具有量身定做多样性的合成噬菌体展示库的构建

摘要

本议定书描述了一个详细的程序, 以构建一个噬菌体显示合成抗体库, 具有量身定做的多样性。合成抗体具有广泛的应用, 从基础研究到疾病诊断和治疗。

摘要

基础研究和医学中单克隆抗体 (抗体) 的需求逐年增加。自1975年第一次报告以来, 杂交瘤技术一直是单克隆抗体发展的主要方法。作为一种替代技术, 噬菌体显示方法为单克隆的发展越来越有吸引力, 因为 Humira, 第一种噬菌体抗体和最畅销的抗体之一, 被批准用于临床治疗类风湿关节炎在2002年。噬菌体展示作为一种非动物性的单克隆技术, 它绕过了传统的基于杂交瘤技术的抗体开发所需要的抗原免疫原性、人性化和动物维护。在本协议中, 我们描述了一种构建的合成噬菌体显示的工厂图书馆的多样性 10⁹-10¹⁰获得单电穿孔。本协议包括: 1) 高效电控细胞制剂;2) 提取含尿单链 DNA (杜 ssDNA);3) 基于寡核苷酸定向诱变的安德鲁·库恩克尔方法;4) 电穿孔及库尺寸计算;5) 蛋白质 A/l-基酶联免疫吸附试验 (ELISA) 用于折叠和功能多样性评价;和 6) DNA 序列分析的多样性。

引言

抗体具有广泛的应用范围, 从基础研究到疾病诊断和治疗。截至 2016年, 美国食品药品监督管理局 (USFDA) 批准了60多抗体, 用于临床治疗自身免疫性疾病、癌症和传染性疾病^1,2。

在 1975年, 科勒和米尔斯坦报告了一种技术, 连续产生抗体的单一克隆特异性从细胞源称为 ' 杂交瘤 ', 这一技术后来成为医药和工业的基石 3 ^,4。这种方法产生的抗体需要各种步骤, 包括抗原生产、小鼠免疫、b 淋巴细胞的提取、b 细胞与骨髓瘤细胞的融合, 形成不朽的杂交瘤细胞、克隆选择和治疗应用,人性化是需要避免人类抗鼠抗体 (哈马)^4,5。然而, 对于这种技术, 抗原, 包括毒素, 病原体和高度保守的蛋白质是相对无效的触发体内免疫应答的单克隆生产⁵。

在 1978年, 和记黄埔et报告使用寡核苷酸直接诱变的残留在单链噬菌体病毒⁶。在 1985年, 史密....

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研究方案

注: 过滤无菌提示必须在处理噬菌体时使用, 以避免污染的吸管枪和周围地区。在处理细菌和噬菌体实验时, 必须使用无菌区或罩。噬菌体实验区必须使用2% 的月桂酸钠 (SDS), 其次是70% 乙醇, 以避免噬菌体污染。对于在本协议中进行串行稀释, 每个稀释都应使用新的提示。

1.大肠杆菌SS320 电子主管细胞制剂

1. 预热的 LB/新年琼脂盘 (准备和储存在4°c 小于1周) 在37°c 孵化器为 1 h. 使用无菌接种循环或无菌提示, 将一只甘油 (大肠杆菌) SS320 细胞在总监的前预热的 LB/新年琼脂板上。轻轻地沿着盘子的表面。在37摄氏度孵化箱里孵化出一夜约12-15 小时的盘子。
2. 第二天, 使用无菌接种回路或无菌尖端选择一个分离良好的单一群体沿曲折线, 并接种到10毫升的 2, 在一个50毫升的圆底管通过浸渍循环到培养基中, 并简要搅拌。
3. 孵育在37°c 与震动在200转每分钟大约3-4 小时直到 OD₆₀₀到达在大约 0.4-0.8 (日志阶段增长)。监视 OD₆₀₀ at 2 小时。在这期间, 预热的5磅/年的琼脂板 (准备和储存在4°c 小于1周) 在37°c 孵化器至少 1 h。
4. 添加 20 ul M13KO7 帮助噬菌体从实验室库存约 1 x 10¹³菌落形成单元 (cfu)/毫....

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结果

按照工厂库结构的流程图 (参见图 1), 我们准备了 M13KO7 帮助噬菌体预感染的大肠杆菌SS320 电子主管细胞。当使用 phagemid 库构造骨干 (图 4) 时, 这些电子主管单元的效率估计为 2 X 10⁹ cfu/µg。

通过对大肠杆菌CJ236 和大肠杆菌SS320 细胞的效价比较, 尿合并效率.......

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讨论

构建高多样性、噬菌体展示的工厂图书馆, 需要质量控制检查点来监测施工过程的各个阶段, 包括电控细胞的能力、ssDNA 模板的质量、效率dsDNA 合成、电穿孔后滴度、晶圆折叠、CDRs 氨基酸多样性的序列分析。

ssDNA 的高产和纯度是高诱变率的必要条件。在我们的经验, 噬菌体诱导在25°c 隔夜可以产生更多的杜 ssDNA 比从噬菌体诱导在37摄氏度过夜。这与以前的报表^19<.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
1.0 M H3PO4	Fisher	AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0	Invitrogen	15568-025
10 mM ATP	Invitrogen	18330-019
100 mM dithiothreitol	Fisher	BP172
100 mM dNTP mix	GE Healthcare	28-4065-60	solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)	Kirkegaard & Perry Laboratories Inc	50-76-02
50X TAE	Invitrogen	24710030
Agarose	Fisher	BP160
Carbenicillin, carb	Sigma	C1389	100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp	Sigma	C0378	100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Invitrogen	AM9620G
Granulated agar	VWR	J637-500G
H2O2 peroxidase substrate	Kirkegaard & Perry Laboratories Inc	50-65-02
K2HPO4	Sigma	795488
Kanamycin, kan	Fisher	AC61129	50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4	Sigma	P2222
Na2HPO4	Sigma	94046
NaCl	Alfa Aesar	U19C015
Nanodrop	Fisher	ND2000C
NaOH	Fisher	SS256	! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk	Sangon Biotech	A600669
PEG-8000	Fisher	BP233
Protein A-HRP conjugate	Invitrogen	101123
QIAprep Spin M13 Kit	Qiagen	22704
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28706
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Recombinant Protein L	Fisher	77679
T4 DNA polymerase	New England Biolabs	M0203S
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S
T7 DNA polymerase	New England Biolabs	M0274S
Tetracycline, tet	Sigma	T7660	50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone	Fisher	0123-07-5
Tween-20	Sigma	P2287
Ultrapure glycerol	Invitrogen	15514-011
Uridine	Sigma	U3750	25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract	VWR	DF0127-08
Name	Company	Catalog Number	Comments
Strains
E.coli CJ236	New England Biolabs	E4141	Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320	Lucigen	60512	Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7	New England Biolabs	N0315S
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette	BTX
96-well 2mL Deep-well plates	Fisher	278743
96-well Maxisorp immunoplates	Nunc	151759
Baffled flasks	Corning
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5811000096
Centrifuge bottles	Nalgene
ECM-630 electroporator	BTX
Magnetic stir bars	Nalgene
Thermo Fisher centrifuge	Fisher
High speed shaker	TAITEK	MBR-034P
Microplate shaker	QILINBEIER	QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells	RAININ
Mutil-channel pipette	RAININ	E4XLS
Amicon concentrator	Merck	UFC803096