Всеобъемлющей процедуры для оценки производительности в Vitro предполагаемый Гемангиобластома неоваскуляризация, используя сфероида прорастания Assay

Резюме

Этот документ представляет собой всеобъемлющую процедуру для оценки в vitro классические опухоли ангиогенеза существует ли в гемангиобластомы (ХБС) и его роль в ОБД. Результаты подчеркивают сложность HB-неоваскуляризации и предполагают, что эта распространенная форма по ангиогенез только дополнительный механизм в HB-неоваскуляризации.

Аннотация

Инактивации ген-супрессор опухолевого фон Хиппель-Линдау (ВХЛ) играет решающую роль в развитии гемангиобластомы (ХБС) внутри человека центральной нервной системы (ЦНС). Однако цитологические происхождения и процесс эволюции HBs (включая неоваскуляризация) остаются спорными, и анти ангиогенеза для ВХЛ-HBs, основанный на классической HB ангиогенеза, дали неутешительные результаты в клинических испытаниях. Одним из основных препятствий для успешной клинической перевод анти сосудистой лечения является отсутствие глубокого понимания неоваскуляризация в этом сосудистые опухоли. В этой статье мы представляем всеобъемлющей процедуры для оценки в vitro классические опухоли ангиогенеза существует ли в ОБД, а также его роль в ОБД. С этой процедурой исследователи могут точно понять сложность HB неоваскуляризации и определить функции этой распространенной формой ангиогенеза в ОБД. Эти протоколы могут использоваться для оценки наиболее перспективных анти сосудистой терапии опухолей, который имеет высокий трансляционная потенциал для лечения опухоли либо пособничество в оптимизации лечения анти ангиогенных HBs в будущем переводы. Результаты подчеркивают сложность HB неоваскуляризации и предположить, что это общие формы ангиогенез-это только дополнительный механизм в HB неоваскуляризации.

Введение

Гемангиобластомы (ХБС) являются доброкачественные сосудистые опухоли, которые находятся исключительно в пределах человека центральной нервной системы (ЦНС). Они развиваются в больных с фон Хиппель-Линдау (ВХЛ) болезни или спорадические поражений. ВХЛ-HBs трудно вылечить путем хирургического лечения из-за частого повторения и несколько поражений, которые в результате этого генетические расстройства¹. Хотя инактивации ген-супрессор опухолевого ВХЛ рассмотрел причины tumorigenesis ВХЛ-HBs, цитологические происхождения (включая неоваскуляризация) и эволюционного процесса HBs остаются во многом спорные². Поэтому лучшее понимание биологических механизмов HB-неоваскулярной может дать полезную информацию в наиболее перспективных анти сосудистой стратегии для ВХЛ-HBs.

Недавние исследования показали, что HB-неоваскуляризация похож на эмбриологических vasculogenesis^3,4,5. Классический Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)-опосредованной ангиогенеза, возникла из эндотелия и что движет ВХЛ потеря функции привело к распространению и формирование неоваскулярной, которая была оспорена⁶. В 1965 году, Cancilla и Циммерман найдена, с помощью электронной микроскопии, что ХБС возникла из эндотелия⁷. Позже было установлено, что стромальных клеток являются производными от vasoformative элемент⁸. В 1982 году Jurco et al. обнаружил, что стромальных клеток эндотелия происхождения⁹. Таким образом мы предположили, что человеческого сосудистой эндотелиальные клетки являются оригинальные клетки HB-неоваскуляризация¹⁰. Хотя это лучше использовать основной культуры от HB клеток, полученных от пациентов хирургии ВХЛ, наши предыдущие исследования указал, что основной культуры от HB не являются стабильными и клеточных линий не может быть установленным³. Кроме того основных культур в 3D среде не может опознать цитологического происхождения HB-неоваскуляризация потому, что они включают в себя родоначальниками HB-сосудистой ингредиенты^10,11. Таким образом, как примитивные и классическая модель эндотелиальных клеток клеток человека сосудистого эндотелия (HUVEC) может служить альтернативной сотовой модели для HBs.

