높은 처리량 앞으로 화학 유전학의 화면 애기 thaliana 을 액체 처리 로봇의 사용을 최적화

요약

합성 작은 분자의 높은 처리량 화면 모델 식물 종, 애기 thaliana에 실시 됐다. 액체 처리 로봇에 대 한 개발이 프로토콜 앞으로 화학 유전학 스크린, 식물 생리학에 영향을 미치는 새로운 작은 분자의 발견을 가속의 속도가 증가 합니다.

초록

화학 유전학은 점점 해독 식물 유전자 중복 또는 치 전통 유전학에 고집 불통 될 수 있는 특성을 채용 되 고 있습니다. 그러나, 생리 되는 합성 분자의 확률이 낮습니다; 따라서, 분자의 수천은 그 관심을 찾기 위해 테스트 되어야 한다. 액체 처리 로봇 시스템은 샘플, 속도는 화학 라이브러리 오류 최소화/표준화 이외에 상영 될 수 증가의 큰 숫자를 처리 하기 위해 설계 되었습니다. 벤치 탑 멀티 채널 액체를 사용 하 여 프로토콜 애기 thaliana (애기)에 50000 작은 분자의 도서관의 높은 처리량 앞으로 화학 유전학 스크린을 달성 하기 위해 필요한 최소한의 개발 되었다 로봇을 처리 기술 자가 참여. 이러한 프로토콜을 3,271 작은 분자는 그 표시 phenotypic 변경 발생 발견 되었다. 1,563 화합물 짧은 뿌리, 1,148 화합물 변경 채색, 383 화합물 발생 루트 머리와 다른, 비-, 분류 변경 및 177 화합물 저해 발 아를 유도 한다.

서문

지난 20 년 동안에서 식물 생물학 분야에서 연구자는 큰 진전을 화학 유전학 방법, 앞으로 및 역방향, 세포 벽 생 합성, 골격, 호르몬 생 합성에 대 한 우리의 이해를 개량 하 고 신호, gravitropism, 병 인, 퓨 린 생 합성, 그리고 endomembrane^,12,3,,45를 인신 매매. 앞으로 화학 유전학 기술을 관심의 고기 식별 가능 하며 특정 프로세스의 genotypic 토대를 이해 연구 반대로, 반대로 화학 유전학 미리 결정된 단백질 대상⁶상호 작용 하는 화학 물질을 찾고 있습니다. 애기 때문에 매핑되고 주석 그것의 게놈은 작은, 식물 생물학에서 이러한 발견의 최전선에 왔다. 그것은 짧은 생성 시간, 그리고 여러 돌연변이/기자 라인 탈 subcellular 기계⁷의 식별을 용이 하 게 사용할 수 있다.

천천히 앞으로 화학 유전 스크린의 진행, 초기 심사 과정 및 관심⁸의 화합물의 목표를 결정 하는 두 가지 주요 병목을 확인 하 고 있습니다. 작은 분자 선택의 속도 증가에서 주요 원조 자동화 및 자동화 된 장비⁹의 사용 이다. 액체 처리 로봇 작은 분자의 큰 도서관을 처리 하기 위한 훌륭한 도구입니다 그리고 생물 과학¹⁰에서 진행을 운전에 도움이 되었습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은. 빠른 속도로 생리 활성 작은 분자의 식별 사용 심사 프로세스와 관련 된 병목을 완화 하도록 설계 되었습니다. 이 기술은 노동의 원리 탐정에 경제적 비용 감소 연산자 대신 시간 부담 감소.

