Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay

Riepilogo

Questa carta presenta una procedura completa per valutare in vitro in esistenza l'angiogenesi del tumore classico nel hemangioblastomas (HBs) e del suo ruolo in HBs. I risultati evidenziare la complessità della HB-neovascolarizzazione e suggeriscono che questa forma comune dell'angiogenesi è solo un meccanismo complementare in HB-neovascolarizzazione.

Abstract

L'inattivazione del gene soppressore del tumore del von Hippel-Lindau (VHL) svolge un ruolo cruciale nello sviluppo dei hemangioblastomas (HBs) entro l'umano sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, sia l'origine citologica e il processo evolutivo di HBs (tra cui neovascolarizzazione) rimangono discutibili, e anti-angiogenesi per VHL-HBs, basato sul classico HB angiogenesi, hanno prodotto risultati deludenti in studi clinici. Uno dei principali ostacoli per il successo clinico di trattamento anti-vascolare è la mancanza di una conoscenza approfondita della neovascolarizzazione in questo tumore vascolare. In questo articolo, presentiamo una procedura completa per valutare in vitro se l'angiogenesi del tumore classico esiste in HBs, come pure il suo ruolo in HBs. Con questa procedura, i ricercatori possono accuratamente comprendere la complessità del neovascularization HB e identificare la funzione di questa forma comune dell'angiogenesi in HBs. Questi protocolli possono essere utilizzati per valutare la terapia anti-vascolare più promettente per i tumori, che ha alto potenziale traslazionale per trattamento di tumori o per aiutare nell'ottimizzazione del trattamento anti-angiogenico per HBs in futuro traduzioni. I risultati evidenziare la complessità della neovascolarizzazione HB e suggeriscono che questa comune forma l'angiogenesi è solo un meccanismo complementare in HB neovascolarizzazione.

Introduzione

Hemangioblastomas (HBs) sono tumori vascolari benigni che si trovano esclusivamente nell'ambito umano sistema nervoso centrale (CNS). Si sviluppano in pazienti con malattia di von Hippel-Lindau (VHL) o lesioni sporadiche. VHL-HBs sono difficili da curare attraverso trattamento chirurgico a causa della frequente ricorrenza e lesioni multiple che derivano da questo genetico disturbo¹. Sebbene l'inattivazione del gene soppressore del tumore VHL è stata considerata la causa principale di tumorigenesis di VHL-HBs, l'origine citologica (tra cui neovascolarizzazione) e il processo evolutivo di HBs rimangono in gran parte controverso². Di conseguenza, una migliore comprensione dei meccanismi biologici HB-neovascolare può fornire utili intuizioni più promettenti strategie anti-vascolare per VHL-HBs.

Recenti ricerche hanno suggerito che HB-neovascolarizzazione è simile alla vasculogenesi embriologica^3,4,5. Classico fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)-mediata angiogenesi che ha provenuto dall'endotelio vascolare e che è guidato da perdita VHL di funzione ha provocato la proliferazione e la formazione neovascolare, che è stato sfidato⁶. Nel 1965, Cancilla e Zimmerman trovato, usando la microscopia, HBs originata dal endotelio⁷. Più successivamente è stato trovato che le cellule stromal sono derivate da vasoformative elemento⁸. Nel 1982, Vladimír et al ha trovato che le cellule stromale sono di origine endoteliale⁹. Pertanto, abbiamo ipotizzato che le cellule endoteliali vascolari umane sono celle originali di HB-neovascularization¹⁰. Anche se è preferibile utilizzare le colture primarie da HB cellule derivate da pazienti ambulatori VHL, la nostra ricerca precedente indicato che colture primarie da HB non sono stabili, e linee cellulari non potevano essere stabilita³. Inoltre, le colture primarie nell'ambiente 3D non ha potevano identificare l'origine citologica della HB-neovascolarizzazione perché essi comprendono i progenitori di HB-vascolare ingredienti^10,11. Pertanto, come un modello classico e primitivo delle cellule endoteliali, cellule vascolari endoteliali (HUVEC) potrebbero servire come modello cellulare alternativo per HBs.