Прорастания пробирного сфероида представляет собой новую модель в ткани, инженерных^12,13. В этом документе, 3D на основе коллагена coculture системы в пробирке с помощью сфероида прорастания пробирного была разработана, с общей целью оценить классические опухоли ангиогенеза существует ли в ОБД, а также его роль в ОБД.

протокол

Этот метод был проведен в соответствии с утвержденными руководящими принципами и положениями исследовательской этики Комитета из Хуашань больницы, Университет Фудань. Соответствующий стандарт безопасности меры соблюдались в каждом шаге. Для схематического представления пожалуйста, обратитесь к рис.

1. клетки культуры и плазмидные конструкции

1. Постоянно поддерживать человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVEC) в Дульбекко модифицированная орла среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 единицы/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненные 5% CO₂ инкубатора в 37 ° C.
2. Дайджест PLKO.1 плазмиду с ApaI и EcoRI для синтеза индуцируемый фрагмента. Убедитесь, что последовательности олигонуклеотида ВХЛ индуцируемый вектора CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴.
3. Затем смешайте 20 µΜ системы с вперед 5 мкл oligo, 5 мкл обратный oligo, 5 мкл 10 x буфер НЭБ и 35 мкл ddH₂O вместе (общий объем-50 мкл). Нагрейте смесь на 98 ° С в течение 4 мин и медленно остыть до комнатной температуры в течение нескольких часов.
4. Перевязать отожженная oligos и PLKO.1 плазмиды вместе с T4 лигаза на 4 ° C для ночлега. 16 h позже, 5 мкл лигирование смеси в 25 мкл компетентным DH5α клетки. Затем экран успешно перевязаны плазмид и проверьте вставленного фрагмента путем sequencing.

2. Лентивирусы пакет и инфекции

1. В общей сложности Смешайте 10 мкг PLKO.1-shVHL или PLKO.1-shScramble вектора, 7.5 мкг упаковки плазмида psPAX2 и 2,5 мкг конверт плазмида pMD2.G в 500 мкл DMEM СМИ без плода бычьим сывороточным (ФБС) 25 мин.
2. Добавьте в раствор, приготовленный выше 7 mLDMEM без FBS.
3. Культура клетки 293FT в среде DMEM без FBS в блюдах культуры ткани диаметром 10-см. Убедитесь, что количество клеток 293FT 1 x 10⁷ , используя счетчик соматических клеток.
4. Добавьте 1 мл раствора, подготовленный выше средний 293FT клеток для transfection.
   Примечание: Клеточная линия 293FT является производным от линии клеток 293F и стабильно Экспресс SV40 большой T антигена. Таким образом это подходящий хост для лентивирусные производства.
5. Заменить культурной среде DMEM, содержащие 10% FBS через 6 ч.
6. Сбор средств массовой информации, с помощью пипетки на 48 ч после transfection.
   Примечание: Этот вирус существует в среде DMEM, содержащие 10% FBS. Мертвые клетки плавать на носителе. Используйте 0,45 мкм стерильным мембраны для фильтрации ороговевшие клетки и загрязнения. Как правило нет необходимости для проверки кратности инфекции (МВД). Это заключается в создании стабильной клеток линии. На последнем шаге все живые клетки без успешного инфекции умирают по puromycin. ShScramble группы и клеток HUVEC являются контрольной группы. Убедитесь, что все клеток HUVEC умереть с концентрацией используемых puromycin 72 ч. Каждый хорошо имеет такое же количество клеток.
7. Культура клеток HUVEC в лентивирусные СМИ за 72 ч. Затем добавьте puromycin к средствам массовой информации клеток HUVEC в концентрации 2 мкг/мл в течение 24 ч. Использование HUVEC клетки без какого-либо лечения как в контрольной группе. Убедитесь, что все управления клетки умирают на этот раз.
   Примечание: Живые клетки представляют собой стабильный клеток линии ВХЛ нокдаун клеток и shSramble клеток. Плотность покрытия 5000/хорошо в 96-луночных пластины.

