Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In-vitro- Leistung von der vermeintlichen Hämangioblastom Neovaskularisation mit den Sphäroid sprießen Assay

Zusammenfassung

Dieser Beitrag stellt ein umfassendes Verfahren zur in Vitro zu bewerten, ob klassische Tumor-Angiogenese im Hämangioblastome (HBs) und ihre Rolle bei der HBs vorhanden ist. Die Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der HB-Neovaskularisation und deuten darauf hin, dass diese Form der Angiogenese nur einen ergänzenden Mechanismus in der HB-Neovaskularisation ist.

Zusammenfassung

Die Inaktivierung von der von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressor Gen spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Hämangioblastome (HBs) innerhalb der menschlichen Zentralnervensystem (ZNS). Jedoch die zytologische Herkunft und den evolutionären Prozess der HBs (einschließlich Neovaskularisation) bleiben umstritten und Anti-Angiogenese für VHL-HBs, basierend auf klassischen HB Angiogenese habe produziert enttäuschende Ergebnisse in klinischen Studien. Ein Haupthindernis für die erfolgreiche klinische Übersetzung des Anti-vaskuläre Behandlung ist der Mangel an ein gründliches Verständnis der Neovaskularisation in dieser vaskulären Tumor. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen ein umfassendes Verfahren zur in-Vitro zu bewerten, ob klassische Tumor-Angiogenese in HBs, sowie ihre Rolle bei der HBs vorhanden ist. Mit diesem Verfahren können Forscher genau verstehen die Komplexität der HB Neovaskularisation und die Funktion von dieser Form der Angiogenese in HBs erkennen. Diese Protokolle können verwendet werden, die vielversprechendste Anti-vaskuläre Therapie bei Tumoren, bewerten die translationale Potenzial für die Behandlung von Tumoren oder für die Unterstützung bei der Optimierung der Anti-angiogenen Behandlung für HBs in Zukunft Übersetzungen hat. Die Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der HB Neovaskularisation und legen nahe, dass dieses gemeinsame Form Angiogenese nur eine ergänzende Mechanismus in HB Neovaskularisation ist.

Einleitung

Hämangioblastome (HBs) sind gutartige vaskuläre Tumore, die ausschließlich im menschlichen Zentralnervensystem (ZNS) gefunden werden. Sie entwickeln sich bei Patienten mit von Hippel-Lindau (VHL) Erkrankung oder sporadische Läsionen. VHL-HBs sind schwer zu heilen durch chirurgische Behandlung durch die häufige Wiederholung und multiple Läsionen, die sich daraus genetische ergeben Störung¹. Obwohl die Inaktivierung von VHL Tumorsuppressor Gen die eigentliche Ursache der Tumorgenese von VHL-HBs angesehen wurde, bleiben die zytologische Ursprung (einschließlich Neovaskularisation) und evolutionären Prozess der HBs weitgehend umstritten². Daher kann ein besseres Verständnis der biologischen Mechanismen der HB-neovaskulären nützliche Einblicke in die vielversprechendsten Anti-vaskulären Strategien VHL-HBs vorsehen.

Neue Forschung hat vorgeschlagen, dass HB-Neovaskularisation, die embryologische Vaskulogenese^{3,4,5 ähnelt}. Klassische vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF)-vermittelten Angiogenese, entstand aus dem vaskulären Endothel und, angetrieben durch VHL Funktionsverlust, führte zu Verbreitung und neovaskulären Formation, die seit⁶in Frage gestellt. In 1965, Cancilla und Zimmerman gefunden, verwenden Elektronenmikroskopie, die das Endothel⁷HBs stammt. Später wurde festgestellt, dass Vasoformative Element⁸Stromazellen Zellen abgeleitet werden. 1982 fand Jurco Et Al. , dass Stromazellen Zellen von endothelialen Ursprungs-⁹. Daher vermutet wir, dass menschliche vaskuläre endotheliale Zellen der ursprünglichen Zellen von HB-Neovaskularisation¹⁰sind. Obwohl es besser, die Primärkulturen von HB Zellen aus VHL-Patienten Operationen zu verwenden ist, zufolge unserer bisherigen Forschung Primärkulturen von HB sind nicht stabil, und Zell-Linien könnte nicht etablierten³. Darüber hinaus könnte Primärkulturen in der 3D-Umgebung die zytologische Herkunft der HB-Neovaskularisation nicht erkennen, weil sie Vorfahren der HB-Kreislauf Zutaten^10,11enthalten. Daher, als primitiv und klassische Modell von Endothelzellen, konnte menschliche vaskuläre endotheliale Zellen (HUVECS) als ein alternatives zellulären Modell für HBs dienen.

