Utilisant des ultrasons de haute résolution à l’apparition de tumeur de moniteur et de la croissance dans les modèles issus du génie génétique du cancer du pancréas

Résumé

Cet article décrit l’utilisation de l’échographie haute résolution chez les souris génétiquement modifiées de cancer du pancréas. L’objectif principal est de fournir une instruction détaillée pour la détection et l’évaluation des tumeurs pancréatiques endogènes.

Résumé

Le LSL-Kras ^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; PDX-1-Cre modèle murin (KPC) représente un modèle transgénique établi et fréquemment utilisé pour évaluer de nouveaux traitements dans le cancer pancréatique. Apparition de la tumeur est variable dans le modèle de la KPC âgés de 8 semaines à plusieurs mois. Par conséquent, les outils d’imagerie non invasive sont tenus d’écran pour l’apparition de la tumeur et du moniteur pour la réponse au traitement. Pour résoudre ce problème, différentes approches ont émergé ces dernières années. Échographie haute résolution dispose d’atouts majeurs tels que le caractère non invasif, temps de session rapide et une image haute résolution sans exposition aux radiations. Cependant, l’échographie chez la souris n’est pas trivial et suffisamment de connaissances anatomiques et compétences pratiques nécessaires pour son exécution avec succès l’échographie haute résolution dans des modèles précliniques de cancer du pancréas. Avec l’article suivant, un guide pratique détaillé pour une échographie abdominale dans les modèles murins en mettant l’accent sur des modèles de cancer pancréatique endogène est présenté. Par ailleurs, on trouvera un résumé des erreurs courantes et comment les éviter.

Introduction

Modèles de souris génétiquement modifiées ont acquis une importance croissante dans la recherche sur le cancer en raison de leur capacité à récapituler étroitement la nature complexe de la carcinogenèse humaine^1,2,3. Un des plus fréquemment utilisé des modèles pour étudier le développement du cancer pancréatique, la progression et la réponse thérapeutique est caractérisée par une mutation activatrice de l’oncogène Kras, combinée à une inactivation de la tumeur suppresseur p53⁴. Cette LSL-Kras^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; PDX-1-Cre modèle murin (KPC) imite la progression progressive des lésions pré-invasives intraépithéliales pancréatiques (Panine) au carcinome invasif. Phénotypiquement, presque toutes les souris développent ACPE dans les six premiers mois après la naissance. Toutefois, le modèle de CPK par rapport aux modèles transplantés, révèle un début de tumeur très variable de 8 semaines à plusieurs mois⁴. Une fois les tumeurs pancréatiques atteignent une certaine taille (5 à 9 mm de diamètre), la croissance tumorale accélère rapidement et souris devront être inscrits dans des essais précliniques⁵. La détection exacte de l’apparition de la tumeur et de la taille de la tumeur est donc une condition essentielle pour la logistique de l’étude préclinique et le suivi de la thérapie. En général, plusieurs approches comme l’imagerie par résonance magnétique (IRM)⁶, tomodensitométrie,^7,8,9 ou échographie haute résolution de numérisation peut être utilisée pour effectuer le dépistage des tumeurs et ¹⁰de thérapie. Chaque technique a ses avantages et ses inconvénients. Bien que MRI- ou une tomodensitométrie (CT)-l’imagerie permet l’acquisition de données haute résolution ainsi que calcul de volume précis, temps d’examen prolongé sous sédation générale, et il faut un matériel très onéreux et ne permet pas fréquent numérisation sur une longue période de temps. En revanche, petit animal échographie est une méthode établie qui peut être employée pour dépister les pathologies abdominales en souris¹¹. Avantages de cette méthode d’imagerie sont courtes numérisation fois, haute résolution, et la possibilité d’utiliser l’échographie doppler ou contraste amélioré par ultrasons (UFC) pour visualiser une perfusion des organes en parallèle. Toutefois, des connaissances anatomiques, l’imagination 3D et une formation pratique approfondie sont nécessaires pour l’interprétation de l’image correcte.

Dans l’article suivant, un protocole détaillé pour l’utilisation de l’échographie haute résolution dans le modèle de CPK est fourni. En outre, les images échographiques standard sont représentés et étiquetés avec des structures d’orgue pour faciliter l’orientation de l’enquêteur.

