly-Clark Germany, Germany	7558
cotton tips	Meditrade, Germany	75481116
glass bowl for ultrasound gel	ARC France, France	H1149
water bowl	W & P Trading Co., USA	B00K2P6PLQ
gauze sponges	Fuhrmann, Germany	960504