JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Высокая пропускная способность экрана синтетических малых молекул было проведено на модели видов растений, Arabidopsis thaliana. Этот протокол, разработанный для обработки жидких робот, увеличивает скорость вперед химических генетики экранов, ускоряя открытие новых малых молекул, затрагивающих физиологии растений.

Аннотация

Химические генетики все чаще используется для декодирования черты в растениях, которые могут быть непокорных для традиционных генетика ген избыточности или летальность. Однако низка вероятность синтетических малые молекулы, будучи биоактивные; Таким образом для того, чтобы найти те интерес должен испытываться тысячи молекул. Жидкость, робототехники, которые предназначены для обработки большого количества образцов, увеличивая скорость, с которой химические библиотека может проверяться в дополнение к минимуму/стандартизации ошибка обработки. Для достижения высок объём вперед химических генетики экран библиотеки 50000 малых молекул на Arabidopsis thaliana (арабидопсиса), протоколов с помощью многоканальных жидкость стендовые обработки робот были разработаны, которые требуют минимальный техник участие. С помощью этих протоколов были обнаружены 3 271 малых молекул, что вызвало видимые фенотипические изменения. 1,563 соединений индуцированной коротких корней, 1148 соединений изменения окраски, 383 соединений вызвало корневого волоска и другие, не классифицированы, изменения и 177 соединений препятствует прорастанию.

Введение

В последние 20 лет исследователи в области биологии растений добились больших успехов с помощью химических генетики подходов, как вперед, так и обратного, улучшение нашего понимания биосинтез клеточной стенки, цитоскелета, биосинтеза гормонов и сигнализации, Геотропизм, патогенез, биосинтез пуриновых и endomembrane торговля1,-2,-3,-4,-5. Использование техники вперед химических генетики позволяет идентифицировать фенотипов интерес и позволяет исследователям понять генотипической основ конкретных процессов. И наоборот обратная химическая генетики ищет химических веществ, которые взаимодействуют с заранее белка цели6. Arabidopsis был на переднем крае этих открытий в биологии растений, потому что его генома мал, сопоставления и с комментариями. Она имеет короткий поколения время, и есть несколько линий мутант/репортер для облегчения идентификации аберрантных субцеллюлярные машин7.

Существует два основных узких мест, которые замедляют прогресс вперед химических генетических экранов, первоначальный процесс отбора и определения целевого объекта соединения интерес8. Основных помощь в увеличении скорости выделения малых молекул является использование автоматизации и автоматизированное оборудование9. Обработка жидких роботы являются отличным инструментом для обработки больших библиотек малых молекул и сыграли важную роль в стимулировании прогресса в биологических наук10. Здесь представлены протокол предназначен для облегчения узкое место, связанное с процессом отбора, способствующих выявлению биоактивные малых молекул быстрыми темпами. Этот метод уменьшает бремя труда и времени от имени оператора, а также снижение экономической стоимости принцип следователь.

К настоящему времени проанализированы наиболее химических библиотек провели между 10000 и 20000 соединений, некоторые с как 150,000 и некоторые с всего лишь 709,11,12,13,14, 15 , 16. Протокол представил здесь был реализован на маленькой молекулы библиотеки 50000 соединений (см. Таблицу материалы), один из больших вперед химических генетики экраны проводятся на Arabidopsis до настоящего времени. Этот протокол соответствует нынешней тенденции к повышению эффективности и скорости относительно вперед химических генетики, особенно что касается обнаружения гербицидов, инсектицидов обнаружения, фунгицид обнаружить, наркотиков, обнаружения и биологии рака17 ,18,19,,2021. Хотя и здесь реализованы с Arabidopsis, этот протокол, может быть легко адаптирована для культур клеток, споры и потенциально даже насекомых в жидкой среде 96-, 384-или 1536-ну пластины. Из-за ее небольшой размер Arabidopsis поддается скрининга в 96 хорошо пластины. Однако распространение семян равномерно среди скважин является проблемой. Рука посева является точной, но трудоемким, и хотя есть устройства, предназначенные для распределять семена в 96-луночных пластин, они являются дорогостоящими для покупки. Здесь мы покажем, как можно обойти этот шаг с только небольшой потери точности.

