JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט להקמת ספרייה המוצג phage נוגדן סינתטי עם גיוון מחויטת. נוגדנים סינתטי יש יישומים רבים של מחקר בסיסי אבחון המחלה, הרפוי.

Abstract

הביקוש נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) מחקר בסיסי ורפואה הולך וגדל מדי שנה. ליפידים הטכנולוגיה כבר השיטה הדומיננטית לפיתוח mAb מאז את הדו ח הראשון שלה בשנת 1975. כמו טכנולוגיה חלופית, שיטות תצוגה phage לפיתוח mAb הן יותר ויותר אטרקטיבי מאז Humira, הנוגדן הראשון נגזר phage ואחד mAbs הנמכר, אושרה לטיפול קליני של דלקת מפרקים שגרונית בשנת 2002. חיה-שאינו מבוסס טכנולוגיית פיתוח mAb, התצוגה phage עוקף אנטיגן immunogenicity, האנשה ותחזוקה בעלי חיים הדרושים של ליפידים מסורתי המבוסס על טכנולוגיית פיתוח נוגדן. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבנייה של ספריות Fab המוצג phage סינתטי עם הבדלים של 109-1010 השגה עם אלקטרופורציה יחיד. פרוטוקול זה מורכב: 1) הכנה תא אלקטרו-המוסמכת יעילות גבוהה; 2) הפקת המכילות אורציל דנ א חד גדילי (דו-ssDNA); 3) השיטה של Kunkel המבוסס על oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת; 4) אלקטרופורציה, חישוב של גודל הספרייה; 5) חלבון מבוססת על A/L מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) לקיפול והערכה פונקציונלי; ו- 6) ניתוח רצף הדנ א של גיוון.

Introduction

mAbs יש שימושים רחב החל מחקר בסיסי אבחון המחלה, הרפוי. נכון לשנת 2016, mAbs יותר מ- 60 אושרו על ידי ארצות הברית המזון סמים המינהל (USFDA) לטיפול קלינית של מחלות אוטואימוניות, סרטן, מחלות זיהומיות1,2.

בשנת 1975, קולר, מילשטיין דיווח טכניקה לדור רציפה של נוגדנים היחודיות המשובטים יחיד ממקור הסלולר המכונה 'hybridomas', טכניקה זו לאחר מכן הפכה לאבן פינה ברפואה ובתעשייה3 ,4. דור של mAbs בשיטה זו דורש צעדים שונים כולל ייצור אנטיגן, חיסון עכבר, מיצוי של B לימפוציטים, פיוז'ן של תאי B עם תאי מיאלומה כדי ליצור תאים ליפידים בן אלמוות, שיבוט בחירה, ליישומים טיפוליים, האנשה נדרש להימנע אנטי-העכבר אנושית נוגדנים (חמה)4,5. עם זאת, לטכנולוגיה הזו, אנטיגנים כולל רעלנים, פתוגנים של חלבונים גבוהה שנשמרת אינם יעילים יחסית מפעילה ויוו תגובה חיסונית mAb הפקה5.

בשנת 1978, האצ'יסון. et al. דיווח על השימוש oligonucleotide ישירה מוטגנזה מכוונת של משקע וירוס חד גדילי bacteriophage6. בשנת 1985, סמית דיווחו שברי גנים זרים יכולים להיות התמזגו במסגרת עם הגן קידוד phage המעיל החלבון השלישי ובכך ניתן להציג על פני phage מבלי להתפשר על שלה infectivity7. אלה חלוצי עבודות הניח בסיס לבנייה עוקבות של נוגדן המוצג phage בספריות תמים החיסון, וטפסים סינתטיים עם התבניות של המקטע משתנה יחיד-שרשרת (scFv) וגם אנטיגן מחייב פרגמנט (Fab) עבור טיפולית mAb פיתוח8,9. מ מנקודת מבט טכנית, פיתוח נוגדן מבוסס התצוגה phage מציעה גישה המשלימה לפיתוח מבוסס-ליפידים mAb שיכול לעזור לעקוף את המגבלות שאנטיגנים מסוימים יכול להוות, האנשה לעבד את זה ליפידים-derived נוגדנים לעיתים קרובות דורשים5. החל 2016, mAbs, נגזר תצוגה ל- 6 phage אושרו במשק לרבות Humira, לאחד mAbs המצליח ביותר משמש לטיפול בדלקת מפרקים שגרונית, מועמדים רבים של נוגדן נגזר התצוגה phage הינם כרגע בשלבים שונים של ניסויים קליניים החקירה10.

לספריות החיסון ותמימה phage נוגדן, המגוון של משלימים את החסר-קביעת אזורים (Cdr) בשרשרת קל וכבד נגזר מן הרפרטואר החיסון הטבעי (כלומר, מתאי B). לעומת זאת, המגוון של Cdr בספריות נוגדן phage סינתטית היא מלאכותית לחלוטין. גישות סינתטי בניית הספרייה לספק שליטה מדויקת על העיצוב של רצף גיוון להציע הזדמנויות ללימודים מכניסטית של נוגדן מבנה, לתפקד11,12. יתר על כן, ניתן למטב את המסגרת עבור ספריות סינתטי לפני הבנייה הספריה כדי להקל על במורד הזרם, בפיתוח תעשייתי רחב היקף11,12.