Protocole

Ce protocole est en conformité avec les directives de protection des animaux à l’University Medical Centre Goettingen, Allemagne (33,9-42502-04-15/2056). Selon les besoins spécifiques de chaque animal review boards, parmi les mesures du protocole pourrait être modifiée en conséquence.

1. abdominale Palpation des CPK souris

1. Pour éviter les échographies inutiles, palper l’abdomen de la souris pour identifier des souris qui pourraient éventuellement porter une lésion intraabdominale et devraient subir par la suite une échographie abdominale.
   1. Effectuer une palpation abdominale hebdomadaire à partir de 8 semaines d’âge dans le modèle murin de la KPC. Échographie haute résolution peut également être appliqué dans les modèles de tumeurs transplantées (p. ex., orthotopics) ou d’autres modèles de souris génétiquement modifiées.
      Remarque : Selon la tumeur cinétique et étude objectif (prevention study, étude d’intervention thérapeutique), détection de tumeurs de très petites taille (1 à 2 mm) est réalisable et l’apparition de tumeurs de moniteur avant que les tumeurs peuvent être palpés.
2. Placez votre souris sur la grille de la cage et doucement lever la souris par la queue et palper l’abdomen par doucement monter et descendre avec l’index et le pouce de la main de non-fixation (Figure 1).
3. Si la souris tolère une palpation douce, aller de l’avant en augmentant lentement la pression. Une plus grande résistance peut facilement être détectée dans l’abdomen supérieur et inférieur. Parfois, les selles dures peuvent être interprétés à tort comme une tumeur de la masse.

2. préparation de l’espace de travail

1. Fournir l’espace au moins trois unités de travail différents : zone pré-scan, numérisation cage de scène et de récupération. Matériel requis sont représentés dans la Figure 2.
2. Nettoyer la plaque de travail principal (par exemple, avec 70 % éthanol) et de passer sur la plateforme de chauffage avant l’analyse (Figure 3). Assurez-vous que la température de consigne de 38-40 ° C est atteinte avant la première souris est transférée.
3. Mettre l’appareil d’échographie et créez un nouveau dossier pour les données acquises (Figure 4). Le paramètre mode B s’applique pour l’imagerie abdominale. En outre, s’assurer que le transducteur abdominal est branché dans le port actif de la machine. Fixez la tête de capteur dans la partie supérieure de l’étape de travail en utilisant le transducteur système de montage.
4. Préparer une cage de récupération sur une plaque chauffante ou mat thermique (ou lampe chauffante utilisation) afin d’assurer la thermorégulation post procédurale et prompt rétablissement des souris numérisées. Mettez une fine couche de tissu comme coussin au bas de cette cage pour éviter l’aspiration de literie avec les risques d’étouffement (Figure 5).

3. l’anesthésie par inhalation

1. Aller de l’avant en mettant une souris dans la chambre de l’induction. Ouvrir la vanne de débit du gaz vecteur (1 L/min d’oxygène ou d’air) et la valeur de la concentration d’isoflurane à 4 %, ce qui permet une saturation plus lentement en plus de la chambre de l’induction. Assurez-vous qu’isoflurane bon nettoyage (filtrage passif ou actif) est en place. Après environ 2 à 4 min, la souris sera habituellement sous sédation profonde.
   1. Maintenir la sédation en administrant 2 % isoflurane à travers le cône de nez sur la scène de travail.
2. Transvaser avec soin l’animal de la chambre d’induction à l’étape de travail. Vérifier la coiffe pour un débit de gaz constant. Mettre le museau de la souris dans la coiffe de la sortie de conduite de l’anesthésie. La poste régulier pour la numérisation initiale est le décubitus dorsal. La souris peut également être placée sur le côté droit ou gauche pour améliorer la visibilité de la tête du pancréas ou de la queue des tumeurs (Figure 6).
3. Bien que l’échographie abdominale n’est pas douloureuse en soi, effectuer le test du pincement pied comme indicateur d’un État libre de la douleur et Etat profondeur anesthésique. Si la souris est toujours actif ou déplacer activement, retransfert l’animal de retour dans la chambre de l’induction pour l’induction répétée et prolongée.
4. La pommade oculaire protection pour prévenir les blessures cornéens en raison de la perte de fluide.
5. Durant l’anesthésie, utiliser un système de surveillance. Cependant, ECG et la température rectale n'est pas régulièrement utilisée pour la numérisation de l’échographie abdominale. Ce qui est important, les souris perdent la capacité de thermorégulation sous anesthésie. Par conséquent, observez bien des signes cliniques pour hypothermie ou détresse respiratoire comme haletant ou d’apnée du sommeil. Si n’importe quel symptôme est immédiatement évident arrêt isoflurane et place la souris dans la cage de récupération.

