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摘要

在模型植物物种 (拟南芥) 上, 对合成小分子进行了高通量筛查。该协议是为液体处理机器人开发的, 它提高了正向化学遗传学筛的速度, 加速了新的小分子对植物生理学的发现。

摘要

化学遗传学正越来越多地被用来解码植物中可能由于基因冗余或致死性而顽固于传统遗传学的特性。然而, 合成小分子具有生物活性的可能性很小;因此, 必须对数以千计的分子进行测试, 以找到感兴趣的。液体处理机器人系统的设计, 以处理大量的样本, 增加了一个化学图书馆可以筛选的速度, 除了最小化/标准化的错误。为了在拟南芥(南芥) 上实现一个5万小分子库的高通量前向化学遗传学屏幕, 开发了使用台式多通道液体处理机器人的协议, 要求最小技术人员参与。通过这些协议, 发现了3271个小分子, 导致可见的表型改变。1563种化合物导致短根, 1148 种化合物变色, 383 种化合物导致根毛和其他, 非分类, 改变, 177 化合物抑制发芽。

引言

在过去的20年中, 植物生物学领域的研究人员已经取得了长足的进步, 使用化学遗传学方法, 无论是正反两方面, 都提高了我们对细胞壁生物合成、骨架、激素合成和信号传递的理解,安歇, 发病机制, 嘌呤生物合成, 和膜贩运1,2,3,4,5。使用正向化学遗传学技术可以识别感兴趣的表型, 并允许研究人员了解特定过程的基因型基础。相反, 逆向化学遗传学寻找与预先确定的蛋白质目标6相互作用的化学物质。在植物生物学中, 拟南芥一直处于这些发现的前沿, 因为它的基因组是小的、映射的和注释的。它有一个短的世代时间, 并且有多个变种人或报告者线为方便辨认异常亚细胞机器7。

有两个主要瓶颈阻碍了正向化学基因筛的进展、初始筛选过程和确定感兴趣的化合物的目标8。提高小分子选择速度的主要帮助是使用自动化和自动化设备9。液体搬运机器人是处理大型小分子库的绝佳工具, 在生物科学 (10) 的推动进程中发挥了重要作用。此处提出的协议旨在缓解与筛选过程相关的瓶颈, 从而使生物活性小分子的识别速度加快.该技术为经营者减轻了劳动和时间负担, 同时也降低了对原理调查人员的经济成本。

到目前为止, 大多数化学库都在1万到2万种化合物之间进行了分析, 其中一些有多达15万个, 一些与70个9、11、12、13、14、15,16. 本文介绍的协议是在5万化合物的小分子库 (见材料表) 上实施的, 迄今在拟南芥上进行了较大的正向化学遗传学筛。这项议定书符合目前的趋势, 以提高效率和速度的前瞻性化学遗传学, 特别是因为它涉及到除草剂发现, 杀虫剂发现, 杀菌剂发现, 药物发现和癌症生物学17 ,18,19,20,21。虽然这项协议在这里与拟南芥一起实施, 但可以很容易地适应细胞培养, 孢子, 甚至在 96-, 384, 或1536孔板中液体培养基中的昆虫。由于其体积小, 拟南芥可在96井板中进行筛选。然而, 在水井中均匀地分配种子是一个挑战。手工播种是准确的, 但劳动密集型, 虽然有设备设计, 以分配种子到96井板, 他们是昂贵的购买。在这里, 我们展示了如何绕过这一步, 只是一个小的准确性损失。

这个方法的总目标是使筛选一个大化学图书馆反对拟南芥更加可管理, 不妥协准确性,通过使用液体搬运机器人。这种方法的使用提高了研究者的效率, 减少了完成初始稀释系列管理和随后的表型屏幕的时间, 允许在解剖显微镜下快速可视化样本, 并迅速新的生物活性小分子的鉴定。图 1在4个步骤中描述了此协议的关键结果。

figure-introduction-1957
图 1: 正向化学遗传学屏幕的整体工作流.要为4个关键步骤中的每一项详细描述的协议概述。1: 接收化学图书馆, 2: 制作稀释库, 3: 制作筛板, 4: 孵化和可视化筛板。请单击此处查看此图的较大版本.