3. поколение сфероидов эндотелиальных клеток

1. Trypsinize HUVECs клеток и Ресуспензируйте в среде DMEM с 10% FBS. С умеренным количеством клеток в культуре 10 см блюдо добавьте 1 мл typsin-ЭДТА.
2. Заполнение ячеек в 3D раунд-96-луночных днище, на плотность клеток 1 × 10³ клеток/скважины. Использование колодца, который может вместить сфероиде 0,50 мкл приостановить сфероида. Подсчет количества ячеек с помощью счетчика системы клеток следуя инструкциям производителя.
3. Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO₂ непрерывно в течение 72 ч. В этих условиях убедитесь, что подвесной клетки образуют сфероидов ячейки автоматически. Замените половину из питательной среды после 36 часов.

4. в vitro Assay ангиогенеза

1. Оттепель решения гелем на 4 ° C и разбавить его с сокращение сыворотке среднего на коэффициент разбавления 1:5.
2. Сосать сфероидов от DMEM питательной среды с микропипеткой. После мытья сфероидов с 5 мл среды, сокращение сыворотке, приостановить сфероидов мягко и осторожно в разреженных геля. Убедитесь, что нет пузырьков воздуха.
3. Внедрите 300 мкл смешанной жидкости в пластине 15-хорошо. После инкубации при 37 ° C и 5% CO₂ за 1 ч мкл 400 сокращение сыворотке среднего для каждой скважины. Заполните стерильной воды вокруг лунки для создания увлажненной среде затрудняет испарение.
4. После этого культура пластины при 37 ° C в 5% CO₂ при влажности до 100% за 1 ч.
5. Тщательно аспирационная старый среднего и заменить его 600 мкл сокращение сыворотке среды с 1% добавки рост эндотелиальных клеток в каждой скважине.
6. После 12 ч или 24 ч, принимать изображения под Перевернутый световой микроскоп (40 *).

5. анализ данных

1. Загрузите изображения на платформу анализа изображений в Интернете для получения рассады длина данных (Таблица материалов).
2. На веб-странице Создайте учетную запись по электронной почте.
3. Затем загрузите изображения, нажав кнопку Загрузить.
4. Скачайте результат, нажав кнопку Загрузить.
   Примечание: Программное обеспечение будет генерировать обработанные изображения и данные. Данные содержат пять частей: Накопительное Росток, длина средняя Росток, стандартное отклонение длины Росток, прорастают зона и зона сфероида. Обработанные изображения, каждый параметр изложена в другой цвет для облегчения идентификации обработанные изображения: красный представляет ростки скелета, желтый количество побегов, синий структура прорастают, конец белый прорастают и оранжевый сфероида.

Результаты

Исходные изображения принимаются Перевернутый световой микроскоп. Типичный изображения ВХЛ группы и группы управления показаны на рисунке 2-A1 и 2-A2. Прорастания длина контрольной группы короче, чем в группе ВХЛ.

Обсуждение

Недавно несколько полей сосудистая биология исследований были простимулированы изучение ангиогенных эндотелия¹⁵. В этой статье, мы разработали эндотелиальной сфероида прорастания техника как экспериментальная модель для изучения формирования судна, что происходит от г?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
human umbilical vein endothelial cell	Fudan IBS Cell Center	FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium	Gibco	11995040
fetal bovine serum	Gibco	26400044
PLKO.1-puro vector	Addgene	#8453
packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
3D round-bottom 96-well plates	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15-well plate	Ibidi	81501	Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight
endothelial cell growth supplements	Sciencell	#1052
10-cm culture dish	Corning	Scipu000813
Puromycin	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco	25200056
Automated Cell Counter System	BioTech
Image Analysis software	Winmasis		http://mywim.wimasis.com