בשנת 1985, Kunkel דיווח בגישה מוטגנזה מכוונת המבוססים על תבנית חד גדילי הדנ א (ssDNA) כדי להציג את האתר מכוון מוטציות לתוך M13 bacteriophage ביעילות13. גישה זו היה שימוש נרחב לאחר מכן להקמת ספריות phage המוצג. Oligonucleotides DNA מסונתז כימית שנועד להציג את המגוון לתוך Fab Cdr משולבים של phagemid עם תבנית עמוד השדרה של נוגדן. בתהליך זה, phagemid מבוטאת ssDNA המכילים אורציל (דו-ssDNA), oligonucleotides הם annealed אל Cdr והרחבה לסנתז DNA גדילי כפול (dsDNA) בנוכחות T7 DNA פולימראז ו T4 DNA ליגאז. לבסוף, ds-DNA שנוצר יכול להיות מוחדרים Escherichia coli מאת אלקטרופורציה.

גיוון גבוהה, ספריית המוצג phage הבנייה, מתח גבוה אלקטרופורציה תערובת שני תאים אלקטרו-מוסמך, covalently dsDNA עגול סגור (CCC-dsDNA) צריך להיות מוכן בקפידה. . Sidhu et al. ששינה את הכנת תאים אלקטרו-המוסמכת ודנ א שיטות מסורתיות, ספריה משופרת באופן משמעותי גיוון14.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבנייה של ספריות Fab המוצג phage סינתטי עם הבדלים של 109-1010 השגה עם אלקטרופורציה יחיד. איור 1 מציג סקירה של ספריית הבנייה כולל: 1) הכנה תא אלקטרו-המוסמכת יעילות גבוהה; 2) הפקת דו-ssDNA; 3) השיטה של Kunkel המבוסס על oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת; 4) אלקטרופורציה, חישוב של גודל הספרייה; 5) חלבון A/L-מבוסס אליסה לקיפול והערכה פונקציונלי; ו- 6) ניתוח רצף הדנ א של גיוון. כל ריאגנטים, זנים, ציוד מפורטים בטבלה של החומר. טבלה 1 מציגה את הכיוונון מגיב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: מסנן סטרילי טיפים יש להשתמש בכל רחבי בהתמודדות עם phage כדי למנוע הדבקות פיפטה האקדח וסביבתה. באזור aseptic או הוד חייב לשמש בעת טיפול עם חיידקים, phage ניסויים. אזור ניסוי phage יש לנקות באמצעות 2% dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) ואחריו אתנול 70% כדי למנוע זיהום phage. עבור ביצוע דילולים טורי פרוטוקול זה, עצות חדשות אמור לשמש לכל דילול.