4. échographie paramètres

1. Allumez le système à ultrasons tel que décrit par les instructions du fabricant. Assurez-vous que le paramètre primaire est mis sur l’imagerie générale avec le package abdominal activé. B-Mode-imagerie est généralement utilisée pour l’acquisition de données en tant que norme.
2. Obtenir une qualité d’image optimisée avec les paramètres suivants : fréquence image de 40 MHz, 2D-gain de 25-30 dB, profondeur 10 mm, largeur 10 mm, 3 zones focales avec centre entre 3 à 6 mm.

5. souris préparation

1. Fixer l’extrémité supérieure et inférieure avec du ruban adhésif. Être aussi prudents que possible afin d’éviter tout préjudice à l’animal en raison de la fixation (Figure 7).
2. Supprimer toutes les fourrures abdominale à l’aide de tondeuses pour animaux de compagnie électroniques. En raison de la texture de fourrure, démarrer à partir du bas de l’abdomen jusqu'à la cage thoracique. Faites attention à la xiphoideus de processus afin d’éviter des lésions de la peau dans ce domaine.
   Remarque : La souris fourrure reflète les ondes ultrasoniques et diminue la visibilité.
3. Crème dépilatoire permet d’effectuer une préparation cutanée optimisé et l’élimination complète de la fourrure. Administrer une fine couche de crème sur l’abdomen rasé à l’aide de bouts de coton (Figure 8). Retirez la crème (après 30 s ou plus tard selon la crème utilisée) avec les tissus secs, suivies de beaucoup d’eau afin d’éliminer complètement tous les restes (Figure 9, Figure 10, Figure 11). Restes de crème pourraient causer des irritations de la peau et les muqueuses après l’échographie et peuvent donc nuire à la santé.
4. Afin d’assurer la numérisation adéquates conditions s’appliquent à beaucoup de gel d’échographie sur l’abdomen (Figure 12). Habituellement, le gel ultrasonique chaud est utilisé afin de minimiser l’hypothermie pour la souris.
5. Appliquez manuellement une fine couche de gel ultrasonique sur la tête du capteur. Effectuer un test en appuyant sur l’extrémité du capteur avec l’encoche. À l’écran, un signal sur le côté supérieur gauche sont visibles si le capteur est correctement positionné.

6. abdominale échographie

1. Ajuster le capteur sur l’abdomen à l’aide d’une pression ferme. Forte compression de l’abdomen de la souris peut entraîner une déficience respiratoire ou circulatoire et devrait être évitée.
2. Balayage de haut en bas. Ajustez le cadre de la plate-forme de travail et les roues pour les axes x et y.
3. La première étape, identifier les deux reins. Habituellement, ils apparaissent comme des structures hyperéchogènes homogènes dans le bas-ventre. Les connectés vena renalis peuvent être facilement trouvés plus loin ce qui conduit à veine cave inférieure (Figure 13).
4. Utiliser la veine lienalis sert comme navire de point de repère pour le pancréas. Tentative de distinguer entre vena renalis et veine lienalis. En cas de détection de la veine lienalis du pancréas peut être localisé exactement. Le pancréas normal est plutôt une membrane se propager par le biais de la cavité abdominale qu’une structure solide (Figure 14 et Figure 15).