Общая цель этого метода было сделать скрининг большой химической библиотеки против Arabidopsis более управляемым, без ущерба для точности, через использование жидкого обработки робота. Использование этого метода повышает эффективность работы исследователя, уменьшая время, необходимое для завершения начального разбавления серии управления и последующих фенотипические экраны, позволяя быстро визуализации образцов под микроскопом рассечения и быстрого выявление новых биологически активных малых молекул. Рисунок 1 изображает этот протокол ключевых результатов в 4 этапа.

figure-introduction-4433
Рисунок 1: рабочий процесс общего экрана вперед химических генетики. Обзор протокола должен быть описан с некоторые детали для каждого из 4 ключевых шагов. 1: получение химического Библиотека, 2: создание разрежения библиотеки, 3: скрининг пластины, и 4: инкубации и визуализации скрининг пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

протокол

1. Создание библиотеки разрежения

  1. Ярлык 625 разрежения библиотека пластины вручную, обеспечение того, что они соответствуют к их соответствующим пластины из химических библиотеки. Кроме того, подключение потока и потока рукавов на многоканальный Совет мыть автоматизированных лабораторное оборудование позиционера (ALP) путем передачи их через диск консоли 5 галлон резервуар (см. Таблицу материалы).
  2. Доступ к компьютеру и включите насос мыть через подключение контроллера устройства для многоканальных Совет мыть ALP для циркуляции воды. Это автоматически выключится в конце протокола.
  3. Нагрузки, от руки, укладчик 10 придает укладчик карусель, в следующем порядке в отелях A - D (рис. 4, укладчик); Одна коробка AP96 P20 наконечники в номер 1, четыре 96-луночных V-нижней пластины в номерах 2-5 с двух верхних пластин, содержащие запасов концентрации от заказанного библиотеки и двух нижних пластин пустой (рис. 5, укладчик). Кроме того, загрузить одну коробку AP96 P20 наконечники в номер 6 и четыре 96-луночных V-нижней пластины в номерах 7-9 с двумя верхней пластины, содержащие запасов концентрации приказал библиотеки и двух нижних пластин пустой (рис. 5, укладчик).
  4. Установите вверх, вручную, палуба с 300 мл воды водохранилища на P3, 300 мл 70% EtOH ванну на P7, Совет погрузчик ALP (TL1) и Совет мыть ALP многоканальный (TW1) (Рисунок 4, палубы и Рисунок 5, палуба).
  5. Используя программное обеспечение, представить AP96 P20 наконечники из 10 укладчик и переместите их в Совет погрузчик ALP.
    Примечание: 1.5 через 1.12 все сделали с жидкостью, обработка робота программного обеспечения; Смотрите Таблицу материалы.
  6. Настоящее время номер 2 от отеля A и разделить все четыре 96-луночных V-нижней плиты на палубе, поместив в нижней два P4 и P8 и два верхних P5 и P9 (рис. 4).
  7. Загрузите AP96 P20 наконечники с кончика погрузчик ALP на голову 200 мкл 96-канал. Аспирационная 90 µL из 300 мл воды водохранилища и обойтись в 96-луночных V-днище разрежения на P4. Повторите этот шаг для пластины на P8.
  8. Смесь химических библиотека пластины на P5 многократно аспирационных и дозирования 15 мкл три раза. Кроме того аспирационная 10 мкл от химического библиотека пластины на P5 и лунки 10 мкл в пластину разрежения на P4.
  9. Смешайте решения пластину на P4, многократно аспирационных и дозирования 50 мкл в общей сложности три раза. После того, как смешанные, чистый AP96 P20 наконечники аспирационных и дозирования 70 мкл 70% EtOH от P7, затем мыть их в ALP Совет мыть многоканальный аспирационных и дозирования 110% объема воды четыре раза.
  10. Повторите шаги 1.8-1.9 для второй пары пластин на P8 и P9. После создания второй 96-луночных V-днище разрежения, стека и пластины в следующем порядке от нижнего к началу: P4, P8, P9 и P5. Затем место стека на одной пустой статические ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 или P13.
  11. Повторите шаги 1.6-1.10 до 5 номер в отеле A является пустым. Повторите шаг 1,5 после достижения номер 6, перемещение новых AP96 P20 наконечники наконечник погрузчик ALP и размещения используется AP96 P20 наконечники на пустой статические ALP.
  12. Повторите шаги 1.6-1.10 до 9 номеров A является пустым. Однако для того, чтобы перейти к отель B, пластины и советы на палубе должны быть перезагружены в отеле A.
  13. Вручную, повторно заполните резервуар для воды 300 мл. Этот шаг имеет решающее значение, и компьютерная программа может включать паузу подробно это сообщение, требующее от пользователя нажмите «продолжить», перед выполнением следующего шага.
  14. Повторите шаги 1,5-1.13 для остальных гостиниц, обеспечивая полный 300 мл воды водохранилища каждый раз перед переходом к следующему отель.