1. e. Coli SS320 תא אלקטרו-המוסמכת הכנה

  1. חם מראש צלחת אגר ליברות/ט (מוכן ומאוחסן ב 4 ° C עבור פחות מ- 1 - בן שבועיים)-37 מעלות צלזיוס חממה עבור ה 1 להשתמש לולאה חיסון סטרילי או עצה סטרילי כדי פס החוצה מניה גליצרול של e. coli SS320 כדוריות על צלחת אגר ליברות/ט מראש ומחוממת direc זיג-זג tion בעדינות לאורך פני השטח של הצלחת. דגירה לצלחת-חממה 37 ° C בלילה עבור בסביבות 12-15 h.
  2. למחרת, השתמש לולאה חיסון סטרילי או עצה סטרילי כדי לאסוף מושבה בודדת מופרדים היטב לאורך הקו זיג-זג ואת לחסן לתוך 10 מ"ל של מדיום 2YT/ט בצינור תחתית עגולה 50-mL חיטט הלולאה המדיום, זע בקצרה.
  3. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות ב rpm 200 עבור בסביבות 3-4 h עד OD600 הוא הגיע ב בסביבות 0.4-0.8 (יומן שלב הצמיחה). צג OD600 ב- 2 h. במהלך תקופה זו, לחמם 5 פלטות אגר ליברות/ט (מוכן ומאוחסן ב 4 ° C עבור פחות מ- 1 - בן שבועיים) בחממה 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
  4. להוסיף 20 μL M13KO7 עוזר phage במלאי המעבדה עם כייל נוגדנים בסביבות 1 x 1013 המושבה ויוצרים יחידה (cfu) /mL לתוך μL 180 עקר 1 X PBS בלוק 1.5-mL צינורות להכין 10 דילולים טורי ten-fold.
  5. Aliquot 4 mL 2YT בלוק, נוזלי אגר העליונה לתוך 5 X 14 מ ל סביב צינורות התחתון, תווית כל שפופרת עם דילול אחת החל מהמאה החמישית עד התשיעי של דילול ten-fold, בהתאמה, דגירה ב חממה 65 ° C כדי לשמר את 2YT אגר העליון במצב נוזלי.
  6. 500 מיקס μL קטע יומן e. coli SS320 תאים לתוך הצינור דילול M13KO7 (לבחור החמישי דילול ten-fold כדי התשיעית דילול ten-fold) דגירה ב חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
  7. במהלך שלב 1.6, להעביר 2YT העליון אגר מ שלב 1.5 לטמפרטורת החדר (RT) כדי להתקרר למשך בערך 5 דקות כדי כ 42 מעלות צלזיוס. השתמש היד הפנימית כדי לבדוק את הטמפרטורה של אגר העליון 2YT; זה צריך להישאר כמו נוזל. העברה כל דילול תערובת מהשלב 1.5 כל שפופרת אגר העליון 2YT המתאימים. להדק את המכסה של כל שפופרת ומערבבים על ידי מתהפך מספר פעמים בעדינות, בקצרה כדי למנוע בועה הדור.
  8. בזהירות שופכים את כל התערובת לאורך הקצה של צלחת אגר ליברות/ט חמה מראש (מתוך שלב 1.3), הטה את הצלחת מעט כדי לחלוטין ובצורה שווה למלא את הצלחת עם התערובת תוך הימנעות המבוא של בועות. שמור את הצלחות ב- RT בסביבות 5-10 דקות כדי לחזק את אגר העליון בתוך כל צלחת, דגירה הלוחות המובילים אגר 2YT ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עבור בסביבות 15-18 h.
  9. בחר את הצלחת דילול לאחר צמיחה לילה מ שלב 1.8 עם סביב 100-200 שלטי בינוניות, יחיד, מופרדים היטב עבור חיסון פלאק. להשתמש ביד אחת כדי להחזיק את הצלחת אגר נגד מקור אור, ואת היד השנייה לאחוז בנשק פיפטה נטען עם טיפ פיפטה זמן סטרילי אנכית לדקור לתוך אגר העליון, ולאסוף את שלט יחיד, מופרדים היטב.
    1. שיפוע-הטיפ פיפטה מעט כדי להפריד בין אגר העליון עם שלט. פיפטה לאורך מספר פעמים להוציא את אגר עם רובד לתוך צינור תרבות התחתון עגול 14-mL טעון מראש עם 1 מ ל 2YT/קאן/ט בינוני (ראה טבלה 1).
    2. חזור על הליך זה כדי בוחר הפלאק 3-5 סה. מטרת בוחר הפלאק מספר נועד להבטיח חיסון מוצלחת, כמו שלט יכול להיות חלש ועייף קטן יחסית בהשוואה מושבת חיידקים. לגדול הפלאק עבור 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
  10. העברת שפופרת של תרבות. גודלים 50 מ של 2YT/קאן/ט בינוני בבקבוקון במבוכה 250 מל. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד בן לילה עבור בסביבות 12 שעות.
  11. לחסן שלושה 2-L במבוכה מבחנות המכילות 900 מל superbroth/ט/קאן בינוני לכל 5 מ של התרבות לילה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד במשך 6-7 h כדי OD600 סביב 0.6-0.8.
  12. מקררים שלוש המבחנות התרבות חיידקי באמבט קרח במשך חמש דקות עם עדינה מתמדת מתערבל בעבודת יד. השלבים הבאים צריך להיעשות בחדר קר, על קרח, עם פתרונות prechilled וציוד.
  13. השתמש ספיגת רקמת מגבת לייבוש הזכוכית החיצונית של כל הבקבוק; השתמש יד אחת כדי להטות את הבקבוק צנטריפוגה בלוק 1-L על הספסל ואת היד השנייה לשפוך האמצעי בעדינות את הבקבוק כל לתוך כל בקבוק צנטריפוגה.
  14. ספין ב 5000 g × ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות הצניפה החיידק.
  15. בעקבות צנטריפוגה, decant בעדינות את תגובת שיקוע לתוך גביע פסולת בלוק 5-L.
  16. למלא כל בקבוק עם 100 מ של סטרילי-מסוננים 1.0 מ מ HEPES, pH 7.4, ולהוסיף בר בלוק מערבבים מגנטי כל בקבוק כדי לסייע resuspension צנפה-200 סל ד. מערבולת ועוקרות בגדר כולו מהקיר בקבוק בכל מספר דקות במהלך בחישה מגנטית. ברגע בגדר התפרקה, למלא כל בקבוק 400 מיליליטר סטרילי-מסוננים 1.0 מ מ HEPES, pH 7.4 נוספים.