研究方案

1. 创建稀释库

  1. 用手工标签625稀释库板, 确保它们与化学库中相应的印版相匹配。此外, 通过控制台驱动器将流量和流出流软管连接到多通道尖端洗涤自动材质定位器 (阿尔卑斯) (参见材料表)。
  2. 访问计算机并通过设备控制器与多通道尖端洗涤磷酸酶的连接打开洗涤泵以循环水。这将在协议结束时自动关闭。
  3. 装载, 用手, 堆垛机10的附加到堆放机的传送带, 按以下顺序在酒店 A D (图 4, 码垛);一盒 AP96 P20 吸管提示在房间 1, 四96井 V 底板的房间 2-5 与两个上部板块包含库存浓度从有序库和两个较低的板块空 (图 5, 堆垛机)。另外, 在房间6和四96井 V 底板上装载一盒 AP96 P20 吸管提示在 7-9 与二个上部板材包含有序的图书馆的存货集中和二个更低的板空 (图 5, 堆垛机)。
  4. 通过手工设置, 甲板上有一个300毫升水水库在 P3, 一个300毫升70% 乙醇浴 P7, 尖端装载者阿尔卑斯 (TL1), 和多通道尖端洗涤阿尔卑斯 (TW1) (图 4, 甲板和图 5, 甲板)。
  5. 使用操作软件, 现在 AP96 P20 吸管提示从堆垛机10和移动他们到尖端装载者阿尔卑斯。
    注: 1.5 至1.12 均采用液体搬运机器人的操作软件完成;请参阅材料表。
  6. 目前2房间从酒店 A 和分开所有四96井 V 底板在甲板上, 放置底部二在 P4 和 P8 和前二在 P5 和 P9 (图 4)。
  7. 负载 AP96 P20 吸管提示与尖端装载者的磷酸酶到96通道200µL 头。从300毫升水油藏中抽出90µL, 并将 P4 上的96井 V 底稀释板抽出。对 P8 上的盘子重复此步骤。
  8. 将化学库板混合在 P5 上, 反复抽吸和配药15µL 三次。另外, 从 P5 上的化学库板中抽出10µL, 并将10µL 放入 P4 的稀释板中。
  9. 通过反复抽吸和配药50µL, 将 P4 板的溶液混合在一起, 共三次。一旦混合, 清洁 AP96 P20 吸管提示, 通过吸和配药70µL 70% 乙醇从 P7, 然后洗涤他们在多通道尖端洗涤磷酸酶通过吸和配药110% 水量四倍。
  10. 对 P8 和 P9 上的第二对板重复步骤 1.8-1.9。创建第二个96井 V 底稀释板后, 按以下顺序从下到上堆叠板: P9、P5、P8 和 P4。然后, 把栈放在一个空的静止的高山上;无论是 P1、P2、P6、P10、P11、P12 或 P13。
  11. 重复步骤1.6 至 1.10, 直到酒店 A 5 室为空。在到达6室时重复步骤 1.5, 将新的 AP96 P20 吸管提示移到尖端装载者的磷酸酶上, 并将所用的 AP96 P20 吸管提示放在空的静态碱性磷酸酶上。
  12. 重复步骤1.6 至 1.10, 直到酒店 A 的9室为空。然而, 为了前往 B 酒店, 甲板上的盘子和小费必须重新装入酒店 A。
  13. 用手重新填充300毫升的水水库。这一步是至关重要的, 计算机程序可以合并暂停详细说明此消息, 要求用户点击 "继续", 然后再执行下一步骤。
  14. 重复步骤 1.5-1.13 为其余的酒店, 确保一个完整的300毫升水水库每次之前, 前往下一个酒店。