7. pancréatique tumeur détection et évaluation Volume

1. Identifier les lésions pancréatiques de toutes les structures environnantes. Généralement, ils apparaissent comme des masses de tissu hétérogène de rondes ou allongées hypoéchogènes (Figure 16). La tumeur est généralement ferme et ne peut être compressée par la tête de balayage. Remarque, de temps en temps qu'il pourrait être difficile de distinguer clairement entre une tumeur et une boucle de l’intestin grêle. Faites attention au péristaltisme de l’intestin qui ne doit pas être observé dans les tumeurs du pancréas.
2. Sur l’écran détection de tumeur up et down pour avoir une idée de la taille totale et mesurer le plus grand diamètre à l’aide de la pince à ultrasons. Une fois trouvée une image convenable, geler l’écran et utilisez l’outil de mesure pour déterminer précisément la taille de la tumeur. Noter que pour une utilisation ultérieure, qu'il sera important de différencier si une tumeur est localisée dans la queue, le corps ou la tête du pancréas.
3. Avant de changer de retour pour le mode live, assurez-vous d’enregistrer des images pour enregistrer le travail. Notez que tout gel de l’image, qu'il peut arriver que la molette de réglage est libérée, et la sonde d’échographie est encore plus enfoncée dans l’abdomen de la souris. Par conséquent, fixer le réglage de la compression avant de changer le mode de geler.
4. Après avoir terminé la mesure du premier plan soit tourner la tête de balayage de 90° en position longitudinale (Figure 17), soit tourner la souris à son côté, pour détecter la dilatation longitudinale des tumeurs. Certaines tumeurs peuvent impliquer le changement de la position de la souris par une visibilité adéquate. Pour les tumeurs de la queue du pancréas, la souris peut être placée sur son côté droit (Figure 10 et Figure 19), pour des tumeurs du pancréas tête sur le côté gauche (Figure 11 et Figure 20).

8. quantification du Volume de la tumeur

Note : Un des objectifs principaux de tous les efforts sont la détermination correcte du volume de la tumeur. Bien qu’il existe plusieurs techniques, une méthode de calcul, y compris la formule d’un ellipsoïde est préférée à l’University Medical Center Goettingen.

1. Équipé de tous les diamètres précédemment obtenus trois, calculer le volume approximatif de la tumeur correspondante (Figure 21).
2. Également utiliser un système de moteur de la tête de balayage pour exécuter une analyse automatisée de la région de la tumeur avec calcul de volume ultérieur et 3-D-reconstruction.

9. le recouvrement

1. Après la numérisation, retirez soigneusement tout le ruban adhésif et retirer soigneusement tous les gel ultrasonique avec tissu sec.
2. Transvaser avec soin la souris dans la cage de récupération ( Figure 21). Évitez n’importe quel tissu de revêtement sur la face mouse´s qui pourrait provoquer des troubles respiratoires. Une position latérale pour la récupération doit être préférée.

Résultats

L’échographie est une technique polyvalente et non invasif qui est utilisée pour traiter plusieurs questions dans des modèles murins de maladies humaines. Par rapport à tous les autres avantages majeurs des approches d’imagerie sont efficacité haut débit, coût, temps d’acquisition court et imagerie en temps réel. Toutefois, cet outil a besoin d’expertise pour générer des images précises et de haute qualité. Particulièrement dans le cas d’objets non désirés au moin...

Discussion

Avec ce protocole, une description détaillée pour quantifier les tumeurs du pancréas, à l’aide de l’échographie abdominale haute résolution dans des modèles murins transgéniques est fournie. Récemment, Sastra et coll. publié une description détaillée comment quantifier les tumeurs pancréatiques dans les modèles murins, mais aucune instruction visualisées sur la préparation et la manipulation comme condition sine qua non pour toutes les autres étapes ont été indiqué¹¹

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Visual Sonics Vevo2100 High Resolution Ultrasound System, including imaging stage and anesthesia line	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11945
Vevo 2100 MicroScan Transducer MS-550-D (22-55MHz)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	VS-11874
Vevo Anesthesia System (anesthesia induction chamber with fresh and waste gas inlet)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-12055
Vevo Imaging Station (working stage with nose cone for anesthesia supply)	FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada	SA-11982
electronic pet clippers	Panasonic Marketing Europe, Germany	5025232484324	Panasonic ER-PA10-s
Labotect Hot plate	Labor tech Göttingen, Germany	13854
eye cream (ophthalmic ointment)	Schülke&Mayr, Germany	9080249
veterinary isoflurane	Abbvie, Germany	4831867
depilatory cream	RB healthcare UK, United Kingdom	8218535
70% ethanol (v/v) in distilled water	TH. Geyer, Germany	22941000
ultrasound gel	Asmuth, Germany	13477
tissue wipes	Kimberly-Clark Germany, Germany	7558
cotton tips	Meditrade, Germany	75481116
glass bowl for ultrasound gel	ARC France, France	H1149
water bowl	W & P Trading Co., USA	B00K2P6PLQ
gauze sponges	Fuhrmann, Germany	960504