지금까지, 대부분의 화학 라이브러리 분석으로 150, 000와 일부 몇 가지 70^{9,,1112,,1314,} 로 일부 10000 그리고 20000 화합물 사이 개최 ^{15 , 16}. 여기 소개 하는 프로토콜 ( 재료의 표참조) 50000 화합물의 분자 라이브러리에 구현 된, 더 큰 앞으로 화학 유전학 중 화면 날짜에 실시 애기. 이 프로토콜 발견 제 초 제, 살충제의 발견, 살 균 제에 관련 된으로 특히 증가 효율성과 속도 앞으로 화학 유전학에 관한 현재 트렌드에 맞는 발견, 발견, 및 암 생물학^{17 마약 ,,1819,,2021}. 비록 여기 애기와 구현,이 프로토콜을 쉽게 될 수 세포 배양, 포자, 그리고 잠재적으로 심지어 곤충을 96-384 / 1536-잘 접시에서 액체 매체에서. 작은 크기로 인해 애기는 의무가 96 잘 접시에서 심사. 그러나, 우물에 고르게 씨앗 배포는 도전 이다. 손 시드 노동 집약, 하지만 정확한 이며 96 잘 접시에 씨앗을 분배 하도록 하는 장치는, 그들은 저렴 하 게 구입할. 여기, 우리가 어떻게이 단계 피할 수 단지 작은 손실 정확도에 보여줍니다.

이 방법의 전반적인 목표는 애기 더 관리에 대 한 큰 화학 라이브러리 사용을 통해 액체 처리 로봇의 정확도 저하 없이 심사 수 있도록 했다. 이 메서드를 사용 하 여 초기 희석 시리즈 관리 및 후속 phenotypic 화면, 빠른 시각화 해 현미경 그리고 급속 한 샘플의 수를 완료 하는 데 걸린 시간을 감소 하 여 연구원의 효율성 향상 새로운 생리 활성 작은 분자의 id입니다. 그림 1 4 단계에서이 프로토콜의 주요 결과를 보여 줍니다.

그림 1: 앞으로 화학 유전학 스크린의 전체 워크플로. 4 주요 단계의 각각에 대 한 몇 가지 세부 사항에 설명 하는 프로토콜의 개요. 1: 화학 라이브러리, 2 수신: 3 희석 라이브러리 만들기: 심사 접시, 및 4: 잠복기 및 심사 번호판을 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜

1. 희석 라이브러리 만들기

1. 레이블을 625 희석 도서관 판, 화학 라이브러리에서 해당 그들의 접시에 일치 하는지 확인. 또한, 5 갤런 저수지에 콘솔 드라이브를 통해 그들을 전달 하 여 흐름 및 흐름 호스를 멀티 채널 팁 세척 자동화 기구 포지 셔 너 (ALP)를 연결 ( 재료의 표참조).
2. 컴퓨터에 액세스 하 고 물을 회람 하기 위하여 멀티 채널 팁 세척 ALP 장치 컨트롤러의 연결을 통해 세척 펌프를 켭니다. 이 끌 것 이다 자동으로 프로토콜의 끝에.
3. 부하, 손을 스태커 10에 의해에 연결 된 호텔 A-D (그림 4, 스태커);에서 다음 순서로 스태커 회전 목마 객실 1, 96-잘 V 4에서 AP96 P20 피 펫 팁의 한 상자-바닥 접시 객실 2-5에서에서 두 위 접시는 정렬된 라이브러리와 두 낮은 접시 재고 농도 포함 하는 (그림 5, 스태커) 빈. 또한, 객실 6, 및 4 개의 96 잘 V AP96 P20 피 펫 팁의 1 개의 상자를 로드-정렬된 라이브러리와 2 개의 낮은 격판덮개의 재고 농도 포함 하 2 개의 상단 플레이트와 객실 7-9에서에서 하단 플레이트 빈 (그림 5, 스태커).
4. 설정, 손으로, P3, P7에 300 mL 70 %EtOH 목욕에 300 mL 물 저수지와 갑판 팁 로더 ALP (TL1), 그리고 멀티 채널 팁 세척 ALP (TW1) (그림 4, 갑판 및 그림 5, 갑판).
5. 운영 소프트웨어를 사용 하 여 스태커 10에서 AP96 P20 피 펫 팁을 제시 하 고 팁 로더 ALP에 이동.
   참고: 액체 처리 로봇의 운영 소프트웨어; 1.5 1.12 모든 통해 완료 테이블의 자료를 참조 하십시오.
6. 호텔에서 룸 2를 제시 하 고 모든 4 개의 96 잘 V 분리-하단 플레이트는 갑판에 하단 배치 P4, P8에 2 및 P5 P9에 2 위 (그림 4).
7. AP96 P20 피 펫 팁 팁 로더 96 채널 200 µ L 머리에 ALP와 함께 로드 합니다. 300 mL 물 저수지에서 90 µ L 발음 및 96-잘 V에 분배-P4에 바닥판 희석. P8에 접시에 대 한이 단계를 반복 합니다.
8. 반복적으로 발음 및 분배 15 µ L 세 번 P5에 화학 라이브러리 접시를 섞는다. 또한, P5에 화학 라이브러리 접시에서 10 µ L 발음 하 고 P4에 희석 접시에 10 µ L을 분배.
9. 총 세 번 반복적으로 발음 하 고 50 µ L를 분배 하 여 P4에 접시의 솔루션을 믹스. 혼합, 일단 깨끗 한 발음 및 70 µ L의 70%를 분배 하 여 AP96 P20 피 펫 팁 EtOH P7에서 발음 및 물 4의 110% 볼륨을 분배 하 여 멀티 채널 팁 세척 ALP에 세척 그들 시간.
10. P8, P9에 번호판의 두 번째 쌍에 대 한 1.8-1.9 단계를 반복 합니다. 두 번째 96 잘 V 만들기 시-희석 바닥판, 스택 맨 하단에서 다음 순서로 접시: P9, P5, P8, P4. 다음, 한 빈 정적 ALP;에 스택 장소 P1, P2, P6, P10, P11, P12, 또는 P13.
11. 1.6 1.10 단계를 반복 하 여 호텔 A의 객실 5 비어. 1.5 룸 6 도달, 새로운 AP96 P20 피 펫 팁 팁 로더 ALP 고 빈 정적 ALP에 사용 된 AP96 P20 피 펫 팁을 배치에 따라 단계를 반복 합니다.
12. 1.6 1.10 단계를 반복 하 여 호텔의 룸 9 A 비어. 그러나, 호텔 B를 진행 하기 위해서는 접시와 갑판에 팁 해야 합니다 다시 로드 호텔 대답에
13. 다시 작성, 손으로, 300 mL 물 저수지. 이 단계는 중요 한, 그리고 컴퓨터 프로그램 일시 중지를 치고 '계속', 다음 단계를 수행 하기 전에 사용자는이 메시지를 자세히를 통합할 수 있습니다.
14. 나머지 호텔, 보장 전체 300 mL 물 저수지 다음 호텔에 진행 하기 전에 각 시간에 대 한 1.5-1.13 단계를 반복 합니다.