2. 添加培养基-种子混合物筛板

  1. 通过添加4.3 克 MS 盐、0.50 克 MES、1.0 克琼脂至 1 L ½, 使 Murashige 和 Skoog (ms) 培养基与0.1% 琼脂结合, 在 ph 探针的监测下, 将 ph 值调整为 2, 但同时添加5.7 米氢氧化钾.
  2. 用1% 的漂白剂和 SDS 在15和30分钟之间摇动种子, 然后用离心法冲洗4次, 用相同容积的水进行杀菌。一旦种子是无菌的, 将其放置在4摄氏度从24小时到7天为 vernilization。拟南芥生物资源中心描述了杀菌、vernilization 和生长的其他方法22。
  3. 用手在密度为 0.1 g/100 毫升的培养基上添加种子。这个密度导致平均 3-10 种子每井96井板材。
  4. 在酒店 a (图 6, 酒店 a) 的1和2房间中, 手工放置四96井平底板。将一盒 AP96 P250 吸管小贴士放在尖端装载机上, 一个300毫升的水库, 充满了在 P3 步骤 2.1-2.3 中创建的媒体种子混合物, 以及300毫升水库, 在 P7 (图 70%, 甲板和图 4上填充了6乙醇。, 甲板)。
    注: 2.5 到2.8 是用操作软件完成的。
  5. 目前客房1和2在酒店 A, 并分开的栈四板块。在每个空的静态阿尔卑斯 (P4、P5、P6、P8、P9、P10、P11 和 P12) 上放置一个盘子。负载 AP96 P250 吸管提示96通道200µL 头。
  6. 从300毫升的 P3 介质种子库中抽出90µL, 并将其放入前96井平底板中。重复此过程, 直到所有八个板块包含介质种子混合物。
  7. 通过从300毫升水库中吸出70µL, 并在 P7 上填充70% 乙醇, 清洁 AP96 P250 吸管提示。在多通道尖端洗涤磷酸酶的提示冲洗和配药110% 卷水四次, 卸载的提示在 TL1, 并收集的盘子手工。

3. 将小分子添加到筛板上

  1. 手动装载, 一盒 AP96 P250 吸管提示进入酒店1室 a, 两个96井 V 底稀释库板进入房间 2, 4, 6 和 8, 和两个96井平底筛板进入房间 3, 5, 7 和 9 (图 4, 堆垛机和图 7, A 酒店)。此外, 连接软管到和从多通道尖端洗涤磷酸酶到5加仑的水库。
    注: 3.2 到3.10 是用操作软件完成的。
  2. 配置甲板, 以包含300毫升70% 乙醇洗涤水库在 P7;介质种子库可以放在 P3 的甲板上 (图 4、甲板和图 7、甲板)。另外, 通过设备控制器的连接打开控制台驱动器, 通过多通道尖端洗涤磷酸酶循环水。这将在协议结束时自动关闭。
  3. AP96 P250 吸管提示盒从酒店 A, 并将其移动到顶部装载者阿尔卑斯。
  4. 提出96井 V 底稀释库板从2房间 A 到甲板和安置一个在静态阿尔卑斯 P4 和一个在 P8。目前96井平底筛板从酒店 A 3 室到甲板上, 并放置一个在静态的高山 P5 和一个在 P9。
  5. 负载 AP96 P250 吸管提示与尖端装载者的磷酸酶到96通道200µL 头。
  6. 将96井 V 底稀释板与 P4 50 µL 三倍的吸气和配药混合在一起。接着, 从这个盘子中抽出10µL, 并在 P5 上抽出96井平底筛板。
  7. 将溶液在 P5 中混合, 通过吸气和配药50µL 三倍。用乙醇清洗 AP96 P250 吸管小贴士, 从 P7 的水库中吸出70µL 70% 乙醇, 然后在多通道尖端洗涤磷酸酶中通过吸气和分配110% 容积的水四次清洗。
  8. 对第二个96井 V 底稀释库板 (P8) 和96井平底筛板 (P9) 重复步骤3.5 和3.6。
  9. 将两个96井的 V 底稀释库板和两个96井平底筛板叠在一起。将板块移动到静态阿尔卑斯 P1、P2、P6、P10、P11、P12 或 P13。
  10. 重复步骤 3.4-3.9 三次, 添加稀释的化学品, 以筛板共八次。最后, 通过视觉构象检查筛板每口井中种子的数量, 并通过额外的灭菌和 vernalized 的种子补充那些少于三种子的水井。

4. 筛板的孵化和可视化

  1. 在干燥的容器中, 在16/8 光/暗循环中, 在22摄氏度的环境室中孵化96井平底筛板四天。在解剖显微镜下可视化96井平底筛板。记录所有异常表型以供进一步调查。

结果

在解剖显微镜下, 在筛选浓度的基础上, 通过添加小分子来准确、高效地表征表型的能力, 是这种方法在拟南芥上进行化学遗传学的最终目的.当所有5万种化合物被筛选时, 观察到的表型是多种多样的, 可以分成几个不同的类 (图 2)。图 3A-f描述了在解剖显微镜下低放大率观察到的表型的例子。某些表型提供了不?...

