用球形发芽法评价 Hemangioblastoma 新生血管的体外性能的综合程序

摘要

本文提出了一个综合的方法来评价在体外是否存在经典的肿瘤血管生成在小脑 (哈佛商学院) 及其在哈佛商学院的作用。研究结果突出了血红蛋白-新生血管的复杂性, 认为这种共同的血管生成形式仅仅是血红蛋白-新生血管的补充机制。

摘要

冯·希佩尔·林道-林道 (VHL) 抑癌基因的失活在人类中枢神经系统 (CNS) 的小脑 (HBs) 的发展中起着至关重要的作用。然而, 哈佛商学院 (包括新生血管) 的细胞学起源和进化过程仍然存在争议, VHL-哈佛商学院的抗血管生成是基于典型的 HB 血管生成, 在临床试验中产生了令人失望的结果。抗血管治疗成功的临床翻译的一个主要障碍是对血管肿瘤的新生血管缺乏透彻的了解。在本文中, 我们提出了一个综合的程序来评价在体外是否存在经典的肿瘤血管生成在哈佛商学院, 以及它在哈佛商学院的作用。通过这一程序, 研究人员可以准确地了解乙肝新生血管的复杂性, 并确定其在哈佛商学院的这种常见的血管生成功能。这些协议可用于评估最有前景的肿瘤抗血管治疗, 它具有很高的翻译潜力, 无论是肿瘤治疗或协助优化抗血管生成治疗的哈佛商学院在未来的翻译。结果突出了血红蛋白新生血管的复杂性, 认为这种共同的形态血管生成只是血红蛋白新生血管的补充机制。

引言

小脑 (哈佛商学院) 是良性血管肿瘤, 是完全在人类中枢神经系统 (CNS) 发现。他们发展在患者与冯冯·希佩尔·林道-林道 (VHL) 疾病或零星的损伤。VHL-哈佛商学院是难以治愈的外科治疗, 由于频繁复发和多病变, 造成这种遗传紊乱¹。尽管 VHL 抑癌基因的失活已被认为是 VHL-哈佛商学院肿瘤发生的根本原因, 但哈佛商学院的细胞学起源 (包括新生血管) 和进化过程仍然很有争议²。因此, 更好地了解 HB-新生血管的生物机制, 可以为 VHL-哈佛商学院最有前途的抗血管策略提供有益的见解。

最近的研究表明, HB-新生血管类似于胚胎血管发生 3, 4, 5.典型的血管内皮生长因子 (VEGF) 介导的血管生成是由血管内皮引起的, 由 VHL 功能丧失所驱动, 导致增殖和新生血管形成, 这已被挑战⁶。在 1965年, Cancilla 和齐默尔曼使用电子显微镜发现, 哈佛商学院起源于内皮细胞⁷。后来发现基质细胞来源于 vasoformative 元素⁸。在 1982年, Jurco et 等发现基质细胞是内皮源⁹。因此, 我们假设, 人血管内皮细胞是血红蛋白的原细胞-新生血管的¹⁰。虽然最好使用从 VHL 患者手术中提取的 hb 细胞中的主要培养物, 但我们以前的研究表明, 来自 hb 的主要培养基不稳定, 细胞系无法建立³。此外, 3D 环境中的主要文化无法识别乙肝新生血管的细胞学来源, 因为它们包括 hb-血管成分的祖细胞^10,11。因此, 作为一种原始和经典的内皮细胞模型, 人血管内皮细胞 (HUVEC) 可以作为哈佛商学院的替代细胞模型。

球形发芽试验是组织工程中的一个新模型^12,13。本文开发了一种基于3D 胶原的共培养系统体外, 其目的是评价哈佛商学院是否存在经典的肿瘤血管生成, 以及它在哈佛商学院的作用。

研究方案

该方法是根据复旦大学华山医院研究伦理学委员会批准的指导方针和规定进行的。每个步骤都遵循相应的标准安全措施。有关示意性演示文稿, 请参阅图 1。

1. 细胞培养和质粒结构

1. 例行维持人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 在 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 补充10% 胎牛血清 (血清), 100 单位/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素在加湿 5% CO₂孵化器摄氏37摄氏度。
2. 摘要 PLKO 1 质粒, ApaI 和 EcoRI 合成 shRNA 片段。确保 VHL shRNA 向量的寡核苷酸序列 CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴。
3. 然后, 混合20µΜ系统与前5µL 的寡核苷酸, 5 µL 的反向寡聚, 5 µL 10x 的纳布缓冲器和35µL ddH₂O 一起 (总容量为50µL)。将混合物加热98摄氏度4分钟, 在几个小时内慢慢冷却到室温。
4. 结扎退火的寡核苷酸和 PLKO 1 质粒与 T4 连接酶在4°c 过夜。16小时后, 添加5µL 结扎组合成25µL 主管 DH5α细胞。然后, 筛选成功结扎的质粒, 并通过测序验证插入片段。