  17. צנטריפוגה ב 5000 g × ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות Decant תגובת שיקוע, שמירה על הבר מערבבים בבקבוק.
  18. חזור על שלבים 1.16 כדי 1.17 פעם אחת.
  19. Resuspend כל גלולה ב 500 מ"ל של 10% סטרילי-מסוננים, הנדסה גנטית גליצרול בעזרת פסי מערבבים. מערבולת ועוקרות בגדר כולו מהקיר בקבוק בכל מספר דקות במהלך בחישה מגנטית.
  20. צנטריפוגה, decant כמו שלב 1.17. חזור על שלב 1.19 פעם אחת. להשתמש מלקחיים בלוק ארוך מסעדים כדי להסיר הבר מערבבים.
  21. צנטריפוגה-5000 × g ו 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות Decant תגובת שיקוע ולהסיר עקבות הנותרים של תגובת שיקוע כל בקבוק צנטריפוגה עם פיפטה.
  22. להוסיף מ 3.0 ל 10% גליצרול הנדסה גנטית בקבוק אחד, בעדינות resuspend בגדר על-ידי pipetting. להעביר את המתלים של הבקבוק הבא וחזור עד כל של כדורי resuspended, בשילוב בבקבוק אחד. כ- 6 מ של תאים מרוכז מתקבלים עם כייל של בערך 3 x 1011 cfu/mL.
  23. מראש מקררים microcentrifuge בלוק 1.5-mL צינורות, שפופרת 96-ובכן אחת תיבת אחסון ללא חוצצים ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה לפני צעד זה. העברת הצינורות microcentrifuge מראש צוננת החדר הקרה על הקרח לפני pipetting aliquots של ההשעיה צניפה תא. השתמש פיפטה כדי aliquot μL 350 תא השעיה לתוך כל שפופרת microcentrifuge 1.5 mL.
  24. להעביר את aliquots לתוך הקצף תיבת מיכל מלא עם חנקן נוזלי עבור פלאש קפוא (3-5 דקות).
    1. להעביר את תיבת קצף עם חנקן נוזלי כדי מקפיא-80 ° C (ראה שלב 1.23).
    2. הסר את תיבת אחסון של צינור 1.5-mL microcentrifuge מהמקפיא-80 ° C (ראה שלב 1.23) ולשים על קרח.
    3. להשתמש במהירות מתכת רשת שינוי כדי ניפוי aliquots של חנקן נוזלי ומניחים אותם בתיבת אחסון שפופרת. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
      התראה: חנקן נוזלי יכול לגרום לכוויות, חייבים להקפיד על הגנה בטיחות. השתמש phagemid של עמוד השדרה Fab כדי לבדוק את היעילות של תאים אלקטרו-המוסמכת מוכן (עמוד השדרה ללונג phagemid המניה צריך להיות במים (MilliQ) הנדסה גנטית ב 400 ng/µL). הפשרת μg 1 של phagemid עמוד השדרה Fab במים הנדסה גנטית µL 10 ו aliquot 350 μL של SS320 אלקטרו-המוסמכת על קרח, prechill cuvette אלקטרופורציה הפער 0.2 ס מ על קרח.
  25. להוסיף μL 350 תאים אלקטרו-כשיר SS320 ה-DNA 10 µL לאחר מפשיר ומערבבים על ידי pipetting מספר פעמים תוך כדי שמירה על תערובות על קרח. הימנע היכרות עם בועות.
  26. לחמם 15 מ"ל של מדיום SOC בשפופרת 50-mL באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות לפני אלקטרופורציה. להעביר את התערובת 360 μL cuvette ולבצע אלקטרופורציה ההוראות של היצרן.
  27. מיד להציל את התאים לאחר אלקטרופורציה על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום SOC ומחוממת מראש (מתוך שלב 1.27) pipetting. להעביר את המדיום cuvette בקבוקון 125-mL טעון מראש עם 5 מ של מספר הביטוח הלאומי מראש ומחוממת
  28. לשטוף את cuvette פעמיים, כל פעם עם 1 מ"ל של מדיום SOC מראש ומחוממת ו להעביר בינוני את הבקבוק 125 מ"ל (ראה שלב 1.27). להוסיף בינוני SOC מראש ומחוממת נפח סופי של 10 מ"ל עד הבקבוק 125-mL.
  29. דגירה התרבות התא 10-mL במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
  30. להפוך דילולים טורי כדי לקבוע את יעילות תרביות תאים ואת שיעור ההידבקות טרום M13KO7.
    1. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 180 μL של התקשורת 2YT כל טוב של עמודה יחידה של צלחת 96-microwell.
    2. להפוך 8 פי עשרה טורי דילולים: להעביר 20 μL של תרבות צעד 1.29 הבאר הראשונה של הצלחת, מיקס על ידי pipetting ולאחר להעביר 20 μL של התערובת הבא. טוב. חזור על שלב זה עד הסוף של דילול טורי.
    3. צלחת 10 μL של כל דילול טורית על לוחות ליברות/פחמימות, ליברות/קאן ו LB/ט ב כפילויות.
    4. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    5. נוסחת חישוב יעילות: בהנחה M הוא המספר הממוצע המושבה למנות את הקיפול מדולל 10N (N הוא מ- 1-8). E. coli SS320 תא אלקטרו-המוסמכת תרביות תאים יעילות phagemid עמוד השדרה Fab מ LB/פחמימות בצלחת שווה 10 מ' XN + 3 cfu/µg. שיעור הזיהום טרום M13KO7 מוערך של היחס בין המושבות ליברות/קאן ו LB/ט. האחוז של e. coli SS320 המוסמכת תאים transfected עם phagemid עמוד השדרה Fab מוערך של היחס בין מושבות ליברות/פחמימות ו LB/קאן.

