Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination

Résumé

Cet article présente une procédure complète pour évaluer in vitro si angiogenèse tumorale classique existe dans les hémangioblastomes (HBs) et son rôle dans HBs. Les résultats soulignent la complexité de la néovascularisation-HB et suggèrent que cette forme courante d’angiogenèse est seulement un mécanisme complémentaire dans la néovascularisation-HB.

Résumé

L’inactivation du gène suppresseur tumeur von Hippel-Lindau (VHL) joue un rôle crucial dans le développement des hémangioblastomes (HBs) dans le système nerveux central (CNS) humain. Toutefois, tant l’origine cytologique et le processus évolutif d’HBs (y compris la néovascularisation) demeurent controversées, et anti-angiogènes pour VHL-HBs, basés sur le classique HB angiogenèse, donnent des résultats décevants dans les essais cliniques. Un obstacle majeur à la traduction clinique réussie du traitement anti-vasculaire est l’absence d’une compréhension approfondie de la néovascularisation dans cette tumeur vasculaire. Dans cet article, nous présentons une procédure complète pour évaluer in vitro si angiogenèse tumorale classique existe en HBs, ainsi que son rôle dans HBs. Avec cette procédure, les chercheurs peuvent précisément comprendre la complexité de la néovascularisation HB et identifier la fonction de cette forme courante de l’angiogenèse dans HBs. Ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer la thérapie anti-vasculaire plus prometteur pour les tumeurs, qui a fort potentiel translationnel pour traitement de tumeurs, ou pour aider dans l’optimisation du traitement anti-angiogénique de HBs à l’avenir les traductions. Les résultats soulignent la complexité de la néovascularisation HB et suggèrent que cette angiogenèse forme commune est uniquement un mécanisme complémentaire dans la néovascularisation HB.

Introduction

Hémangioblastomes (HBs) sont des tumeurs vasculaires bénignes que l'on trouve exclusivement dans le système nerveux central (CNS) humain. Ils se développent dans les patients avec la maladie de von Hippel-Lindau (VHL) ou lésions sporadiques. VHL-HBs sont difficiles à guérir grâce à un traitement chirurgical en raison de la récurrence fréquente et lésions multiples qui résultent de cette génétique trouble¹. L’inactivation de la gène suppresseur de tumeur VHL a été considéré comme la cause première de la tumorigenèse de VHL-HBs, l’origine cytologique (y compris la néovascularisation) et le processus évolutif d’HBs restent largement controversée². Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques HB-néovasculaire peut fournir des indications utiles sur les stratégies anti-vasculaires les plus prometteuses pour VHL-HBs.

Une recherche récente a suggéré que HB-néovascularisation est semblable à la vasculogénèse embryologique^3,4,5. Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) classique-médiation angiogenèse issus de l’endothélium vasculaire et qui est entraînée par la perte de fonction VHL a entraîné la prolifération et néovasculaire formation, qui a été mis au défi⁶. En 1965, Cancilla et Zimmerman constaté, au microscope électronique, HBs provenant de l' endothélium⁷. Plus tard, il a été constaté que les cellules du stroma sont issues de vasoformative élément⁸. En 1982, Jurco et coll. ont découvert que les cellules du stroma sont d’origine endothéliale⁹. Donc, nous avons émis l’hypothèse que les cellules endothéliales vasculaires humaines sont les cellules d’origine de la néovascularisation-HB¹⁰. Bien qu’il soit préférable d’utiliser les cultures primaires de HB cellules dérivées des chirurgies patients VHL, nos recherches antérieures ont indiqué que les cultures primaires de HB ne sont pas stables, et des lignées cellulaires n’a pas peuvent être établie³. En outre, les cultures primaires dans l’environnement 3D ne pouvaient pas identifier l’origine cytologique de HB-la néovascularisation parce qu’elles incluent les progéniteurs des HB-vasculaire ingrédients^10,11. Par conséquent, dans un modèle classique et primitif des cellules endothéliales, les cellules endothéliales vasculaires humaines (HUVEC) pourraient servir d’un autre modèle cellulaire pour HBs.