Der Sphäroid Sprießende Assay ist ein neues Modell im Tissue engineering^12,13. In diesem Papier war ein 3D Kollagen-basierten Coculture System in Vitro mit den Sphäroid sprießen Assay entwickelt mit ein Gesamtziel zu beurteilen, ob klassische Tumor-Angiogenese in HBs, sowie ihre Rolle bei der HBs vorhanden ist.

Protokoll

Diese Methode wurde in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien und Vorschriften der Forschung Ethik Komitee von Huashan Krankenhaus, Fudan University durchgeführt. Entsprechende standard-Sicherheits-Maßnahmen wurden in den einzelnen Schritten gefolgt. Eine schematische Darstellung finden Sie in Abbildung 1.

(1) Zell-Kultur und Plasmid-Konstrukt

1. Routinemäßig pflegen die menschliche nabelader Endothelzellen (HUVECS) in Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100-Einheit/mL Penicillin und 100 µg/mL von Streptomycin in einer befeuchteten 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C.
2. PLKO.1 Plasmid ApaI mit EcoRI für die Synthese von ShRNA Fragment zu verdauen. Sicherstellen Sie, dass die Oligonukleotid-Sequenz von VHL ShRNA Vektor CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴.
3. Dann mischen Sie 20 µΜ System mit vorwärts 5 µL 5 µL reverse Oligo Oligo, 5 µL 10 x NEB Puffer und 35 µL DdH₂O zusammen (das Gesamtvolumen beträgt 50 µL). Erhitzen Sie die Mischung bei 98 ° C für 4 min, und langsam auf Raumtemperatur abkühlen, in ein paar Stunden.
4. Verbinden Sie die geglühten Oligos und PLKO.1 Plasmid zusammen mit T4-Ligase bei 4 ° C für eine Nacht. 16 h später hinzufügen 5 µL Ligatur-Mix in 25 µL kompetente DH5α Zellen. Dann Bildschirm erfolgreich aufgespaltenen Plasmiden, und überprüfen Sie die eingefügte Fragment durch Sequenzierung.

(2) Lentivirus Paket und Infektion

1. Insgesamt mischen Sie 10 µg des PLKO.1-ShVHL oder PLKO.1-ShScramble Vektors, 7,5 µg Plasmid psPAX2 zu verpacken und 2,5 µg Umschlag Plasmid pMD2.G in 500 µL der DMEM Medien ohne fetalen bovine Serum (FBS) für 25 min.
2. Fügen Sie 7 mLDMEM ohne FBS der Projektmappe bereit oben hinzu.
3. Kulturzellen Sie 293 FT in DMEM ohne FBS in einem Durchmesser von 10 cm Gewebekultur Gerichte. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Zellen 293FT 1 x 10⁷ Zelle Zähler.
4. Fügen Sie 1 mL der Lösung bereit, über das Medium der 293FT Zellen zur Transfektion.
   Hinweis: Die Zell-Linie 293FT 293F Zelllinie abgeleitet ist und stabil express das SV40 große T-Antigen. Daher ist es ein geeigneter Gastgeber für Lentivirale Produktion.
5. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit der DMEM mit 10 % FBS nach 6 h.
6. Sammeln Sie die Medien mit einer Pipette in 48 h nach Transfektion.
   Hinweis: Das Virus existiert in der DMEM mit 10 % FBS. Die abgestorbenen Zellen Schwimmen auf dem Medium. Verwenden Sie sterile Membran 0,45 µm, um abgestorbenen Zellen und Unreinheiten zu filtern. Im Allgemeinen gibt es keine Notwendigkeit, die Multiplizität der Infektion (MOI) zu überprüfen. Dies soll eine stabile Zellen-Linie zu schaffen. Im letzten Schritt werden alle lebenden Zellen ohne erfolgreiche Infektion durch Puromycin sterben. Die ShScramble Gruppe und HUVECS Zellen sind der Kontrollgruppe. Stellen Sie sicher, dass die HUVECS Zellen mit der verwendeten Puromycin Konzentration von 72 h sterben. Jeder Brunnen hat die gleiche Anzahl von Zellen.
7. Kultur der HUVECS Zellen in den Lentivirale Medien für 72 h. Fügen Sie Puromycin zu den Medien der HUVECS Zellen in einer Konzentration von 2 µg/mL für 24 Std. Einsatz HUVECS Zellen ohne Behandlung als die Kontrollgruppe. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen sterben bis zu diesem Zeitpunkt zu kontrollieren.
   Hinweis: Die lebenden Zellen repräsentieren eine stabile Zelllinie von VHL Knockdown Zellen und ShSramble Zellen. Die Beschichtung ist 5.000/Brunnen in 96-Well Platten.

