Строительство синтетических Фаговые отображается ВСБ библиотеки с учетом разнообразия

Резюме

Этот протокол описывает подробную процедуру на строительство библиотеки отображается Фаговые синтетических антитела с учетом разнообразия. Синтетические антитела имеют широкое применение от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии.

Аннотация

Ежегодно растет спрос на моноклональных антител (mAbs) в фундаментальных исследований и медицины. Гибридомной технологии был доминирующим методом развития МАБ начиная со своего первого доклада в 1975 году. Как альтернативная технология ФАГ методы отображения для развития МАБ становятся все более привлекательными, поскольку Humira, первым антителом, фаг производные и один из бестселлеров mAbs, был одобрен для клинического лечения ревматоидного артрита в 2002 году. Как не животного на основе технологии развития МАБ, фаг дисплей обходит иммуногенность антигена, гуманизации и животных обслуживания, которые требуются от традиционных гибридомной технологии на основе антител развития. В этом протоколе мы описываем метод для построения синтетических ФАГ отображается Fab библиотек с различий можно получить с одного электропорации 10^{10 9}-10. Этот протокол состоит из: 1) электро компетентных клеток высокой эффективности подготовки; 2) добыча урацил содержащих одноцепочечной ДНК (дю ssDNA); 3) метод Канкел основе олигонуклеотида Направленный мутагенез; 4) электропорации и расчет размера библиотеки; 5) белка на основе A/Л энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для складывания и функциональное разнообразие оценки; и 6) анализ последовательностей ДНК разнообразия.

Введение

mAbs имеют широкое применение, начиная от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии. Начиная с 2016 года более чем 60 mAbs были одобрены Соединенных Штатов продовольственной и наркотиков администрации (АППМ) для клинического лечения аутоиммунных заболеваний, рака и инфекционных заболеваний в^1,2.

В 1975 году Колер и Мильштейн сообщили, что техника для непрерывного поколения антител одного клоновых специфичности от клеточного источника называют «hybridomas» и этот метод впоследствии стать краеугольным камнем в медицине и промышленности³

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Стерильные советы фильтр должен использоваться во всем при работе с Фаговые чтобы избежать загрязнения пипеткой пистолет и окрестностях. Асептические области или капот должны использоваться при обработке с бактериями и ФАГ экспериментов. Фаговые эксперимент области должен быть очищен с помощью 2% лаурилсульфат натрия (SDS) следуют на 70% спирте во избежание загрязнения ФАГ. Для изготовления серийных разведений в настоящем Протоколе, должны использоваться новые советы для каждого разведения.

1. Подготовка электро компетентных клеток кишечной палочки SS320

1. Предварительно теплой LB/tet агар плита (подготовлены и ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После схема строительство Fab библиотеки (см. рис. 1), мы подготовили помощник M13KO7 ФАГ предварительно зараженных кишечной палочки SS320 электро компетентных клеток. Эффективность этих электро компетентных клеток оценивается как 2 Х 10⁹ cfu/мкг, когд?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Чтобы построить высокое разнообразие, фаг отображается Fab библиотек, контроль качества контрольно-пропускные пункты необходимы для мониторинга различных этапов процесса строительства, включая компетентность электро компетентных клеток, качество dU-ssDNA шаблона, эффективность СТС dsDNA с.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
1.0 M H3PO4	Fisher	AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0	Invitrogen	15568-025
10 mM ATP	Invitrogen	18330-019
100 mM dithiothreitol	Fisher	BP172
100 mM dNTP mix	GE Healthcare	28-4065-60	solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)	Kirkegaard & Perry Laboratories Inc	50-76-02
50X TAE	Invitrogen	24710030
Agarose	Fisher	BP160
Carbenicillin, carb	Sigma	C1389	100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp	Sigma	C0378	100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Invitrogen	AM9620G
Granulated agar	VWR	J637-500G
H2O2 peroxidase substrate	Kirkegaard & Perry Laboratories Inc	50-65-02
K2HPO4	Sigma	795488
Kanamycin, kan	Fisher	AC61129	50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4	Sigma	P2222
Na2HPO4	Sigma	94046
NaCl	Alfa Aesar	U19C015
Nanodrop	Fisher	ND2000C
NaOH	Fisher	SS256	! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk	Sangon Biotech	A600669
PEG-8000	Fisher	BP233
Protein A-HRP conjugate	Invitrogen	101123
QIAprep Spin M13 Kit	Qiagen	22704
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28706
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Recombinant Protein L	Fisher	77679
T4 DNA polymerase	New England Biolabs	M0203S
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S
T7 DNA polymerase	New England Biolabs	M0274S
Tetracycline, tet	Sigma	T7660	50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone	Fisher	0123-07-5
Tween-20	Sigma	P2287
Ultrapure glycerol	Invitrogen	15514-011
Uridine	Sigma	U3750	25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract	VWR	DF0127-08
Name	Company	Catalog Number	Comments
Strains
E.coli CJ236	New England Biolabs	E4141	Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320	Lucigen	60512	Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7	New England Biolabs	N0315S
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette	BTX
96-well 2mL Deep-well plates	Fisher	278743
96-well Maxisorp immunoplates	Nunc	151759
Baffled flasks	Corning
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5811000096
Centrifuge bottles	Nalgene
ECM-630 electroporator	BTX
Magnetic stir bars	Nalgene
Thermo Fisher centrifuge	Fisher
High speed shaker	TAITEK	MBR-034P
Microplate shaker	QILINBEIER	QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells	RAININ
Mutil-channel pipette	RAININ	E4XLS
Amicon concentrator	Merck	UFC803096