2. מכינים את ssDNA המכילים אורציל (דו-ssDNA) מן התבנית Phagemid

הערה: A דיווח בעבר עמוד השדרה ללונג phagemid שימש את התבנית הכנה דו-ssDNA15. הארכיטקטורה של phagemid עמוד השדרה Fab מוצג באיור2. ערכת ספין פלסמיד (QIAprep ספין M13) משמש עבור הפקת דו-ssDNA עם שינויים קלים.

  1. צלחת ליברות/cmp (מוכן ומאוחסן ב 4 ° C עבור פחות מ- 1 - בן שבועיים) בחממה 37 ° C עבור ה 1 פס החוצה מלאי גליצרול של e. coli CJ236 תאים (או עוד מאמץ dut−/ung−) לחמם עם לולאות סטרילי או טיפים לצלחת ליברות/cmp ומחוממת מראש. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עבור בסביבות 12-15 h.
  2. לבחור מושבה בודדת עם טיפ סטרילי, לחסן לתוך 2 מ של 2YT/cmp במדיום צינור עגול-התחתון 14-mL פוליפרופילן.
  3. דגירה המדיום ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות ב rpm 200 עבור 3-4 h עד OD600 הוא הגיע ב בסביבות 0.4-0.8 (יומן שלב הצמיחה).
  4. להוסיף 5-10 phage μL של עמוד השדרה Fab תבנית לתוך התרבות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל"ד למשך 30 דקות לאפשר phage זיהום.
  5. לאחר דגירה, השתמש טיפ סטרילי פס החוצה 10 μL של תרבות לצלחת ליברות/פחמימות ומחוממת מראש ב- 37 מעלות צלזיוס. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עבור בסביבות 12-15 h.
  6. לבחור מושבה בודדת של phagemid עמוד השדרה Fab המכיל e. coli CJ236 לחסן תרבות starter של 3 mL 2YT/פחמימות/cmp צינור עגול-התחתון פוליפרופילן 14-mL, ולגדול ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד בן לילה עבור בסביבות 12 שעות.
  7. לחסן את התרבות starter 0.3 mL לתוך 30 מ ל 2YT/פחמימות/cmp בבקבוק 250-mL במבוכה.
  8. דגירה של תרבית תאים ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות ב rpm 200 עבור 3-4 h עד OD600 הוא הגיע ב בסביבות 0.4-0.8 (יומן שלב הצמיחה).
  9. להוסיף את M13KO7 (מעבדה, מניות, כייל של 1 x 1013 cfu/mL) לתרבות של צעד 2.8 עם ריבוי של זיהום (MOI) של 10 והוא כייל הסופי של M13KO7 כ עונה 1 פרק 1010 cfu/mL.
  10. דגירה-200 סל ד ו- 37 מעלות לשעה.
  11. גלולה התרבות על ידי צנטריפוגה צינור עגול-התחתון 50-mL-5000 × g ו 25 º C למשך 20 דקות.
  12. Decant את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 30 מ של טרי 2YT/פחמימות/קאן/uridine. להעביר את resuspension לתוך בקבוק 250-mL החדש במבוכה.
  13. דגירה-200 סל ד ו- 25 ° C עבור h 22-24.
  14. העברת התרבות משלב 2.13 לתוך צינור עגול-התחתון 50-mL, centrifuge התרבות ב g × 12,000 במשך 20 דקות כדי להפריד את phage supernatant צנפה תא החיידק. להעביר את phage supernatant לתוך צינור עגול-התחתון 50-mL ולהוסיף 1/5 הנפח הסופי של פג/NaCl פתרון, כדי לזרז את phage. מערבבים היטב, דגירה על קרח למשך 30 דקות לזרז את החלקיקים phage.
  15. צנטריפוגה ב 12,000 × g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות Decant תגובת שיקוע, צנטריפוגה-4,000 × g ו 4 ° C עבור 2 דק. תשאף את תגובת שיקוע הנותרים.
  16. Resuspend בגדר phage ב 2 מ ל 1 סטרילי-מסוננים-PBS והעברת צינורות microcentrifuge 1.5-mL. צנטריפוגה-12,000 g × עבור 5 דקות ב- microcentrifuge benchtop הסרת כל לכלוך חיידקי הנותרת, להעביר את phage supernatant צינורות microcentrifuge 1.5-mL החדש ולאחסן ב 4 º C.
  17. בדוק את היעילות התאגדות אורציל ב e. coli CJ236 באמצעות השוואה לצד השני עם SS320 e. coli .
    1. להוסיף μL 180 של מדיה 2YT כל טוב של שורה בודדת של צלחת 96-ובכן.
    2. להפוך את עשר 10-fold טורי דילולים: להעביר 20 μL של supernatant phage הבאר הראשונה של הצלחת, לערבב על ידי pipetting, להעביר μL 20 של התערובת הבא. טוב. חזור על שלב זה עד הסוף של דילול טורי.
    3. להוסיף 10 μL של phage מתוך שמונה אחרונה דילולים טורי להדביק μL 90 CJ236 e. coli ו e. coli SS320 בשלב יומן (OD600 = 0.4-0.8). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ייבוש עדין.
    4. צלחת 10 μL של דילול טורי של כל זיהום חיידקי CJ236 e. coli SS320 על הצלחות 2YT/פחמימות כפילויות.
    5. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    6. נוסחת חישוב כייל נוגדנים: בהנחה M הוא המספר הממוצע המושבה למנות את הקיפול מדולל 10N (N הוא מ- 1-10). כייל e. coli CJ236 או e. coli SS320 שווה 10 מ' XN + 2 cfu/mL. להעריך את היעילות של התאגדות אורציל מן היחס כייל של e. coli CJ236 ו- e. coli SS320.
  18. להוסיף נפח 1/100 מערכו של המאגר משקעים phage MP לתוך phage supernatant 1.5-mL microcentrifuge צינורות והפעל upside מטה בעדינות לערבב במשך מספר פעמים. תקופת דגירה-RT לפחות 2 דק Phage חלקיקים הם זירז של המדיום תרבות, לפיכך, פתרון מעונן צריך להיות גלוי בשלב זה.
  19. החלת הדוגמה מהצעד 2.18 על עמודה ספין פלסמיד (למשל, QIAprep) צינור 1.5-mL microcentrifuge. יכולת איגוד של עמודה ספין אחד ssDNA יכולים להגיע לפחות 10 µg. צנטריפוגה-6,000 × g ו- 25 ° C ל 30 s ב- microcentrifuge benchtop. למחוק את הזרימה דרך אשר יש במבחנה microcentrifuge 1.5-mL. Phage חלקיקים להישאר כבול אל המטריקס עמודה בשלב זה.
  20. להוסיף העמודה 0.7 מ של UT-MLB phage פירוק ושל איגוד מאגר (ראה דיון), תקופת דגירה-RT לפחות 1 דקות.  צנטריפוגה ב 6,000 x g ו- 25 ° C עבור 30 s ו להשליך הזרימה דרך.
  21. להוסיף עוד מ ל 0.7 המאגר UT-MLB, תקופת דגירה-RT לפחות 1 דקות.
  22. Centrifuge ב 6,000 × g עבור ביטול ס' 30 של הזרימה דרך. בשלב זה, מופרד החלבון המעיל phage דו-ssDNA, אשר נשאר כבול אל המטריקס עמודה.
  23. הוסף 0.7 מ של שטיפת מאגר PE המכיל אתנול ההוראות של היצרן. צנטריפוגה ב g 6,000 × 30 s ו להשליך הזרימה דרך.
  24. חזור על שלב 2.23 ולאחר מכן צנטריפוגה פעם נוספת ב 6,000 × g ב-30 s כדי להסיר שאריות מאגר PE.
  25. להעביר את העמודה צינור 1.5-mL microcentrifuge ולהוסיף μL 100 • תנאי מאגר EB (10 מ מ Tris· CL, pH 8.5) למרכז של קרום עמודה.
  26. תקופת דגירה-RT של 10 min וצנטריפוגה ב 6,000 × g עבור 1 דקות עד elute דו-ssDNA. כ, ניתן לקבל 1.5-2.5 μg דו-ssDNA/mL תרבות.
  27. ניתוח הדנ א eluted על ידי electrophoresing 1 μL על agarose 1% ג'ל טה. ה-DNA אמור להופיע עם הלהקה בעיקר יחיד עם לא מורחת.
  28. לקבוע את ריכוז הדנ א על ידי מדידת ספיגת על ספקטרופוטומטרים nanodrop-260 ננומטר (260 = 1.0 33 ng/μL של ssDNA). ריכוזי dU טיפוסי-ssDNA נמצאים במרחק 200-500 ng/μL.