2. 판 상영을 미디어-씨앗 혼합물 추가

1. ½ 重 만들고 Skoog (MS) 미디어 0.1% 조정 5.7에 pH 4.3 g MS 소금, 0.50 g MES, 1.0 g 한 천 1 L 디 H₂o.를 추가 하 여 한 천 하지만 pH 프로브를 모니터링 하는 동안 5 M 수산화 칼륨의 추가.
2. 15 그리고 30 분 사이 1% 표 백제와 SDS에 그들을 떨고 하 여 종자를 소독 하 고 후 원심 분리에 의해 물의 동등한 양으로 4 번 린스. 씨앗은 불 임, 일단 vernilization에 대 한 일 24 시간에서 4 ° C에서 그들을 놓습니다. 애기 생물 자원 센터의 살 균, vernilization, 및 성장²²추가 방법을 설명합니다.
3. 미디어 씨앗 추가 손으로 0.1 g/100 mL의 조밀도에. 이 밀도 96 잘 접시 당 3-10 씨앗의 평균 결과입니다.
4. 손으로, 96-잘 평면 4 장소-객실 1과 2 (그림 6, 호텔) 호텔 A의 하단 접시. AP96 P250 피 펫 팁 팁 로더 ALP의 상자, 300 mL 저수지 2.1-2.3에 P3, 단계에서 만든 미디어 씨 혼합물으로 가득 그리고 300 mL 저수지 가득 70% EtOH P7에 (그림 4, 갑판 및 그림 6 갑판).
   참고: 2.8 통해 2.5 운영 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다.
5. 객실 1과 2 호텔 A에 제시 하 고 4 개의 격판덮개의 더미를 분리. 빈 정적 알프스 (P4, p5 급, P6, P8, P9, P10, P11, 및 P12)의 각각에 한 접시를 놓습니다. 96 채널 200 µ L 머리에 AP96 P250 피 펫 팁을 로드 합니다.
6. P3에 300 mL 미디어 씨 저수지에서 90 µ L 발음 하 고 첫 번째 96 잘 평면으로 분배-하단 접시. 이 프로세스를 반복 하 여 모든 8 접시 포함 미디어 씨 혼합물.
7. 발음 하 고 70% 가득 300 mL 저수지에서 70 µ L를 분배 하 여 AP96 P250 피 펫 팁을 청소 EtOH P7에. 발음 및 분배 물 110% 볼륨 4 번 멀티 채널 팁 세척 ALP에 도움말을 세척 하 고 TL1에서 팁을 언로드 손으로 접시를 수집.