2. Добавление медиа семян смеси для скрининга пластины

  1. ½ фотосинтетическую и СМИ Скуг (МС) с 0.1% агар с добавлением солей 4.3 g MS, 0,50 г МЧС, 1.0 g агар до 1 Л ди H2O. скорректировать рН до 5,7 Хотя добавлением гидроксида калия 5 М при мониторинге с рН зонд.
  2. Стерилизовать семена, встряхивая их в 1% отбеливателя и SDS между 15 и 30 минут, а затем промыть 4 раза с равным объемом воды центрифугированием. После того, как семена стерильными, разместите их на 4 ° C от 24 часов до 7 дней для vernilization. Центр ресурсов биологического Arabidopsis описывает дополнительные методы стерилизации, vernilization и рост22.
  3. Вручную добавьте семена в СМИ на плотности 0,1 г/100 мл. Эта плотность приводит к в среднем 3-10 семян на хорошо 96-луночных плиты.
  4. Место, от руки, четыре 96-луночных плоским-нижней пластины в номера 1 и 2 отеля A (Рисунок 6, Гостиница). Поместите коробку AP96 P250 наконечники на наконечник погрузчик ALP, 300 мл водохранилище заполнены смесью СМИ семян, созданную во время шагов 2.1-2.3 на P3 и 300 мл водохранилище заполняется с 70% EtOH на P7 (Рисунок 4, палубы и Рисунок 6 Для загара).
    Примечание: 2.5 через 2.8 сделали с программное обеспечение.
  5. Номера 1 и 2 в отель и отдельные стеки четырех пластин. Поместите одну пластину на каждой из пустой статической Альп (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 и P12). Загрузите AP96 P250 наконечники на голове 200 мкл 96-канал.
  6. Аспирационная 90 µL из 300 мл медиа семян водохранилища на P3 и обойтись в первый 96-луночных квартиру-днище. Повторите этот процесс до тех пор, пока все восемь плиты содержат смесь СМИ семян.
  7. Очистить AP96 P250 наконечники аспирационных и дозирования 70 мкл от водохранилища 300 мл, заполнены с 70% EtOH на P7. Вымойте Советы в ALP мыть Совет многоканальный аспирационных и дозирования 110% объема воды в четыре раза, выгрузить советы на TL1 и вручную собрать пластины.

3. Добавление малых молекул скрининг пластины

  1. Нагрузка, вручную, коробка AP96 P250 наконечники в номер отеля 1 A, два 96-луночных V-библиотека Плиты днищ разрежения в номера для 2, 4, 6 и 8 и два 96 хорошо плоскодонные скрининг пластин в комнаты, 3, 5, 7 и 9 (рис. 4 Укладчик и рис. 7, отель A). Кроме того подключения шлангов от многоканальный Совет ALP мыть на 5 галлон резервуар и.
    Примечание: 3.2 через 3.10 сделали с программное обеспечение.
  2. Настройте для загара содержат 300 мл 70% EtOH мыть резервуар на P7; СМИ семян водохранилища могут быть оставлены на палубе в P3 (Рисунок 4, палубы и рис. 7, палуба). Кроме того включите диск консоли через подключение контроллера устройства для циркуляции воды через многоканальный Совет мыть ALP. Это автоматически выключится в конце протокола.
  3. Представить AP96 P250 пипеткой Совет поле от отеля A и переместить его в Совет погрузчик ALP.
  4. Настоящее время 96-луночных V-Плиты днищ разрежения библиотеки из 2 номеров A на палубе и место один на статических ALP P4 и один на P8. Настоящее время 96-луночных квартиры-скрининг Плиты днищ от обслуживание 3 Отель A на палубу и один на статических ALP P5 и один на P9.
  5. Загрузите AP96 P250 наконечники с кончика погрузчик ALP на голову 200 мкл 96-канал.
  6. Смешать 96-луночных V-днище разрежения на P4 аспирационных и дозирования 50 мкл три раза. После этого, аспирационная 10 мкл от этой пластины и обойтись в 96-луночных квартиру-днище скрининг на P5.
  7. Смешайте решения в пластину на P5 аспирационных и дозирования 50 мкл три раза. Очистить AP96 P250 наконечники с этанолом, аспирационных и дозирования 70 мкл 70% EtOH из водохранилища на P7 и затем вымыть советы в многоканальный Совет ALP мыть аспирационных и дозирования 110% объема воды в четыре раза.
  8. Повторите шаги 3.5 и 3.6 для второй 96-луночных V-днище разрежения библиотеки (P8) и 96-луночных плоский-скрининг днище (P9).
  9. Стек два 96-луночных V-Плиты днищ разрежения библиотека вместе и два 96-луночных плоский скрининг нижней пластины вместе. Переместите плиты статические Альпы P1, P2, P6, P10, P11, P12 или P13.
  10. Повторите шаги 3.4-3.9 три раза, добавив разреженных химических веществ Скрининг плиты в общей сложности восемь раз. Наконец проверьте количество семян в каждой скважине скрининга пластин через визуальные конформации и дополнение этих скважин с менее трех семян дополнительных стерилизованные и vernalized семян.