Le test de germination sphéroïde est un nouveau modèle en tissu technique^12,13. Dans cet article, une 3D à base de collagène coculture système in vitro à l’aide de l’ellipsoïde test de germination a été développé, avec un objectif général est d’évaluer si l’angiogenèse tumorale classique existe en HBs, ainsi que son rôle dans HBs.

Protocole

Cette méthode a été réalisée conformément aux lignes directrices approuvées et réglementation de la recherche éthique Comité de l’hôpital Huashan, Université Fudan. Les mesures de sécurité standard correspondantes ont été suivis à chaque étape. Pour une présentation schématique, veuillez vous reporter à la Figure 1.

1. cellules de Culture et la construction plasmidique

1. Maintenir régulièrement les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) dans Dulbecco de l’aigle modifié (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 100 unités/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine dans un humidifié 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C.
2. PLKO.1 Digest plasmide avec ApaI et EcoRI pour la synthèse de shARN fragment. Assurez-vous que la séquence du vecteur de shARN VHL est CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴.
3. Ensuite, mélanger 20 système µΜ avant 5 µl d’oligo, 5 µL d’oligo reverse, 5 µL de NEB mémoire tampon 10 x et 35 µL de ddH₂O ensemble (le volume total est de 50 µL). Chauffer le mélange à 98 ° C pendant 4 min, lentement et laissez refroidir à la température de la pièce en quelques heures.
4. Ligaturer les oligos recuit et le plasmide PLKO.1 ainsi que de la ligase T4 à 4 ° C pour la nuit. 16 h plus tard, ajouter 5 µL du mélange de ligation dans 25 µL DH5α les cellules compétentes. Ensuite, les plasmides ligaturés avec succès de l’écran et vérifiez le fragment inséré par séquençage.

2. infection et paquet de lentivirus

1. Au total, mélanger 10 µg du vecteur PLKO.1-shVHL ou PLKO.1-shScramble, 7,5 µg d’emballage plasmide psPAX2 et 2,5 µg d’enveloppe plasmide pMD2.G dans 500 µL des médias DMEM sans sérum fœtal (SVF) pendant 25 min.
2. Ajouter 7 mLDMEM sans FBS à la solution préparée précédemment.
3. Culture de 293 cellules FT le DMEM sans FBS dans un plats de culture de tissus de 10 cm de diamètre. S’assurer que le nombre de cellules 293FT 1 x 10⁷ à l’aide d’un compteur de cellules.
4. Ajouter 1 mL de la solution préparée ci-dessus au milieu des cellules 293FT pour la transfection.
   Remarque : La lignée de cellules 293FT est dérivé de la lignée cellulaire 293F et stablement expriment l’antigène T grand SV40. Par conséquent, il est un hôte convenable pour la production des gènes.
5. Remplacer le milieu de culture avec le DMEM contenant 10 % FBS après 6 h.
6. Recueillir les médias à l’aide d’une pipette à 48 h après la transfection.
   Remarque : Le virus existe dans le DMEM contenant 10 % FBS. Les cellules mortes flottent sur le milieu. Membrane stérile de 0,45 µm permet de filtrer les cellules mortes et les impuretés. En règle générale, il n’y a pas besoin de vérifier la multiplicité d’infection (MOI). Il s’agit d’établir une ligne de cellules stables. Lors de la dernière étape, toutes les cellules vivantes sans infection réussie vont mourir par la puromycine. Le groupe shScramble et cellules HUVEC constituent le groupe de contrôle. Veiller à ce que toutes les cellules HUVEC mourir avec la concentration de puromycine utilisé après 72 h. Chaque cupule a le même nombre de cellules.
7. La culture des cellules HUVEC dans les médias des gènes pendant 72 h. Puis, ajoutez la puromycine aux médias des cellules HUVEC à une concentration de 2 µg/mL pour les cellules HUVEC utilisation 24 h sans aucun traitement dans le groupe témoin. Veiller à ce que tous les commande cellules meurent à ce moment-là.
   Remarque : Les cellules vivantes représentent une lignée cellulaire stable VHL cellules démontable et shSramble. La densité de placage est 5 000/puits dans les plaques à 96 puits.