3. 판 검사에 작은 분자를 추가

1. 부하, 손으로, 룸 1의 호텔에 A, 2 96-잘 V AP96 P250 피 펫 팁의 상자-하단 희석 라이브러리 접시 객실 2, 4, 6, 및 8, 및 두 96 잘 평면 하단 상영 판 객실 3, 5, 7, 9 (그림 4 에 스태커 및 그림 7, 호텔 A). 또한, 5 갤런 저수지에 멀티 채널 팁 세척 ALP에서 호스를 연결 합니다.
   참고: 3.10 통해 3.2 운영 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다.
2. P7;에서 300 mL 70 %EtOH 세척 저수지 포함 하 갑판을 구성 미디어-씨앗 저수지 P3에 갑판에 남아 있을 수 있습니다 (그림 4, 갑판 및 그림 7, 갑판). 또한, 멀티 채널 팁 세척 ALP 통해 물 순환 장치 컨트롤러의 연결을 통해 콘솔 드라이브를 켜십시오. 이 끌 것 이다 자동으로 프로토콜의 끝에.
3. AP96 P250 피 펫 팁 상자의 호텔 A에서 제시 하 고 팁 로더 ALP로 이동.
4. 현재 96 잘 V-갑판 및 정적 ALP P4, P8에 하나에 한 장소를 호텔 룸 2 A에서에서 하단 희석 라이브러리 접시. 96-잘 평면 제시-하단 상영 판에서 3 갑판을 호텔 A의 객실 및 하나 정적 ALP P5 및 p 9에.
5. AP96 P250 피 펫 팁 팁 로더 96 채널 200 µ L 머리에 ALP와 함께 로드 합니다.
6. 96-잘 V 믹스-발음 및 분배 50 µ L 세 번 P4에 바닥판 희석. 그 다음이 플레이트에서 10 µ L 발음 하 고 96 잘 평면으로 분배-P5에 바닥판 심사.
7. 발음 및 분배 50 µ L 세 번 P5에 접시에 솔루션을 믹스. 발음 및 70 µ L의 70%를 분배 하 여 에탄올 AP96 P250 피 펫 팁을 청소 EtOH P7와 발음 및 분배의 110% 볼륨으로 멀티 채널 팁 세척 ALP에 팁 물 4 번 다음 세척 저수지에서.
8. 3.5와 3.6 단계를 반복 하 여 두 번째 96 잘 v-희석 라이브러리 바닥판 (P8) 및 96-잘 평면-바닥판 심사 (P9).
9. 스택 2 96-잘 V-함께 하단 희석 라이브러리 접시와 함께 두 96 잘 플랫 바닥 심사 접시. 정적 알프스 P1, P2, P6, P10, P11, P12, 또는 P13 번호판 이동.
10. 반복 단계 3.4-3.9 세 번, 8 번의 총 플레이트 심사에 희석된 화학 제품을 추가. 마지막으로, 시각적 구조를 통해 심사 플레이트의 각 음에 씨앗의 수를 확인 하 고 추가 소독 및 vernalized 씨에 의해 3 씨 그 우물을 보충.

4. 보육 및 판 상영의 시각화

1. 품 어 96 잘 평면 하단 상영 판 4 일 동안 22 ° C에서 환경 챔버에 16/8 명암 주기 건조 증거 컨테이너에서. 96-잘-바닥이 빠진 상영 판 해 현미경 시각화. 추가 조사에 대 한 모든 탈 고기를 기록 합니다.