2. 慢病毒北疆包装和感染

1. 总计, 混合10µg 的 PLKO 1-shVHL 或 PLKO 1-shScramble 向量, 7.5 µg 的包装质粒 psPAX2, 2.5 µg 的信封质粒 pMD2 500 µL 的 DMEM 培养基没有胎牛血清 (血清) 25 分钟。
2. 添加 7 mLDMEM, 而不给上述解决方案。
3. 培养293FT 细胞在 DMEM 没有在10厘米直径组织培养皿中的血清。使用单元格计数器确保293FT 单元格的数量为 1 x 10⁷ 。
4. 将上述溶液的1毫升添加到293FT 细胞中以进行转染。
   注意:293FT 细胞系来源于293F 细胞系, 稳定表达 SV40 大 T 抗原。因此, 它是一个适合慢病毒载体生产的主机。
5. 在6小时后将培养基与含有10% 的 DMEM 的培养基替换。
6. 转染后用吸管在48小时收集介质。
   注意:病毒存在于含有10% 血清的 DMEM 中。死细胞漂浮在培养基上。使用0.45 µm 无菌膜过滤死细胞和杂质。一般而言, 没有必要检查感染的多重性。这是建立一个稳定的细胞线。在最后一步, 所有没有成功感染的活细胞将死于嘌呤霉素。shScramble 组和 HUVEC 细胞为对照组。确保所有 HUVEC 细胞与所使用的嘌呤霉素浓度 72 h 一起死亡。每个井都有相同数量的细胞。
7. 将慢病毒载体介质中的 HUVEC 细胞培养为72小时。然后, 将嘌呤霉素添加到 HUVEC 细胞的培养基中, 浓度为2µg/毫升, 24 小时. 使用 HUVEC 细胞而不接受任何治疗作为对照组。确保所有控制单元在此时死亡。
   注意:活细胞代表 VHL 击倒细胞和 shSramble 细胞的稳定细胞系。在96井板中, 镀层密度为 5000/井。

3. 内皮细胞球体的生成

1. 血管内皮细胞细胞和并用重悬在 DMEM 培养基中胰蛋白酶处理10% 的血清。在10厘米的培养皿中有适量的细胞, 加入1毫升的 typsin EDTA。
2. 将3D 圆底96井板中的细胞种子, 在细胞密度为 1 x 10³单元格/好。用一个能容纳0.50 µL 球体的井来悬浮球体。按照制造商的说明, 使用单元格计数器系统计数单元格。
3. 连续孵化37°c 和 5% CO₂的细胞为 72 h。在这些条件下, 确保悬浮细胞自动形成细胞球体。36小时后替换培养基中的一半。

4.体外血管生成试验

1. 解冻的凝胶溶液在4°c 和稀释它与减少的血清培养基在稀释率为1:5。
2. 用微吸 DMEM 培养基中的球体。洗涤后的球体与减少血清培养基的5毫升, 暂停球体轻轻地和谨慎地在稀释凝胶。确保没有气泡。
3. 在15井板中嵌入300µL 混合液。孵化后在37°c 和 5% CO₂为 1 h, 增加400µL 减少的血清培养基对每个井。在水井周围填充无菌水, 以产生湿润的环境, 以阻止蒸发。
4. 尔后, 文化板材在37°c 在 5% CO₂在100% 湿气为 1 h。
5. 小心地吸入旧培养基, 用600µL 减少血清培养基, 并将每一个井中的1% 个内皮细胞生长补充剂替换。
6. 在12小时或24小时以后, 在倒置的光显微镜下拍摄图像 (40 *)。

5. 数据分析

1. 将图像上传到在线图像分析平台上, 以获取发芽长度数据 (材料表)。
2. 在网页上, 通过电子邮件创建帐户。
3. 然后单击 "上载" 按钮上载图像。
4. 单击 "下载" 按钮下载结果。
   注意:该软件将生成处理后的图像和数据。数据包含五个部分: 累计发芽长度、平均发芽长度、芽长的标准偏差、发芽面积和球体面积。在处理过的图像中, 每个参数都用不同的颜色勾勒出来, 以简化处理后的图像中的识别: 红色代表芽的骨架, 黄芽的数量, 蓝色的芽结构, 白色芽端, 和橙色球体。

结果

原图像采用倒置光镜。控件组和 VHL 组的典型图像显示在图 2A1和图 2A2中。对照组的发芽长度短于 VHL 组。

上传图像后, 在线平台直接提供分析结果。输出由两部分组成: 处理后的图像和相应的分析结果。控制组和 VHL 基因静默组的处理图像标记为不同的颜色 ...

讨论

近年来, 血管内皮细胞¹⁵的研究刺激了多领域的维管束生物学研究。本文以内皮球发芽技术为实验模型, 研究了 VHL 基因在操作内皮细胞中的功能丧失对血管形成的作用, 以确定新的候选分子血管生成叶。根据我们的知识, 这是第一个检查内生改良内皮细胞血管生成效应的报告。

组织 (包括肿瘤组织) 新生血管是一个复杂的过程, 发生在发育过程中的通过?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
human umbilical vein endothelial cell	Fudan IBS Cell Center	FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium	Gibco	11995040
fetal bovine serum	Gibco	26400044
PLKO.1-puro vector	Addgene	#8453
packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
3D round-bottom 96-well plates	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15-well plate	Ibidi	81501	Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight
endothelial cell growth supplements	Sciencell	#1052
10-cm culture dish	Corning	Scipu000813
Puromycin	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco	25200056
Automated Cell Counter System	BioTech
Image Analysis software	Winmasis		http://mywim.wimasis.com