3. השיטה של Kunkel המבוסס על Oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת

הערות: רצוי לערוך תגובות בקנה מידה קטן לפני קנה מידה מלא תגובות כדי להבטיח את איכות המרכיבים מוטגניות oligonucleotide ותגובה. קריקטורה של השיטה של Kunkel המבוסס על oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת מוצג באיור3. הבדלים חומצת אמינו שונות הם הציגו לתוך אזורים CDRH1, CDRH2, CDRH3 ו- CDRL3 עם IMGT מספור במינוח16 (טבלה 2). חומצת אמינו תיאורטי מגוון CDR כל המגוון הכולל חומצת אמינו תיאורטי, רצפים oligonucleotide מפורטים בטבלה 2.

  1. זרחון oligonucleotide עם T4 polynucleotide קינאז
    1. לשלב 0.6 μg של oligonucleotides מוטגן, שתוכנן להפוך למוטציות CDR יחיד, עם 2 μL 10 X מאגר TM, 2 μL 10 מ מ ATP ו 1 μL 100 מ מ DTT. להוסיף הנדסה גנטית H2O הנפח הכולל של μL 18 צינור 1.5-mL. להקמת ספריה, תגובות מקביל ונפרד זירחון 4 מוגדרים המתאים CDRH1, CDRH2, CDRH3 ו- CDRL3, בהתאמה.
    2. הוסף 20 U (2 uL) של T4 קינאז polynucleotide לכל צינור, תקופת דגירה של h 1 ° 37 C (תגובה 1 בטבלה3). השתמש באופן מיידי עבור חישול.
  2. חישול של oligonucleotides על תבנית
    1. כדי μg 20 של דו-ssDNA תבנית, להוסיף 25 μL מאגר X TM 10, 20 μL של כל פתרון phosphorylated oligonucleotide, ו- H הנדסה גנטית2O נפח סופי של 250 μL בשפופרת 0.5-mL. מערבבים היטב ולהעביר לתוך 0.20 mL המבחנות (50 μL כל) תגובה 2 בטבלה3. למשוואה DNA מספקים טוחנת יחס של 3:1 בין oligonucleotide לבין תבנית, בהנחה כי היחס אורך של oligonucleotide ושל התבנית הוא 1: 100.
    2. דגירה התגובה במכונת ה-PCR ב 90 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 50 º C למשך 3 דקות, ו- 20 º C למשך 5 דקות.
  3. סינתזה אנזימטי של CCC-dsDNA
    1. לתערובת oligonucleotide/תבנית 250 μL annealed, להוסיף 10 μL 10 מ מ ATP, 10 μL של 25 מ מ dNTP מיקס, μL 15 מ"מ DTT, 30 וייס T4 יחידות ה-DNA ליגאז ו 30 U T7 DNA פולימראז 3 התגובה בטבלה3.
    2. דגירה התגובה בצינור 1.5-mL ב 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. רוחצים את התרכז CCC-dsDNA מסונתזת את התקן 0.5-mL צנטריפוגלי מסנן עם קרום גודל הנקבוביות 30 kDa-RT.
      1. להעביר את התערובת תגובת לילה המכשיר מסנן ולהוסיף הנדסה גנטית H2O 400 µL נפח סופי. ספין-14,000 g × 10 דקות; אמצעי האחסון נמצא פחות מ- 50 μL.
      2. למחוק את הזרימה, להוסיף µL 400 של הנדסה גנטית H2O המסנן ויסתובב ב g × 14,000 למשך 10 דקות.
      3. חזור על שלב 3.3.3.2 פעם נוספת.
      4. מקם את המסנן הפוך צינור נקי microcentrifuge לשחזר את CCC-dsDNA. ספין ב 1,000 × g למשך 2 דקות; אמצעי האחסון התאושש בדרך כלל בסביבות 20-40 μL. ניתן להשתמש מיד אלקטרופורציה של e. coli התאושש קכ ק-dsDNA או קפוא ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר. בדרך כלל 20-40 μg CCC-DNA ניתן להשיג.
    4. Electrophorese µL 1.0 של המוצר התגובה eluted לצד התבנית דו-ssDNA לדמיין את התוצאה של התגובה.