결과

정확 하 고 효율적으로 특성화 해 현미경 농도 검사에서 작은 분자의 추가에 따라 고기 기능은 애기. 에 앞으로 화학 유전학의이 방법의 최종 목표 모든 50000 화합물 상영 되어 했다 때 관찰 하는 고기 다양 한 되었고 여러 가지 클래스 (그림 2)에 깨진 수 있습니다. 그림 3A -F 해 현미경 저 배율에서 관찰 된 고?...

토론

이 프로토콜은 애기에 앞으로 화학 유전학 스크린 달성에 연구자를 지원 하도록 설계 되었습니다. 우리가 제공 하는 대표적인 결과 50000 화합물 (그림 2 및 그림 3)의 화면에서 가장 큰 앞으로 화학 유전학 스크린 중의 하나는^9,,1323날짜에 애기에 수행. 액체 처리 로봇의 사용에는 더 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keyboard	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Mouse	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer Screen	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening Library	ChemBridge	N/A	Chemical library
Biomek Software	Beckman Coulter	N/A	Runs and designs the Biomek FX
Device Controller	Beckman Coulter	719366	Operates the water pump/tip washing station
Stacker Carousel Pendent	Beckman Coulter	148240	Manual operation of Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker Carousel	Beckman Coulter	148520	Rotary unit that houses all FX Stacker 10's
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
Biomek FX	Beckman Coulter	https://www.beckman.com/liquid-handlers	Robot that performs the desired operations
Accuframe	Artisan Technology Group	76853-4	Frames arm to place components corretly
Framing Fixture	Beckman Coulter	719415	Centers arm in the Accuframe
Multichannel Tip Wash ALP	Beckman Coulter	719662	Washes the tips after the ethanol bath
Tip Loader ALP	Beckman Coulter	719356	Pneumatically loads tips onto the arm
Air Compressor	Local Provider	N/A	Provides air for pneumatic tip loading
MasterFlex Console Drive	Cole-Parmer	77200-65	Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer
Air Hose	Local Provider	N/A	Provides air from air compressor to Tip Loader
Water Hose	Local Provider	N/A	Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer
Static ALP's	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Supports equipment for the Screen
5 Gallon Reserviour	Local Provider	N/A	Recirculates the dirty water from cleaning the tips
Grippers	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Grabs and moves the equipment to the correct places
96-Channel 200 µL Head	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Holds the 96 tips used within the screen
AP96 P200 Pipette Tips	Beckman Coulter	717251	Used to make the screening library
96 Well Flat Bottom Plate	Costar	9018	Aids in visulization of screen
96 Well V-Bottom Plate	Costar	3897	Aids in storing of dilution library
AlumaSeal 96 Sealing Film	MedSci	F-96-100	Seals for storage both the chemicle library and dilution library
Plastic ziplock sandwich bags	Local Provider	N/A	Used to ensure a humid environment for screen
AP96 P20 Pipette Tips	Beckman Coulter	717254	Used in the dilution library creation
Growth Chamber	Percival	AR36L3	Germinates seeds for phenotypic visulization
Spatula	Local Provider	N/A	Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly
Toothpick	Local Provider	N/A	Pushes seeds from spatula to wells
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Add to MS media mixture
MES Free Acid Monohydrate	Fisher Scientific	ICN19483580	Added to MS media to decrease pH
Agar Powder	Alfa Aesar	9002-18-0	Increases thickness of media to support seed suspension
5M KOH	Sigma-Aldrich	484016	Increases pH to adequate levels
1L Media Storage Bottle	Corning	1395-1L	Holds enough media for a screen
Polypropylene Centrifuge Tubes	Corning	431470	Sterilizes seeds prior to vernilization
pH Probe	Davis Instruments	YX-58825-26	Used for making media
ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual	Beckman Coulter	PN 987836	Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX
Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide	Beckman Coulter	609862-AA	Aids in setting up the Stacker Carousel
Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual	Beckman Coulter	PN 987834	Used to frame the Multichannel Pod
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide	Beckman Coulter	PN B32335AB	Used to aid in setting up the Biomek FX
Biomek Software User's Manual	Beckman Coulter	PN 987835	Used to set up and understand the Software