Il dosaggio di germogliatura sferoide è un nuovo modello in tessuto ingegneria^12,13. In questa carta, un 3D basati su collagene coculture sistema in vitro utilizzando la sferoide germogliatura dosaggio è stato sviluppato, con un obiettivo globale per valutare se l'angiogenesi del tumore classico esiste in HBs, come pure il suo ruolo in HBs.

Protocollo

Questo metodo è stato eseguito in conformità con le linee guida approvate e i regolamenti della ricerca etica Comitato di Huashan Hospital, Università di Fudan. Misure di sicurezza standard corrispondenti sono stati seguiti in ogni passo. Per una presentazione schematica, fare riferimento alla Figura 1.

1. cultura e costrutto plasmidico delle cellule

1. Gestire periodicamente delle cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC) in Dulbecco s modified medium dell'Aquila (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 unità/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina in un 5% umidificata incubatore a CO₂ a 37 ° C.
2. Digerire PLKO.1 plasmide con ApaI ed EcoRI per la sintesi del frammento di shRNA. Assicurarsi che la sequenza del oligonucleotide del vettore di shRNA VHL è CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴.
3. Quindi, mescolare 20 sistema di µΜ con avanti 5 µ l di oligo, 5 µ l di oligo inversa, 5 µ l di tampone di NEB 10x e 35 µ l di ddH₂O insieme (il volume totale è di 50 µ l). Riscaldare la miscela a 98 ° C per 4 min e lentamente raffreddare a temperatura ambiente in poche ore.
4. Legare i oligos ricotto e plasmide PLKO.1 insieme ligasi T4 a 4 ° C per una notte. 16 h dopo, aggiungere 5 µ l di mix di legatura in cellule DH5α competente di 25 µ l. Quindi, i plasmidi con successo legati a schermo e verificare il frammento inserito dall'ordinamento.

2. infezione e pacchetto lentivirus

1. In totale, mescolare 10 µ g del vettore PLKO.1-shVHL o PLKO.1-shScramble, 7,5 µ g di imballaggio plasmide psPAX2 e 2,5 µ g di busta plasmide pMD2.G in 500 µ l di media DMEM senza siero bovino fetale (FBS) per 25 min.
2. Aggiungere 7 mLDMEM senza FBS alla soluzione preparata in precedenza.
3. Cellule di cultura 293FT in DMEM senza FBS in piatti di coltura del tessuto un diametro di 10 cm. Assicurarsi che il numero delle cellule 293FT è di 1 x 10⁷ utilizzando un contatore di cellule.
4. Aggiungere 1 mL di soluzione preparata sopra al mezzo delle cellule 293FT per la transfezione.
   Nota: La linea cellulare di 293FT è derivato dalla linea cellulare 293F ed esprimere stabilmente il grande T antigene SV40. Pertanto, è un ospite adatto per la produzione di vettori lentivirali.
5. Sostituire il terreno di coltura con DMEM contenente 10% FBS dopo 6 h.
6. Raccogliere i media usando una pipetta a 48 h dopo la trasfezione.
   Nota: Il virus esiste in DMEM contenente 10% FBS. Le cellule morte galleggiano sul mezzo. Utilizzare sterile membrana da 0,45 µm per filtrare le cellule morte e le impurità. In generale, non c'è nessuna necessità di controllare la molteplicità di infezione (MOI). Si tratta di stabilire una linea di cellule stabili. Nell'ultima fase, tutte le cellule viventi senza successo infezione morirà da con puromicina. Il gruppo di shScramble e cellule HUVEC sono il gruppo di controllo. Garantire che tutte le cellule HUVEC morire con la concentrazione usata con puromicina 72h. Ogni pozzo ha lo stesso numero di celle.
7. Coltura le cellule HUVEC nei media lentivirali per 72 h. Quindi, aggiungere con puromicina ai media delle cellule HUVEC ad una concentrazione di 2 µ g/mL per 24 h. uso cellule HUVEC senza alcun trattamento come gruppo di controllo. Garantire che tutti controllare le cellule muoiono entro questo tempo.
   Nota: Le cellule viventi rappresentano una linea cellulare stabile delle celle di colpo di VHL e shSramble delle cellule. La densità di placcatura è 5.000/pozzetto in piastre da 96 pozzetti.