4. אלקטרופורציה וחישוב של גודל הספרייה

  1. . תירגע מטוהרים של CCC-dsDNA (20 μg באמצעי אחסון מרבי של 50 μL) צינור 1.5-mL microcentrifuge ו cuvette אלקטרופורציה הפער 0.2 ס מ על קרח.
  2. לחמם 20 מ"ל של התקשורת SOC שפופרת צנטרפוגה חרוט פוליפרופילן 50-mL באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
  3. להפשיר aliquot 350 μL של אלקטרו-המוסמכת e. coli SS320 על הקרח. להוסיף תאי ה-DNA ו לערבב ביסודיות על ידי pipetting מספר פעמים. הימנע היכרות עם בועות.
  4. להעביר את התערובת cuvette ולבצע אלקטרופורציה ההוראות של היצרן. לדוגמה, כאשר המערכת אלקטרופורציה BTX ECM-630 משמשת, ההגדרות הרלוונטיות הן 2.5 kV שדה כוח, התנגדות Ω 125 ו- 50 µF קיבול.
  5. מיד להציל את התאים electroporated על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום SOC ומחוממת מראש והעברת לתוך 17 מ של מדיום SOC בבקבוקון 125-mL. לשטוף את cuvette פעמיים עם 1 מ"ל של SOC בינונית, העברת את. הבקבוק זהה (נפח סופי הוא 20 מ ל).
  6. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
  7. לקבוע את היעילות אלקטרופורציה.
    1. להוסיף μL 180 של מדיה 2YT כל טוב של עמודה יחידה של צלחת 96-microwell.
    2. להפוך 8 כוחנו טורי דילולים: להעביר 20 μL של התרבות 20-mL הבאר הראשונה של הצלחת, לערבב עם pipetting, להעביר μL 20 של התערובת הבא. טוב. חזור על שלב זה עד הסוף של דילול טורי.
    3. צלחת 10 μL של כל אחד דילולים טורי בצלחת ליברות/פחמימות ב כפילויות. צלחת 100 µL שנותרו מכל אחת דילולים טורית על גבי צלחות נפרדות ליברות/פחמימות בשביל המושבה ספירת להצליב. הצלחות האלה גם לספק יחיד שיבוטים אליסה וניתוח רצף (ראה סעיף 5).
    4. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    5. לספור את המושבות של הכפילויות μL 10 בצלחת ליברות/פחמימות. מניחים M היא המושבה ממוצע 10 שנספר על מספרN קפל ליברות/פחמימות בצלחת (N הוא מ- 1-8). גודל הספרייה הכולל שווה 2 מ' X 10N + 3 מושבות.
  8. Aliquot התרבות מהשלב 4.6 באופן שווה לתוך שני 2-L במבוכה מבחנות, המכילים כל אחד 500 מ של 2YT/פחמימות/קאן בינוני לדור ספריית phage.
  9. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד בן לילה עבור בסביבות 16 h.
  10. להעביר את התרבות שני בקבוקים צנטריפוגה בלוק 1-L, צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 12,000 g × ב 4 º C.
  11. להעביר את תגובת שיקוע שני בקבוקים 1-L צנטריפוגה בלוק חדש ולהוסיף 1/5 הנפח הסופי של פג/NaCl פתרון, כדי לזרז את phage. דגירה על קרח למשך 30 דקות.
  12. צנטריפוגה עבור 30 min ב 12,000 × g ו- 4 מעלות צלזיוס. בזהירות decant את תגובת שיקוע, להימנע מהפרעה של בגדר phage. ספין עבור 1 דקות ב- 4,000 x g ולהסיר את תגובת שיקוע הנותרים עם פיפטה.
  13. Resuspend בגדר phage עם 20 מ של סטרילי-מסוננים מאגר X PBS 1 והעברת צינור 50-mL.
  14. גלולה העניין לא מסיסים על ידי צריך שתוציאו עבור 5 דקות ב 12,000 × g ו- 4 מעלות צלזיוס. להעביר את תגובת שיקוע צינור 50-mL.
  15. למדוד את ריכוז phage על ידי ספקטרופוטומטרים (OD268 = 1.0 עבור פתרון של 5 X 1012 phage/mL).
  16. התאם את הריכוז phage 5 X 1012 phage/מ ב- PBS X 1 עם 10% גליצרול הנדסה גנטית.
  17. Aliquot 1 מ"ל של phage פתרון למחזור microcentrifuge 1.5-mL. להשתמש את הספריות מיד גלילה רציפה או לאחסן ב- 80 ° c