3. génération des sphéroïdes de cellules endothéliales

1. Trypsinize les cellules HUVEC et remettre en suspension dans le milieu DMEM avec 10 % FBS. Avec un nombre modéré de cellules dans une boîte de Petri de 10 cm, ajouter 1 mL d’EDTA-typsin.
2. Les cellules dans une plaque à 96 puits fond rond 3D, à une densité cellulaire de 1 × 10³ cellules/puits de graines. Utiliser un puits pouvant accueillir un sphéroïde de 0,50 µL à suspendre l’ellipsoïde. Compter les cellules à l’aide d’un système de compteur de cellules suivant les instructions du fabricant.
3. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO₂ en continu pendant 72 h. Dans ces conditions, faire en sorte que les cellules en suspension forment les sphéroïdes cellule automatiquement. Remplacer la moitié du milieu de culture après 36 h.

4. test in vitro de l’angiogenèse

1. Décongeler la solution de gel à 4 ° C et le diluer avec le milieu de sérum réduit à un taux de dilution de 1:5.
2. Sucer les sphéroïdes DMEM milieu de culture avec une micropipette. Après avoir lavé les sphéroïdes avec 5 mL de milieu sérum réduit, suspendre les sphéroïdes doucement et prudemment dans le gel dilué. S’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air.
3. Incorporez 300 µL de liquide mélangé dans un plat de 15 puits. Après incubation à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 1 h, ajouter 400 µL de milieu sérum réduit dans chaque puits. Remplir d’eau stérile autour des puits pour générer un environnement humidifié pour empêcher l’évaporation.
4. Par la suite, la culture la plaque à 37 ° C à 5 % de CO₂ à 100 % d’humidité pendant 1 h.
5. Aspirer le vieux support avec précaution et remplacez-le par 600 µL de milieu de sérum réduit avec des suppléments de croissance des cellules endothéliales de le 1 % dans chaque puits.
6. Après 12 h ou 24h, prendre des photos sous un microscope inversé de lumière (40 *).

5. analyse

1. Télécharger les images sur une plateforme d’analyse en ligne d’image pour obtenir des données de longueur sprout (Table des matières).
2. Sur la page Web, créez un compte par email.
3. Puis télécharger les images en cliquant sur le bouton transférer.
4. Télécharger le résultat en cliquant sur le bouton Télécharger.
   Remarque : Le logiciel va générer l’image traitée et les données. Les données contiennent cinq parties : cumulatif germination, pousse moyenne longueur, l’écart de la longueur de la pousse, pousse et sphéroïde. Dans l’image traitée, chaque paramètre est décrit dans une couleur différente pour faciliter l’identification de l’image traitée : rouge représente les choux de squelette, jaune le nombre de germes, bleu la structure sprout, sprout blanc fin et orange sphéroïde.

Résultats

Images originales sont prises par microscopie inversée. Les images typiques du groupe témoin et du groupe VHL sont indiquées à la Figure 2-A1 et Figure 2-A2. La durée de germination du groupe témoin est plus courte que celle du groupe VHL.

Après avoir téléchargé les Images, la plateforme en ligne fournit des résultats d’ana...

Discussion

Récemment, plusieurs champs de recherche en biologie vasculaire ont été stimulées par l’étude de l' endothélium d’angiogénique¹⁵. Dans cet article, nous avons développé un sphéroïde endothélial germination technique comme modèle expérimental pour étudier la formation de vaisseaux qui provient de la perte du gène VHL de fonction dans les cellules endothéliales manipulés pour identifier les molécules de nouveaux candidats de la cascade d’angiogénique. Au meilleur de notre c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
human umbilical vein endothelial cell	Fudan IBS Cell Center	FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium	Gibco	11995040
fetal bovine serum	Gibco	26400044
PLKO.1-puro vector	Addgene	#8453
packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
3D round-bottom 96-well plates	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15-well plate	Ibidi	81501	Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight
endothelial cell growth supplements	Sciencell	#1052
10-cm culture dish	Corning	Scipu000813
Puromycin	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco	25200056
Automated Cell Counter System	BioTech
Image Analysis software	Winmasis		http://mywim.wimasis.com