3. Generation von Endothelzellen Sphäroide

1. Trypsinize die Mediumwechsel Zellen und Aufschwemmen mittelfristig DMEM mit 10 % FBS. Hinzugeben Sie mit einer moderaten Anzahl von Zellen in der Kulturschale von 10 cm 1 mL Typsin-EDTA.
2. Samen der Zellen in einem 3D Rundboden 96-Well-Platte in einer Zelle Dichte von 1 × 10³ Zellen/gut. Verwenden Sie einen Brunnen, der ein Sphäroid von 0,50 µL aussetzen der Sphäroid unterbringen kann. Anzahl Zellen mit einem Zellsystem Zähler nach den Anweisungen des Herstellers.
3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂ kontinuierlich für 72 h. Sicherzustellen Sie unter diesen Bedingungen, dass die suspendierten Zellen die Zelle Sphäroide automatisch bilden. Ersetzen Sie die Hälfte des Kulturmediums nach 36 h.

4. in-vitro- Angiogenese-Assay

1. Tauen Sie die Gel-Lösung bei 4 ° C auf und verdünnen Sie es mit dem reduzierten Serum Medium bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:5.
2. Saugen Sie die Sphäroide aus dem Kulturmedium DMEM mit einer Mikropipette. Nach dem Waschen aussetzen die Sphäroide mit 5 mL des Mediums reduzierte Serum der Sphäroide sanft und vorsichtig in das verwässerte Gel. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
3. 300 µL der gemischten Flüssigkeit in ein 15-Well-Platte einbetten. Fügen Sie nach der Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂ für 1 h 400 µL reduzierte Serum-Medium in jede Vertiefung hinzu. Füllen Sie steriles Wasser um die Brunnen zu erzeugen eine feuchte Umgebung um Verdunstung zu verhindern.
4. Danach die Platte bei 37 ° C in 5 % CO₂ bei 100 % Luftfeuchtigkeit für 1 h Kultur.
5. Vorsichtig Aspirieren Sie das alte Medium und ersetzen Sie es durch 600 µL reduzierte Serum-Medium mit 1 % Endothelzellen Ergänzungen in jede Vertiefung.
6. Nach 12 h oder 24 h, nehmen Bilder unter einem invertierten Lichtmikroskop (40 *).

(5) Datenanalyse

1. Laden Sie die Bilder, um eine Online-Bild-Analyse-Plattform sprießen Längendaten (Table of Materials) zu erhalten.
2. Erstellen Sie ein Konto auf der Webseite per e-Mail.
3. Dann laden Sie die Bilder durch Klicken auf die Schaltfläche "hochladen".
4. Herunterladen Sie das Ergebnis durch Klicken auf die Schaltfläche "Download".
   Hinweis: Die Software generiert das bearbeitete Bild und die Daten. Die Daten enthalten fünf Teile: kumulative sprießen, mittlere sprießen Länge, die Standardabweichung der Länge sprießen, Keimen und Sphäroid Bereich. In das bearbeitete Bild jeden Parameter sind zusammengefasst in einer anderen Farbe, Identifikation in das bearbeitete Bild erleichtern: Rot steht für Sprossen Skelett, Gelb die Anzahl der Sprossen, blau sprießen Struktur, weißen sprießen Ende und orange Sphäroid.

Ergebnisse

Originalbilder werden durch umgekehrte Lichtmikroskop getroffen. Die typische Bilder von der Kontrollgruppe und der VHL-Gruppe sind in Abbildung 2dargestellten-A1 und Abbildung 2-A2. Die Sprießende Länge der Kontrollgruppe ist kürzer als die der VHL-Gruppe.

Nach dem Hochladen der Bilder, bietet die Online-Plattform direkt Analyseerge...

Diskussion

Vor kurzem wurden mehrere Felder der vaskulären Biologie Forschung durch die Studie der angiogenen Endothel¹⁵stimuliert. In diesem Artikel, entwickelten wir eine endotheliale Sphäroid sprießen Technik als ein experimentelles Modell die Gefäß-Bildung zu studieren aus den Funktionsverlust des VHL-Gens in manipulierten Endothelzellen, neuartige Kandidaten Moleküle zu identifizieren die angiogenen Kaskade. Nach bestem Wissen und gewissen ist dies der erste Bericht der angiogenen Auswirkungen der...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
human umbilical vein endothelial cell	Fudan IBS Cell Center	FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium	Gibco	11995040
fetal bovine serum	Gibco	26400044
PLKO.1-puro vector	Addgene	#8453
packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
3D round-bottom 96-well plates	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15-well plate	Ibidi	81501	Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight
endothelial cell growth supplements	Sciencell	#1052
10-cm culture dish	Corning	Scipu000813
Puromycin	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco	25200056
Automated Cell Counter System	BioTech
Image Analysis software	Winmasis		http://mywim.wimasis.com