讨论

该协议旨在帮助研究人员完成对拟南芥的化学遗传学筛选。我们从5万种化合物 (图 2和图 3) 的屏幕上提供了具有代表性的结果, 其中一个最大的前向化学遗传学屏幕, 在拟南芥上进行, 日期为9,13,23。使用液体搬运机器人, 使稀释库更高效, 筛选库生成, 提高了新化合物识别的速度和效?...

披露声明

作者声明他们没有竞争的财政利益。

致谢

我们感谢 Jozsef 鹳, 米切尔里士满, Jarrad Gollihue, 和安德烈-桑切斯的建设性和关键的讨论。莎琳博士为表型照片。该材料的基础是国家科学基金会根据1355438号合作协议所支持的工作。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
KeyboardLocal ProviderN/AUsed for protocol design and operating the Biomek FX
MouseLocal ProviderN/AUsed for protocol design and operating the Biomek FX
Computer ScreenLocal ProviderN/AUsed for protocol design and operating the Biomek FX
ComputerLocal ProviderN/AUsed for protocol design and operating the Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening LibraryChemBridgeN/AChemical library
Biomek SoftwareBeckman CoulterN/ARuns and designs the Biomek FX
Device ControllerBeckman Coulter719366Operates the water pump/tip washing station
Stacker Carousel PendentBeckman Coulter148240Manual operation of Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker CarouselBeckman Coulter148520Rotary unit that houses all FX Stacker 10's
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Elevator unit that houses components for screen
Biomek FXBeckman Coulterhttps://www.beckman.com/liquid-handlersRobot that performs the desired operations
AccuframeArtisan Technology Group76853-4Frames arm to place components corretly
Framing FixtureBeckman Coulter719415Centers arm in the Accuframe
Multichannel Tip Wash ALPBeckman Coulter719662Washes the tips after the ethanol bath
Tip Loader ALPBeckman Coulter719356Pneumatically loads tips onto the arm
Air CompressorLocal ProviderN/AProvides air for pneumatic tip loading
MasterFlex Console DriveCole-Parmer77200-65Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer
Air HoseLocal ProviderN/AProvides air from air compressor to Tip Loader
Water HoseLocal ProviderN/AProvides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer
Static ALP'sBeckman CoulterComes with Biomek FXSupports equipment for the Screen
5 Gallon ReserviourLocal ProviderN/ARecirculates the dirty water from cleaning the tips
GrippersBeckman CoulterComes with Biomek FXGrabs and moves the equipment to the correct places
96-Channel 200 µL HeadBeckman CoulterComes with Biomek FXHolds the 96 tips used within the screen
AP96 P200 Pipette TipsBeckman Coulter717251Used to make the screening library
96 Well Flat Bottom PlateCostar9018Aids in visulization of screen
96 Well V-Bottom PlateCostar3897Aids in storing of dilution library
AlumaSeal 96 Sealing FilmMedSciF-96-100Seals for storage both the chemicle library and dilution library
Plastic ziplock sandwich bagsLocal ProviderN/AUsed to ensure a humid environment for screen
AP96 P20 Pipette TipsBeckman Coulter717254Used in the dilution library creation
Growth ChamberPercivalAR36L3Germinates seeds for phenotypic visulization
SpatulaLocal ProviderN/AHolds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly
ToothpickLocal ProviderN/APushes seeds from spatula to wells
Murashige and Skoog Basal Salt MixturePhytoTechnology LaboratoriesM524Add to MS media mixture
MES Free Acid MonohydrateFisher ScientificICN19483580Added to MS media to decrease pH
Agar PowderAlfa Aesar9002-18-0Increases thickness of media to support seed suspension
5M KOHSigma-Aldrich484016Increases pH to adequate levels
1L Media Storage BottleCorning1395-1LHolds enough media for a screen
Polypropylene Centrifuge TubesCorning431470Sterilizes seeds prior to vernilization
pH ProbeDavis InstrumentsYX-58825-26Used for making media
ALPs (Automated Labware Positioners) Users ManualBeckman CoulterPN 987836Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX
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Biomek Software User's ManualBeckman CoulterPN 987835Used to set up and understand the Software

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