3. generazione di cellule endoteliali sferoidi

1. Tripsinizzano le cellule HUVEC e risospendere in mezzo DMEM con 10% FBS. Con un numero moderato di cellule in una piastra di coltura di 10 cm, aggiungere 1 mL di typsin-EDTA.
2. Le cellule in una piastra a 96 pozzetti fondo tondo 3D, ad una densità di cella di 1 × 10-³ cellule/pozzetto del seme. Utilizzare un pozzo che può ospitare uno sferoide di 0,50 µ l di sospendere la sferoide. Contare le celle utilizzando un sistema di contatore cellulare seguendo le istruzioni del produttore.
3. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO₂ continuamente per 72 h. In queste condizioni, garantire che le cellule sospese formano sferoidi cellulare automaticamente. Sostituire metà nel terreno di coltura dopo 36 h.

4. analisi di angiogenesi in vitro

1. Scongelare la soluzione di gel a 4 ° C e diluirlo con il mezzo di siero riduttore con un rapporto di diluizione di 1:5.
2. Succhiare gli sferoidi da terreno di coltura DMEM con una micropipetta. Dopo aver lavato le sferoidi con 5 mL di terreno riduttori del siero, sospendere le sferoidi delicatamente e con cautela nel gel diluito. Assicurarsi che non siano senza bolle d'aria.
3. Incorporare 300 µ l di liquido misto in una piastra 15-pozzetti. Dopo incubazione a 37 ° C e 5% CO₂ per 1 h, aggiungere 400 µ l il mezzo di riduttore del siero in ciascun pozzetto. Riempire di acqua sterile intorno ai pozzi per generare un ambiente umidificato per ostacolare l'evaporazione.
4. Da allora in poi, cultura la piastra a 37 ° C in 5% CO₂ al 100% di umidità per 1 h.
5. Attentamente il vecchio mezzo di aspirare e sostituirlo con 600 µ l di siero riduttore terreno con i supplementi di crescita delle cellule endoteliali di 1% in ogni pozzetto.
6. Dopo 12 ore o 24 ore, prendere le immagini sotto un microscopio ottico invertito (40 *).

5. analisi dei dati

1. Caricare le immagini su una piattaforma di analisi di immagine online per ottenere dati di lunghezza del germoglio (Tabella materiali).
2. Nella pagina Web, è necessario creare un account di posta elettronica.
3. Quindi è possibile caricare le immagini facendo clic sul pulsante carica.
4. Scaricare il risultato cliccando sul pulsante Scarica.
   Nota: Il software genererà l'immagine elaborata e i dati. I dati contengono cinque parti: cumulativo germoglio, germoglio di media lunghezza, la deviazione standard della lunghezza del germoglio, germoglio e sferoide area. Nell'immagine elaborata, ogni parametro è delineato in un colore diverso per semplificare l'identificazione nell'immagine elaborata: germogli di rosso rappresenta lo scheletro, giallo il numero di germogli, blu la struttura germoglio, germoglio bianco fine e arancia sferoide.

Risultati

Immagini originali vengono prese dal microscopio ottico invertito. Le immagini tipiche del gruppo di controllo e del gruppo VHL sono mostrate nella Figura 2-A1 e Figura 2-A2. La lunghezza di germogliatura del gruppo di controllo è inferiore a quella del gruppo di VHL.

Dopo aver caricato le immagini, la piattaforma online fornisce diret...

Discussione

Recentemente, più campi di ricerca di biologia vascolare sono stati stimolati dallo studio dell' endotelio angiogenici¹⁵. In questo articolo, abbiamo sviluppato uno sferoide endoteliale germogliatura tecnica come modello sperimentale per studiare la formazione del vaso che proviene dalla perdita del gene VHL di funzione in cellule endoteliali manipolate identificare molecole candidate romanzo della cascata angiogenica. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo rapporto per esaminare g...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
human umbilical vein endothelial cell	Fudan IBS Cell Center	FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium	Gibco	11995040
fetal bovine serum	Gibco	26400044
PLKO.1-puro vector	Addgene	#8453
packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
3D round-bottom 96-well plates	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15-well plate	Ibidi	81501	Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight
endothelial cell growth supplements	Sciencell	#1052
10-cm culture dish	Corning	Scipu000813
Puromycin	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco	25200056
Automated Cell Counter System	BioTech
Image Analysis software	Winmasis		http://mywim.wimasis.com