5. איכות הערכה על ידי חלבון א' / L ישיר איגוד אליסה Assay, רצף

  1. נבחר באקראי 96 מושבות בודד בצלחת ליברות/פחמימות מהשלב 4.7.3 לצלחת תרבות 96-עמוק טוב המכיל μL 800 של 2YT/פחמימות כל היטב. תקופת דגירה של 3-4 h ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-1,000 סל ד כדי OD600 = 0.4-0.8.
  2. להוסיף 100 μL של M13KO7 (עונה 1 פרק 1011 cfu/mL) כדי כל טוב של 96-עמוק טוב תרבות צלחת עם פיפטה רב-ערוצי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-1,000 סל ד לשעה.
  3. להוסיף 100 μL של 2YT המכיל X 10, ריכוז kanamycin (500 μg/mL) על כל טוב עם פיפטה רב-ערוצי. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-1000 סל ד.
  4. להמיס חלבון L כדי µg/mL 1 ב- 1 X PBS. המעיל 3/4 מן הבארות בצלחת פוליסטירן מחייב חלבון גבוהה 384-טוב עם µL 30/טוב של הפתרון חלבון L. דגירה בין לילה ב 4 º C.
  5. לבטל את הפתרון ציפוי חלבון L לילה מהשלב 5.4. להוסיף 50 µL של M-PBST (הפתרון חסימה) על כל הבארות בצלחת פוליסטירן מחייב חלבון גבוהה 384-ובכן עם פיפטה רב-ערוצי. דגירה הלוחות על מטרף microplate עבור h 1-RT.
  6. ספין למטה התרבות לילה מ שלב 5.3 בצלחת עמוקה 96-ובכן תרבות ב x 3000 g 10 דקות ב 4 º C. Phage נמצא תגובת שיקוע.
  7. לבטל את הפתרון חסימה מהשלב 5.5. להוסיף 3 הבארות L מצופה חלבון בשלושה עותקים, וכן 1 שאינם מצופים היטב כמו שליטה שלילי בעזרת פיפטה רב-ערוצי μL 15 של M-PBST וμl 15 של כל phage supernatant (שלב 5.6). תקופת דגירה-RT של 1 h ברעידות-200 סל ד.
  8. לבטל את הפתרון phage. לשטוף את הצלחת 6 פעמים עם 80 μL של PBST על ידי דסקית צלחת אוטומטיות.
  9. הוסף μL 15 של M-PBST, 15 μL של חלבון A-HRP (1:1, 500 מדולל ב- 1 X PBS) כל טוב עם פיפטה רב-ערוצי ולאחר תקופת דגירה-RT של 1 h ברעידות-כ 200 סל"ד.
  10. לבטל את הפתרון חלבון A-HRP/M-PBST. לשטוף את הצלחת 6 פעמים עם 80 μL של PBST.
  11. הוסף שוייץ המצע (30 μL טוב) עם פיפטה רב-ערוצי ולאחר תקופת דגירה של 2-3 דקות עד הצבע מפתחת. לעצור את התגובה עם 1.0 M H3פו4 (30 μL טוב).
  12. לקרוא את הצלחות spectrophotometrically-450 ננומטר. שיבוטים חיוביים מוגדרים אלה שהפגינו יחס הממוצע של ספיגת450 יתר של חלבון L בארות M-PBST טוב גדול מ- 3.0.
  13. ב 96-עמוק, להדביק 50 μL של SS320 2YT/ט בשלב יומן עם 5 μL של phage באותו המשמש את אליסה (שלב 5.6) במשך 30 דקות ב- RT.
  14. להוסיף μL 950 של 2YT/פחמימות תוך 96-ובכן משלב 5.13, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-1000 סל ד.
  15. לחלץ את phagemid ה-DNA על-ידי ערכת חילוץ DNA הכנה המצומצמת. להשתמש את primers נגד הזרם של VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') ו- VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') לניתוח רצף להעריך את הגיוון רצף של הספרייה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בעקבות את תרשים זרימה הקמת ספריה ללונג (ראה איור 1), הכנו המסייע M13KO7 תאים אלקטרו-המוסמכת של e. coli SS320 phage מראש נגוע. היעילות של תאים אלקטרו-המוסמכת אלה מוערך כמו 2 X 109 cfu/µg כאשר עמוד השדרה Fab phagemid לבנייה הספרייה שימשה (איור 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כדי לבנות גיוון גבוהה, המוצג phage ספריות Fab, בקרת איכות נקודות ביקורת יש צורך לעקוב אחר השלבים השונים של תהליך הבנייה, לרבות את כשירות של תאים אלקטרו-מוסמך, איכות של תבנית דו-ssDNA, היעילות של CCC-dsDNA סינתזה, כייל נוגדנים לאחר אלקטרופורציה קיפול Fab, חומצת אמינו המגוון של Cdr על ידי ניתוח רצף של Fab-phage ש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מעריך ד ר פרדריק Fellouse מן המעבדה Sidhu עבור תגובות ביקורתיות של Kunkel שיטה מבוססת phage Fab סינתטי ספריית הבנייה. המחברים מעריך את גברת משה סגל Pavlenco וחברים אחרים מן המעבדה Sidhu לעזרה יקר של הכנת יעילות גבוהה אלקטרו-המוסמכת תאים e. coli , באיכות גבוהה דו-ssDNA. עבודה זו נתמכה על ידי קרן מדעי הטבע הלאומי של סין (מענק מס: 81572698, 31771006) DW, על ידי אוניברסיטת ShanghaiTech (מענק מס: F-0301 בשידור-13-005) כדי מעבדה של נוגדן הנדסה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
1.0 M H3PO4FisherAC29570
1.0 M Tris, pH 8.0Invitrogen15568-025
10 mM ATPInvitrogen18330-019
100 mM dithiothreitolFisherBP172
100 mM dNTP mixGE Healthcare28-4065-60solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-76-02
50X TAEInvitrogen24710030
AgaroseFisherBP160
Carbenicillin, carbSigmaC1389100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmpSigmaC0378100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0InvitrogenAM9620G
Granulated agarVWRJ637-500G
H2O2 peroxidase substrateKirkegaard & Perry Laboratories Inc50-65-02
K2HPO4Sigma795488
Kanamycin, kanFisherAC6112950 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4SigmaP2222
Na2HPO4Sigma94046
NaClAlfa AesarU19C015
NanodropFisherND2000C
NaOHFisherSS256! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered MilkSangon BiotechA600669
PEG-8000FisherBP233
Protein A-HRP conjugateInvitrogen101123
QIAprep Spin M13 KitQiagen22704
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
Recombinant Protein LFisher77679
T4 DNA polymeraseNew England BiolabsM0203S
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T7 DNA polymeraseNew England BiolabsM0274S
Tetracycline, tetSigmaT766050 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
TryptoneFisher0123-07-5
Tween-20SigmaP2287
Ultrapure glycerolInvitrogen15514-011
UridineSigmaU375025 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extractVWRDF0127-08
NameCompany Catalog NumberComments
Strains
E.coli CJ236New England BiolabsE4141Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320Lucigen60512Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7New England BiolabsN0315S
NameCompany Catalog NumberComments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvetteBTX
96-well 2mL Deep-well platesFisher278743
96-well Maxisorp immunoplatesNunc151759
Baffled flasksCorning
Benchtop centrifugeEppendorf5811000096
Centrifuge bottlesNalgene
ECM-630 electroporatorBTX
Magnetic stir barsNalgene
Thermo Fisher centrifugeFisher
High speed shakerTAITEKMBR-034P
Microplate shakerQILINBEIERQB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wellsRAININ
Mutil-channel pipetteRAININE4XLS
Amicon concentratorMerckUFC803096

References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492(2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135phage

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved