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Resumo

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para a construção de uma biblioteca de anticorpo sintético do fago-exibido com diversidade sob medida. Anticorpos sintéticos têm aplicações amplas de pesquisa básica para o diagnóstico da doença e terapêutica.

Resumo

Demanda por anticorpos monoclonais (mAbs) em pesquisa básica e a medicina está a aumentar anualmente. Tecnologia de hibridomas tem sido o método dominante para o desenvolvimento do mAb desde o seu primeiro relatório em 1975. Como uma tecnologia alternativa, métodos de exibição do fago para desenvolvimento do mAb estão cada vez mais atraentes desde que Humira, o primeiro anticorpo derivados do fago e um dos mAbs seller, foi aprovado para o tratamento clínico da artrite reumatoide em 2002. Como um não-animal com base em tecnologia de desenvolvimento do mAb, exposição do fago ignora imunogenicidade do antígeno, humanização e manutenção de animais que são necessárias de desenvolvimento de anticorpo do hybridoma tradicional tecnologia baseada. Neste protocolo, descrevemos um método para construção de sintético do fago-exibido Fab bibliotecas com diversidades de 109-1010 obtenível com uma única eletroporação. Este protocolo é composto por: 1) preparação de alta eficiência de célula electro-competente; 2) extração de uracil contendo ADN single-stranded (dU-ssDNA); 3) método do Kunkel baseado mutagénese dirigida do oligonucleotide; 4) electroporation e cálculo do tamanho da biblioteca; 5) ensaio da proteína/L base imunoenzimático (ELISA) para dobrar e avaliação de diversidade funcional; e 6) análise de sequências de ADN da diversidade.

Introdução

Celia tem amplas aplicações variando de pesquisa básica para o diagnóstico de doença e terapêutica. A partir de 2016, mais de 60 mAbs foram aprovados pelos Estados Unidos, Food and Drug Administration (USFDA) para tratamento clínico de doenças auto-imunes, câncer e doenças infecciosas1,2.

Em 1975, Kohler e Milstein relataram uma técnica para a geração contínua de anticorpos de uma única especificidade clonal de uma fonte de celular, conhecida como 'hibridomas' e esta técnica posteriormente tornou-se uma pedra angular na medicina e na indústria3 ,4. Geração de mAbs por esse método requer várias etapas, incluindo a produção de antígeno, imunização de rato, extração dos linfócitos B, fusão de células B com células de mieloma para formar células de hibridoma imortal, seleção de clone e para aplicações terapêuticas, humanização é necessário para evitar o anticorpo de humano anti-rato (HAMA)4,5. No entanto, para esta tecnologia, antígenos incluindo proteínas altamente conservadas, patógenos e toxinas são relativamente ineficazes em desencadear uma resposta imune na vivo por mAb produção5.

Em 1978, Hutchison et al relataram o uso do oligonucleotide para mutagénese direto de um resíduo em um single-stranded bacteriófago vírus6. Em 1985, Smith relatou que fragmentos do gene estrangeiro podem ser fundidos em quadro com o gene que codifica a proteína de casaco do fago III e, portanto, podem ser exibidos na superfície do fago sem comprometer sua infecciosidade7. Estas obras de pioneirismo estabelecido uma base para a posterior construção de bibliotecas do fago-exibido anticorpos imunes, ingênuo, e sintético formulários com o formato de cadeia única variável fragmento (scFv) e fragmento de ligação do antígeno (Fab) para terapêutica mAb desenvolvimento8,9. Do ponto de vista técnico, desenvolvimento de anticorpo baseados na exposição do fago oferece uma abordagem complementar ao desenvolvimento baseado em hibridoma mAb que pode ajudar a contornar as limitações de que alguns antígenos podem representar e a humanização que processar anticorpos derivados do hybridoma exigem muitas vezes5. A partir de 2016, 6 phage display-derivado mAbs foram aprovadas no mercado, incluindo Humira, dentre os mais bem sucedidos mAbs utilizados para tratamento da artrite reumatoide, e muitos candidatos de anticorpo exibição-derivado do fago estão atualmente em vários estágios de clínica investigação10.

Para imunológico e ingênuo do fago anticorpo as bibliotecas, a diversidade de complementaridade-determinando regiões (CDRs) na cadeia leve e pesada é derivada do repertório imune natural (ou seja, de células B). Em contraste, a diversidade de CDRs em bibliotecas de anticorpo sintético do fago é inteiramente artificial. Abordagens sintéticas para construção da biblioteca fornecem controle preciso sobre o design de diversidade de sequência e oferecem oportunidades de estudos mecanicistas da estrutura de anticorpo e função11,12. Além disso, o quadro de bibliotecas sintéticas pode ser otimizado antes da construção da biblioteca para facilitar a jusante, o desenvolvimento industrial em grande escala11,12.

Em 1985, Kunkel relatou uma abordagem de mutagénese baseado em modelo single-stranded DNA (ssDNA) para introduzir mutações local-dirigido em bacteriófago M13 eficientemente13. Esta abordagem foi posteriormente usada extensamente para a construção de bibliotecas do fago é exibido. Oligonucleotídeos de DNA sintetizados quimicamente projetados para introduzir a diversidade na Fab CDRs são incorporados em um phagemid com um modelo de coluna vertebral do anticorpo. Neste processo, o phagemid é expresso como um ssDNA contendo uracil (dU-ssDNA) e os oligonucleotides são recozidos para os CDRs e estendidos para sintetizar o DNA de cadeia dupla (dsDNA) na presença de T7 DNA polimerase e T4 DNA ligase. Finalmente, o ds-DNA gerado pode ser introduzido em Escherichia coli por eletroporação.

Para elevada diversidade, construção de biblioteca do fago-exibido, eletroporação de alta tensão de uma mistura de dois componentes de células electro-competente e covalentemente dsDNA circular fechado (CCC-dsDNA) deve ser preparado cuidadosamente. Et al . Sidhu modificado a preparação de células competentes de electro e DNA de métodos tradicionais e biblioteca melhorou muito diversidade14.

Neste protocolo, descrevemos um método para construção de sintético do fago-exibido Fab bibliotecas com diversidades de 109-1010 obtenível com uma única eletroporação. A Figura 1 mostra uma visão geral da biblioteca de construção incluindo: 1) preparação de alta eficiência de célula electro-competente; 2) extração de dU-ssDNA; 3) método do Kunkel baseado mutagénese dirigida do oligonucleotide; 4) electroporation e cálculo do tamanho da biblioteca; 5) proteína/L base ELISA para dobrar e avaliação de diversidade funcional; e 6) análise de sequências de ADN da diversidade. Todas as cepas, reagentes e equipamentos estão listados na tabela do Material. A tabela 1 mostra a configuração de reagente.

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Protocolo

Nota: Dicas estéril de filtro devem ser usadas ao longo quando se trata do fago para evitar a contaminação, a arma de pipeta e área circundante. Área asséptica ou capa deve ser usada quando manipulação com bactérias e fagos experimentos. Área do experimento do fago deve ser limpas usando 2% Dodecil sulfato de sódio (SDS) seguido de etanol a 70% para evitar a contaminação do fago. Para fazer diluições em série neste protocolo, novas dicas devem ser usadas para cada diluição.

1. preparação da pilha Electro-competentes de Escherichia Coli SS320

  1. Placa de ágar pre-quente LB/tet (preparado e armazenado em 4 ° C por menos de 1 - semanas de idade) na incubadora 37 ° C por 1 h. usar um laço do inoculation estéril ou ponta estéril a raia um estoque de glicerol de células de Escherichia coli SS320 na placa de ágar LB/tet pré-aquecido em um zig-zag direc ção suavemente ao longo da superfície da placa. Incube a placa na incubadora 37 ° C durante a noite para cerca de 12-15 h.
  2. No dia seguinte, use um laço do inoculation estéril ou ponta estéril para escolher uma única colônia bem separada ao longo da linha de zig-zag e inocular em 10 mL de meio 2YT/tet em um tubo de fundo redondo de 50mL por mergulhando o meio loop e mexendo rapidamente.
  3. Incube a 37 ° C com agitação a 200 rpm para cerca de 3-4 h até OD600 é atingido no próximo de 0.4-0.8 (crescimento de fase de log). Monitor OD600 a 2 h. Durante este período, pré-aquecer 5 placas de ágar LB/tet (preparado e armazenado em 4 ° C por menos de 1 - semanas de idade) em uma incubadora de 37 ° C pelo menos 1 h.
  4. Adicionar 20 μL M13KO7 auxiliar do indicador do fago do estoque de laboratório com concentração em torno de 1 x 1013 formadoras de unidade (cfu) /mL em 180 μL de estéril 1 X PBS em tubos de 1,5 mL esterilizados para preparar 10 diluições em série dez vezes.
  5. Alíquota 4 mL autoclavados e líquido 2YT ágar top 5 X 14 ml inferior tubos redondos, rotular cada tubo com diluição do quinto ao nono de diluição dez vezes, respectivamente e incubar em uma incubadora de 65 ° C para manter 2YT ágar superior no estado líquido.
  6. Mix de 500 μL de fase log Escherichia coli SS320 células no tubo de diluição de M13KO7 (escolha a quinta diluição dez vezes ao nono diluição dez vezes) e incubá-los numa incubadora 37 ° C por 5-10 min.
  7. Durante a incubação de passo 1.6, transferir 2YT ágar top de passo 1.5 à temperatura ambiente (RT) para esfriar por cerca de 5 min para cerca de 42 ° C. Usar o pulso interno para testar a temperatura do 2YT ágar superior; deve permanecer como líquido. Transferi cada mistura de diluição de passo 1,5 para cada tubo de ágar top 2YT correspondente. Aperte a tampa de cada tubo e misture girando de cabeça para baixo várias vezes de suavemente e, brevemente, para evitar a geração de bolhas.
  8. Cuidadosamente para cada mistura ao longo da borda de uma placa de ágar LB/tet pre-aquecida (da etapa 1.3) e inclinar o prato ligeiramente para totalmente e uniformemente preencher o prato com a mistura, evitando a introdução de bolhas. Mantenha as placas RT para em torno de 5-10 min para solidificar o ágar superior dentro de cada placa e incubar as placas de ágar top 2YT a 37 ° C durante a noite para cerca de 15-18 h.
  9. Escolher a placa de diluição após crescimento durante a noite da etapa 1.8 com em torno de 100-200 placas de tamanho médio, única, bem separadas para inoculação de placa. Utilize uma mão para segurar a placa de ágar contra uma fonte de luz e a outra mão para segurar uma arma de pipeta carregada com uma ponta de pipeta estéril tempo esfaquear verticalmente sobre o agar top e recolher uma placa única e bem separada.
    1. Inclinar a ponta da pipeta ligeiramente para separar superior ágar com placa. Pipeta de cima e para baixo várias vezes para desalojar o ágar com placa em um tubo de cultura de 14 mL de fundo redondo pré-carregado com 1 mL de meio 2YT/kan/tet (ver tabela 1).
    2. Repita este procedimento para escolher placas de 3-5 no total. A finalidade de escolher várias placas é garantir sucesso inoculação, como uma placa pode ser fraco e relativamente pequena quando comparada com uma colônia de bactérias. Crescem as placas para 8 h a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
  10. Transferência de um tubo de crescente cultura em 50 mL de meio 2YT/kan/tet em um balão de 250 mL perplexo. Cresce a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante a noite para cerca de 12 h.
  11. Inocule 3 2-L perplexos frascos contendo 900 mL de meio de superbroth/tet/kan cada com 5 mL de cultura durante a noite. Incube a 37 ° C com agitação a 200 rpm por 6-7 h para OD600 ao redor 0.6-0.8.
  12. Relaxa os três frascos de cultura bacteriana em um banho de gelo por 5 min com agitação constante suave à mão. As etapas a seguir devem ser feitas em uma sala fria, no gelo, com equipamentos e soluções prechilled.
  13. Usar toalha de tecido de absorvância para secar o vidro exterior de cada balão; Utilize uma mão para inclinar a garrafa de 1L centrífuga autoclavados no banco e a outra mão para derramar no meio, suavemente por cada balão em cada garrafa de centrífuga.
  14. Girar a 5.000 × g e 4 ° C por 10 min para as bactérias. de pelotas
  15. Após centrifugação, delicadamente decante o sobrenadante para um matraz de resíduos autoclavado 5-L.
  16. Encha cada garrafa com 100 mL de filtrado estéril 1,0 mM HEPES, pH 7,4 e adicionar uma barra de agitação magnética autoclavados para cada garrafa para auxiliar na ressuspensão de sedimento a 200 rpm. Redemoinho e desalojar a pelota inteira da parede da garrafa cada vários minutos durante a agitação magnética. Uma vez que o sedimento é dissolvido, encha cada garrafa com um adicional de 400 mL de filtrado estéril 1,0 mM HEPES, pH 7,4.
  17. Centrifugar a 5.000 × g e 4 ° C por 10 min. decantar o sobrenadante, mantendo a barra de agitação na garrafa.
  18. Repita os passos de 1,16 para 1.17 uma vez.
  19. Cada Ressuspender em 500 mL de filtrado estéril, ultrapura glicerol a 10, com o auxílio das barras de agitação. Redemoinho e desalojar a pelota inteira da parede da garrafa cada vários minutos durante a agitação magnética.
  20. Centrifugar e decantar etapa 1.17. Repita a etapa 1.19 uma vez. Use pinça esterilizada long-braço para remover a barra de agitação.
  21. Centrifugar a 5.000 × g e 4 ° C por 15 min. decantar o sobrenadante e remover todos os restos do sobrenadante de cada garrafa de centrífuga com uma pipeta.
  22. Adicionar 3,0 mL de glicerol ultrapura de 10% para uma garrafa e suavemente resuspenda o pellet pipetando. A suspensão de transferência para a próxima garrafa e repita até que todas as pelotas são resuspended e combinadas em uma garrafa. Cerca de 6 mL de células altamente concentradas são obtidos com uma concentração de cerca de 3 x 1011 UFC/mL.
  23. Pre-frio tubos de 1,5 mL microcentrifuga autoclavados e caixa de armazenamento de um tubo de 96 poços sem divisores a-80 ° C pelo menos 1h antes desta etapa. Transferi os tubos microcentrifuga pre-refrigerados para o quarto frio no gelo antes de Pipetar alíquotas da suspensão celular da pelota. Use uma pipeta para alíquota 350 μL da suspensão de células em cada tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
  24. Transferi as alíquotas em um contêiner de caixa de espuma preenchido com nitrogênio líquido para congelar o flash (3-5 min).
    1. Transportar a caixa de espuma com nitrogênio líquido para um freezer-80 ° C (consulte a etapa 1.23).
    2. Retire a caixa de armazenamento do tubo de 1,5 mL microcentrifuga do freezer-80 ° C (consulte a etapa 1.23) e colocar no gelo.
    3. Rapidamente, use uma malha de metal para peneirar as alíquotas de nitrogênio líquido e colocá-los na caixa de armazenamento do tubo. Loja a-80 ° C.
      Atenção: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras e cuidados devem ser tomados para a proteção de segurança. Use um phagemid Fab espinha dorsal para verificar a eficiência das células electro-competentes preparadas (o estoque de phagemid Fab espinha dorsal deve ser em água ultrapura (MilliQ) 400 ng / µ l). Descongele 1 μg da espinha dorsal Fab phagemid em água ultrapura de 10 µ l e uma alíquota de 350 μL de electro-competente SS320 no gelo e prechill uma cubeta de eletroporação de lacuna de 0,2 cm no gelo.
  25. Adicione 350 μL electro-competente SS320 células com o DNA de 10 µ l após o descongelamento e misture pipetando várias vezes, mantendo as misturas no gelo. Evite a introdução de bolhas.
  26. Pré-aquecer 15 mL do meio SOC em um tubo de 50mL em um banho de água de 37 ° C durante pelo menos 30 min antes de eletroporação. Transfira a mistura de 360 μL para a cubeta e executar electroporation seguindo as instruções do fabricante.
  27. Imediatamente, resgate as células após electroporation, adicionando 1 mL de meio SOC pré-aquecido (da etapa 1.27) e pipetagem. Transferir o meio da cubeta para um balão de 125 mL pré-carregado com 5 mL de pré-aquecido SOC.
  28. Enxagúe a cubeta duas vezes, cada vez com 1 mL de meio SOC previamente aquecido e transferir o meio para o balão de 125mL (consulte a etapa 1.27). Adicione pré-aquecido médio SOC até um volume final de 10 mL para o frasco de 125mL.
  29. Incube a cultura de células de 10 mL por 30 min a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
  30. Fazer diluições em série para determinar a eficiência do transfection e a taxa de pré-infecção M13KO7.
    1. Use uma pipeta multicanal para adicionar 180 μL de mídia 2YT a cada poço de uma única coluna de uma placa de 96 micropoços.
    2. Fazem 8 dez vezes serial diluições: transferir 20 μL da cultura da etapa 1.29 ao primeiro poço da placa, mistura pipetando e transferir 20 μL da mistura para o outro bem. Repita este passo para o fim de diluição serial.
    3. Placa de 10 µ l de cada diluição serial nas placas LB/carb, LB/kan e LB/tet em duplicado.
    4. Incubar durante uma noite a 37 ° C.
    5. Fórmula de cálculo da eficiência: Suponha que M é o número médio de colônia contado a partir da dobra diluída 10N (N é de 1-8). Transfecção celular electro-competente a Escherichia coli SS320 eficiência o phagemid Fab espinha dorsal da placa LB/carb é igual a M X 10N + 3 UFC / µ g. A taxa de pré-infecção M13KO7 é estimada a partir da relação das colônias em LB/kan e LB/tet. A percentagem de Escherichia coli SS320 competentes células transfectadas com a espinha dorsal Fab phagemid é estimada a partir da relação das colônias em LB/carb e LB/kan.

2. Preparação contendo Uracil ssDNA (dU-ssDNA) com base no modelo Phagemid

Nota: A anteriormente relatados phagemid Fab espinha dorsal foi usado como modelo para dU-ssDNA preparação15. A arquitetura de phagemid a Fab espinha dorsal é mostrada na Figura 2. Um kit de rotação do plasmídeo (QIAprep rotação M13) é usado para a extração de dU-ssDNA com pequenas modificações.

  1. Pré-aquecer uma placa LB/cmp (preparado e armazenado em 4 ° C por menos de 1 - semanas de idade) em uma incubadora de 37 ° C por 1 h. raia um estoque de glicerol de células de Escherichia coli CJ236 (ou outra estirpe de dut−/ung−) com loops estéril ou dicas sobre a placa LB/cmp previamente aquecida. Incube a placa a 37 ° C durante a noite para cerca de 12-15 h.
  2. Escolher uma única colônia com uma ponta estéril e inocular em 2 mL de meio 2YT/cmp em um tubo de fundo redondo de polipropileno 14 mL.
  3. Incube a médio a 37 ° C com agitação a 200 rpm por 3-4 h até OD600 é atingido no próximo de 0.4-0.8 (crescimento de fase de log).
  4. Adicionar o fago de 5-10 μL de modelo Fab espinha dorsal para a cultura e incubar a 37 ° C com agitação a 200 rpm por 30 min permitir que a infecção do fago.
  5. Após a incubação, use uma ponta estéril de raia para fora 10 μL da cultura em uma placa LB/carb previamente aquecida a 37 ° C. Incube a 37 ° C durante a noite para cerca de 12-15 h.
  6. Escolha uma única colônia de phagemid de espinha dorsal Fab contendo a Escherichia coli CJ236 para inocular uma cultura de acionador de partida de 3 mL 2YT/carb/cmp, em um tubo de fundo redondo de polipropileno 14 mL e cresce a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante a noite para cerca de 12 h.
  7. Inocule a cultura do acionador de partida de 0,3 mL em 30 mL 2YT/carb/cmp em um frasco de 250 mL perplexo.
  8. Incube a cultura de célula a 37 ° C com agitação a 200 rpm por 3-4 h até OD600 é atingido no próximo de 0.4-0.8 (crescimento de fase de log).
  9. Adicionar o M13KO7 (laboratório conservado em estoque, sendo o título de aproximadamente 1 x 1013 UFC/mL) para a cultura de passo 2.8 com uma multiplicidade de infecção (MOI) de aproximadamente 10 e do título final do M13KO7 é de aproximadamente 1 x 1010 UFC/mL.
  10. Incube a 200 rpm e 37 ° C, durante 1 h.
  11. A cultura de pelotas por centrifugação em um tubo de fundo redondo de 50 mL em 5.000 × g e 25 ° C por 20 min.
  12. Decante o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 30 mL de fresca 2YT/carb/kan/uridina. Transferi a ressuspensão em uma nova garrafa de 250 mL perplexa.
  13. Incube a 200 rpm e 25 ° C, para 22-24 h.
  14. Transferir a cultura da etapa 2.13 em um tubo de fundo redondo de 50 mL e centrifugar a cultura em 12.000 × g por 20 min para separar o sobrenadante do fago do pellet de células bacterianas. Transferir o fago sobrenadante para um novo tubo de fundo redondo de 50 mL e adicionar 1/5 do volume final da solução de NaCl/PEG para precipitar o fago. Misture bem e incubar no gelo por 30 min precipitar as partículas do fago.
  15. Centrifugar a 12.000 × g e 4 ° C por 30 min. decantar o sobrenadante e centrifugar 4.000 × g e 4 ° C por 2 min. Aspire o sobrenadante restante.
  16. Ressuspender o fago em 2 mL do filtrado estéril de 1X PBS e transferência para tubos de 1,5 mL microcentrifuga. Centrifugar a 12.000 × g por 5 min em um microcentrifuge de bancada para remover quaisquer resíduos restantes bacteriano e transferir o sobrenadante do fago para novos tubos de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a 4 ° C.
  17. Verificar a eficiência de incorporação do uracil em Escherichia coli CJ236 através de comparação lado a lado com Escherichia coli SS320.
    1. Adicione 180 μL de mídia 2YT a cada poço de uma única linha de uma placa de 96 poços.
    2. Fazem dez 10-fold serial diluições: 20 μL do sobrenadante fago de transferência para o primeiro poço da placa, misturar pipetando e 20 μL da mistura de transferência para outro bem. Repita este passo para o fim de diluição serial.
    3. Adicionar 10 μL do fago do últimos oito diluições em série para infectar 90 μL de Escherichia coli CJ236 e SS320 de Escherichia coli em fase log (OD600 = 0.4-0.8). Incube a 37 ° C por 30 min com agitação suave.
    4. Placa 10 μL de diluição serial de cada infecção em Escherichia coli CJ236 e SS320 de Escherichia coli em placas 2YT/Carb em duplicado.
    5. Incubar durante uma noite a 37 ° C.
    6. Fórmula de cálculo do título: Suponha que M é o número médio de colônia contado a partir da dobra diluída 10N (N é de 1-10). O título de CJ236 de e. coli ou e. coli SS320 é igual a M X 10N + 2 UFC/mL. Estime a eficiência do uracil constituída a partir da razão de título CJ236 de e. coli e e. coli SS320.
  18. Adicionar o volume de 1/100 de buffer de precipitação do fago MP em phage sobrenadante em tubos de 1,5 mL microcentrifuga e virar de cabeça para baixo suavemente para misturar por diversas vezes. Incubar a RT pelo menos 2 min. Phage partículas são precipitadas de meio de cultura, e assim, uma solução turva deve ser visível neste momento.
  19. Aplique a amostra da etapa 2.18 para uma coluna de rotação do plasmídeo (por exemplo, QIAprep) em um tubo de 1,5 mL microcentrifuge. A capacidade de ligação da coluna de rotação para ssDNA pode chegar pelo menos 10 µ g. centrífuga em 6.000 × g e 25 ° C por 30 s em um microcentrifuge de bancada. Descarte a passagem que é no tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Partículas de fago permanecem vinculadas à matriz coluna nesta fase.
  20. Adicionar 0,7 mL de lise de fago UT-MLB e tampão de ligação (ver discussão) para a coluna e incubar a RT pelo menos 1 min.  Centrifugue a 6.000 x g e 25 ° C por 30 s e descarte o escoamento.
  21. Adicionar outro 0,7 mL de tampão de UT-MLB e incubar a RT pelo menos 1 min.
  22. Centrifugar a 6.000 × g durante 30 s. descarte o escoamento. Nesta fase, a proteína do revestimento do fago é separadoda do dU-ssDNA, que permanece ligado à matriz coluna.
  23. Adicione 0,7 mL de tampão PE de lavagem de etanol contendo seguindo as instruções do fabricante. Centrifugar a 6.000 × g por 30 s e descarte o escoamento.
  24. Repita a etapa 2.23 e, em seguida, centrifugar mais uma vez a 6.000 × g por 30 s para remover o tampão residual do PE.
  25. Transferir a coluna para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL e adicionar 100 μL de tampão de eluição EB (10 mM Tris· CL, pH 8,5) para o centro da membrana de coluna.
  26. Incube a RT durante 10 min e centrifugar a 6.000 × g por 1 min Eluir o dU-ssDNA. Aproximadamente, 1,5-2,5 μg cultura de dU-ssDNA/mL pode ser obtida.
  27. Analise o DNA eluted por electrophoresing 1 μL em um TAE gel de agarose a 1%. O DNA deve aparecer como uma banda predominantemente única com nenhuma mancha.
  28. Determinar a concentração de DNA medindo a absorbância em um espectrofotômetro nanodrop em 260 nm (260 = 1.0 para 33 ng/μL do ssDNA). Concentrações de dU-ssDNA típico são dentro de 200-500 ng/μL.

3. método do Kunkel baseado mutagénese dirigida do Oligonucleotide

Notas: É aconselhável realizar reações em pequena escala antes de reações de escala completa para garantir a qualidade dos componentes do oligonucleotide e reação mutagénicas. Dos desenhos animados do método do Kunkel baseado do oligonucleotide-dirigido mutagênese é mostrado na Figura 3. Vários aminoácidos diversidades de regiões CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3 são introduzidas com IMGT numeração nomenclatura16 (tabela 2). A diversidade teórica aminoácido de cada CDR, diversidade total teórico de aminoácidos e sequências do oligonucleotide são listadas na tabela 2.

  1. Fosforilação do oligonucleotide com quinase de polinucleotido T4
    1. Combine a 0,6 μg de oligonucleotides mutagénicos, projetado para transformar um único CDR, com 2 μL 10 X TM amortecedor, 2 μL 10mm ATP e 1 μL 100 mM DTT. Adicione ultrapura H2O para um volume total de 18 μL em um tubo de 1,5 mL. Para a construção de biblioteca, 4 reacções de fosforilação separadas e paralelas são configuradas correspondente a CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3, respectivamente.
    2. Adicionar 20 U (2 uL) da quinase de polinucleotido T4 a cada tubo e incubar durante 1 h a 37 ° C (reação 1 na tabela 3). Uso imediato para recozimento.
  2. Recozimento dos oligonucleotides para o modelo
    1. A 20 μg de dU-ssDNA modelo, adicione 25 μL de tampão de TM X 10, 20 μL de cada solução do oligonucleotide fosforilada e ultrapura H2O, até um volume final de 250 μL em um tubo de 0,5 mL. Misture bem e transferir para tubos de PCR de 0,20 mL (50 μL cada) como reação 2 na tabela 3. Essas quantidades de DNA fornecem uma relação molar de 3:1 do oligonucleotide e modelo, supondo que a relação comprimento do oligonucleotide e modelo é de 1: 100.
    2. Incubar a reação em uma máquina PCR a 90 ° C por 3 min, 50 ° C por 3 min e 20 ° C por 5 min.
  3. Síntese enzimática de CCC-dsDNA
    1. A mistura do oligonucleotide/modelo 250 μL recozido, adicione 10 μL de 10mm ATP, 10 μL de mistura de 25 mM dNTP, 15 μL de 100 mM DTT, Weiss 30 unidades T4 DNA ligase e 30 U T7 DNA-polimerase como reação 3 na tabela 3.
    2. Incube a reação no tubo de 1,5 mL a 20 ° C durante a noite.
    3. Lave e concentrar o CCC-dsDNA sintetizada em um dispositivo de filtragem centrífuga de 0,5 mL com uma membrana de tamanho de poro de 30 kDa no RT
      1. Transfira a mistura de reação durante a noite para o dispositivo de filtro e adicionar ultrapura H2O volume final de 400 µ l. Girar a 14.000 × g por 10 min; o volume é inferior a 50 μL.
      2. Descartar o fluxo através de, adicionar 400 µ l de ultrapura H2O no filtro e girar a 14.000 × g por 10 min.
      3. Repita a etapa 3.3.3.2 mais uma vez.
      4. Coloque o filtro de cabeça para baixo em um tubo limpo microcentrifuga recuperar o CCC-dsDNA. Rotação em 1.000 × g por 2 min; o volume recuperado é geralmente ao redor 20-40 μL. O CCC-dsDNA recuperado pode ser usado imediatamente para eletroporação de e. coli ou congelado a-20 ° C para uso posterior. Normalmente de 20-40 μg CCC-DNA pode ser obtido.
    4. Electrophorese 1,0 µ l do produto juntamente com o modelo de dU-ssDNA para visualizar o resultado da reação de reação eluted.

4. Electroporation e cálculo do tamanho da biblioteca

  1. Acalmar o CCC-dsDNA purificado (20 μg em um volume máximo de 50 μL) em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e uma cubeta de eletroporação de lacuna de 0,2 cm no gelo.
  2. Pré-aqueça 20ml da mídia SOC em um tubo de centrifuga conico polipropileno de 50mL em banho de água a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
  3. Descongelar uma alíquota de 350 μL de electro-competentes de Escherichia coli SS320 no gelo. Adicione as células para o DNA e misture completamente pipetando várias vezes. Evite a introdução de bolhas.
  4. Transfira a mistura para a cubeta e executar electroporation seguindo as instruções do fabricante. Por exemplo, quando o sistema de eletroporação BTX ECM-630 é usado, as configurações relevantes são força de campo 2,5 kV, 125 Ω resistência e capacitância µF 50.
  5. Imediatamente, resgate as células electroporated, adicionando 1 mL de meio SOC pré-aquecido e Transferindo em 17 mL de meio SOC em um balão de 125mL. Enxágue a cubeta duas vezes com 1 mL de meio de SOC e transferência para o mesmo balão (volume final é 20 mL).
  6. Incube durante 30 min a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
  7. Determine a eficiência de eletroporação.
    1. Adicione 180 μL de mídia 2YT a cada poço de uma única coluna de uma placa de 96 micropoços.
    2. Fazem 8 dez vezes serial diluições: transferir 20 μL da cultura 20 mL para o primeiro poço da placa, misture com a pipetagem e 20 μL da mistura de transferência para outro bem. Repita este passo para o fim de diluição serial.
    3. Placa 10 μL de cada uma das diluições de série em uma placa LB/carb em duplicado. Placa de 100 µ l de remanescentes de cada uma das diluições de série em separado placas LB/carb para colônia Conde cruza. Estas placas também fornecerá clones único para análise de ELISA e sequência (ver secção 5).
    4. Incubar durante uma noite a 37 ° C.
    5. Conte as colônias de 10 duplicatas μL na placa LB/carb. Suponha que M é a colônia média 10 contados no númeroN dobra chapa LB/carb (N é de 1-8). O tamanho da biblioteca total é igual a 2 M X 10N + 3 colônias.
  8. Alíquota da cultura da etapa 4.6 igualmente em dois balões perplexos 2-L, cada contendo 500 mL de meio 2YT/carb/kan para geração de biblioteca do fago.
  9. Incube a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante a noite para por volta das 16 h.
  10. Transferir a cultura para duas garrafas de 1L centrífuga autoclavados e centrifugar por 30 min em 12.000 × g a 4 ° C.
  11. Transferir o sobrenadante para duas garrafas de 1L centrífuga autoclavados novo e adicionar 1/5 do volume final da solução de NaCl/PEG para precipitar o fago. Incube no gelo por 30 min.
  12. Centrífuga para 30 min em 12.000 g × e 4 ° C. Decante o sobrenadante e cuidadosamente evitar perturbar da pelota do fago. Girar para 1 min a 4.000 x g e remover o restante sobrenadante com uma pipeta.
  13. Ressuspender o fago com 20 mL de filtrado estéril 1 tampão PBS X e transferência para um novo tubo de 50 mL.
  14. Pelota a matéria insolúvel por centrifugação por 5 min em 12.000 g × e 4 ° C. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 50 mL.
  15. Medir a concentração do fago por espectrofotômetro (OD268 = 1.0 para uma solução de 5 X 1012 fago/mL).
  16. Ajuste a concentração do fago para 5 X 1012 fago/mL de 1X PBS com 10% de glicerol ultrapura.
  17. Alíquota 1 mL da solução de fago por tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Usar as bibliotecas imediatamente para garimpar ou armazenar a-80 ° C.

5. qualidade avaliação pela proteína A / L direto ELISA ensaio e sequenciamento

  1. Aleatoriamente escolhe 96 única colônias na placa LB/carb da etapa 4.7.3 em uma placa de cultura 96 de profundidade bem contendo 800 μL de 2YT/carb em cada poço. Incubar durante 3-4 h a 37 ° C com agitação a 1.000 rpm para OD600 = 0.4-0.8.
  2. Adicionar 100 μL de M13KO7 (1 X 1011 UFC/mL) a cada poço de um profundo-96 cultura bem a placa com uma pipeta multicanal. Incube a 37 ° C com agitação a 1.000 rpm por 1 h.
  3. Adicione 100 μL de 2YT contendo 10 concentração X de canamicina (500 μg/mL) a cada poço com uma pipeta multicanal. Incube durante uma noite a 37 ° C, com agitação a 1.000 rpm.
  4. Dissolva proteína L de 1 µ g/mL de 1X PBS. Casaco 3/4 dos poços de uma placa de poliestireno 384-bem alta proteína ligadora com 30 µ l/poço da solução da proteína L. Incubar durante uma noite a 4 ° C.
  5. Descarte a solução de revestimento de proteína L durante a noite da etapa 5.4. Adicionar 50 µ l de M-PBST (a solução bloqueio) para todos os poços da placa de poliestireno de proteína ligadora 384-bem alto com uma pipeta multicanal. Incubar as placas em um agitador microplacas por 1h no RT
  6. Spin para baixo a cultura da noite da etapa 5.3 em uma placa de 96 poços profundos cultura a 3.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. O fago é no sobrenadante.
  7. Descarte a solução de bloqueio da etapa 5.5. Adicione 15 μL de PBST-M e 15 μL de cada fago sobrenadante (etapa 5.6) para 3 dos poços da proteína L revestido como triplicado e 1 controle bem como negativa não revestidos, usando uma pipeta multicanal. Incube a RT para 1 h com agitação a 200 rpm.
  8. Descarte a solução do fago. Lave a placa 6 vezes com 80 μL de PBST por uma máquina de lavar prato automatizado.
  9. Adicionar 15 μL de PBST-M e 15 μL da proteína A-HRP (1:1, 500 diluído em 1X PBS) para cada poço com uma pipeta multicanal e incubar a RT para 1 h com agitação a cerca de 200 rpm.
  10. Descarte a solução da proteína A-HRP/M-PBST. Lave a placa 6 vezes com 80 μL de PBST.
  11. Adicione o substrato TMB (30 μL/poço), com uma pipeta multicanal e incubar durante 2-3 min, até que a cor se desenvolve. Pare a reação com 1,0 M H3PO4 (30 μL/poço).
  12. Ler as placas espectrofotometricamente a 450 nm. Clones positivos são definidos como aqueles que apresentam uma relação média da absorvância de450 OD de proteína L poços para o bem maior do que 3.0 M-PBST.
  13. Em uma profundidade de 96, infectar 50 μL de SS320 em 2YT/tet em fase de registro com 5 μL do fago mesmo usado para o teste ELISA (etapa 5.6) durante 30 min à RT
  14. Adicionar 950 μL de 2YT/carb ao largo-96 bem da etapa 5.13 e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação a 1.000 rpm.
  15. Extrair o DNA de phagemid pelo kit de extração de DNA de prep mini. Usar os primers montante de VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') e VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') para análise de sequências estimar a diversidade de sequência de biblioteca.

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Resultados

Seguindo o fluxograma da construção biblioteca Fab (ver Figura 1), estamos preparados M13KO7 auxiliar do fago previamente infectado Escherichia coli SS320 electro-competente células. A eficiência dessas células electro-competente é estimada como 2 X 109 UFC / µ g, quando foi usado para construção de biblioteca, espinha dorsal da Fab phagemid (Figura 4).

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Discussão

Para construir a elevada diversidade, fago-exibido Fab bibliotecas, controle de qualidade, pontos de verificação são necessários para monitorar vários estágios do processo de construção, incluindo a competência de células electro-competentes, qualidade do modelo dU-ssDNA, eficiência de CCC-dsDNA síntese, sendo o título após electroporation, Fab de dobramento e diversidade de aminoácidos de CDRs pela análise de sequência de clones Fab-fago.

Alto rendimento e pureza de dU-ssDNA ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores apreciam Dr. Frederic Fellouse do laboratório Sidhu para comentários críticos na construção de biblioteca do Kunkel método com base sintética do fago Fab. Os autores apreciam Sra. Alevtina Pavlenco e outros membros do laboratório Sidhu para ajuda valiosa de alta eficiência electro-competente a preparar células de e. coli e dU-ssDNA de alta qualidade. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant No.: 81572698, 31771006) para DW e pela Universidade de ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) ao laboratório de engenharia de anticorpo.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
1.0 M H3PO4FisherAC29570
1.0 M Tris, pH 8.0Invitrogen15568-025
10 mM ATPInvitrogen18330-019
100 mM dithiothreitolFisherBP172
100 mM dNTP mixGE Healthcare28-4065-60solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-76-02
50X TAEInvitrogen24710030
AgaroseFisherBP160
Carbenicillin, carbSigmaC1389100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmpSigmaC0378100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0InvitrogenAM9620G
Granulated agarVWRJ637-500G
H2O2 peroxidase substrateKirkegaard & Perry Laboratories Inc50-65-02
K2HPO4Sigma795488
Kanamycin, kanFisherAC6112950 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4SigmaP2222
Na2HPO4Sigma94046
NaClAlfa AesarU19C015
NanodropFisherND2000C
NaOHFisherSS256! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered MilkSangon BiotechA600669
PEG-8000FisherBP233
Protein A-HRP conjugateInvitrogen101123
QIAprep Spin M13 KitQiagen22704
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
Recombinant Protein LFisher77679
T4 DNA polymeraseNew England BiolabsM0203S
T4 polynucleotide kinaseNew England BiolabsM0201S
T7 DNA polymeraseNew England BiolabsM0274S
Tetracycline, tetSigmaT766050 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
TryptoneFisher0123-07-5
Tween-20SigmaP2287
Ultrapure glycerolInvitrogen15514-011
UridineSigmaU375025 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extractVWRDF0127-08
NameCompany Catalog NumberComments
Strains
E.coli CJ236New England BiolabsE4141Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320Lucigen60512Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7New England BiolabsN0315S
NameCompany Catalog NumberComments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvetteBTX
96-well 2mL Deep-well platesFisher278743
96-well Maxisorp immunoplatesNunc151759
Baffled flasksCorning
Benchtop centrifugeEppendorf5811000096
Centrifuge bottlesNalgene
ECM-630 electroporatorBTX
Magnetic stir barsNalgene
Thermo Fisher centrifugeFisher
High speed shakerTAITEKMBR-034P
Microplate shakerQILINBEIERQB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wellsRAININ
Mutil-channel pipetteRAININE4XLS
Amicon concentratorMerckUFC803096

Referências

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