4. инкубации и визуализация скрининга пластины

  1. Инкубируйте 96-луночных плоскодонные скрининг пластины для четырех дней в экологической палаты при 22 ° C на цикле свет/темно 16/8 в контейнере доказательство усыхания. Визуализируйте скрининг пластины с плоским дном 96-луночных под микроскопом рассечения. Запись всех фенотипов аномальным для дальнейшего расследования.

Результаты

Способность точно и эффективно охарактеризовать фенотипов, основанные на добавление малых молекул на скрининг концентрации под микроскопом рассечения является конечной целью данного метода вперед химических генетики на арабидопсиса. Фенотипов, когда были про?...

Обсуждение

Этот протокол предназначен для оказания помощи исследователям в выполнении вперед химических генетики экран на Arabidopsis. Мы предоставляем представитель результаты от экрана 50 000 соединений (рис. 2 и рис. 3), один из крупнейших экранов вперед химических гене?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Jozsef аист, Mitchel Ричмонд, Jarrad Gollihue и Андреа Sanchez для конструктивного и критического обсуждения. Д-р Перри Sharyn для фенотипического фотографий. Этот материал основан на работе, поддержке Национального научного фонда под кооперативного соглашения № 1355438.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
KeyboardLocal ProviderN/AUsed for protocol design and operating the Biomek FX
MouseLocal ProviderN/AUsed for protocol design and operating the Biomek FX
Computer ScreenLocal ProviderN/AUsed for protocol design and operating the Biomek FX
ComputerLocal ProviderN/AUsed for protocol design and operating the Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening LibraryChemBridgeN/AChemical library
Biomek SoftwareBeckman CoulterN/ARuns and designs the Biomek FX
Device ControllerBeckman Coulter719366Operates the water pump/tip washing station
Stacker Carousel PendentBeckman Coulter148240Manual operation of Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker CarouselBeckman Coulter148520Rotary unit that houses all FX Stacker 10's
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10Beckman Coulter148522Elevator unit that houses components for screen
Biomek FXBeckman Coulterhttps://www.beckman.com/liquid-handlersRobot that performs the desired operations
AccuframeArtisan Technology Group76853-4Frames arm to place components corretly
Framing FixtureBeckman Coulter719415Centers arm in the Accuframe
Multichannel Tip Wash ALPBeckman Coulter719662Washes the tips after the ethanol bath
Tip Loader ALPBeckman Coulter719356Pneumatically loads tips onto the arm
Air CompressorLocal ProviderN/AProvides air for pneumatic tip loading
MasterFlex Console DriveCole-Parmer77200-65Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer
Air HoseLocal ProviderN/AProvides air from air compressor to Tip Loader
Water HoseLocal ProviderN/AProvides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer
Static ALP'sBeckman CoulterComes with Biomek FXSupports equipment for the Screen
5 Gallon ReserviourLocal ProviderN/ARecirculates the dirty water from cleaning the tips
GrippersBeckman CoulterComes with Biomek FXGrabs and moves the equipment to the correct places
96-Channel 200 µL HeadBeckman CoulterComes with Biomek FXHolds the 96 tips used within the screen
AP96 P200 Pipette TipsBeckman Coulter717251Used to make the screening library
96 Well Flat Bottom PlateCostar9018Aids in visulization of screen
96 Well V-Bottom PlateCostar3897Aids in storing of dilution library
AlumaSeal 96 Sealing FilmMedSciF-96-100Seals for storage both the chemicle library and dilution library
Plastic ziplock sandwich bagsLocal ProviderN/AUsed to ensure a humid environment for screen
AP96 P20 Pipette TipsBeckman Coulter717254Used in the dilution library creation
Growth ChamberPercivalAR36L3Germinates seeds for phenotypic visulization
SpatulaLocal ProviderN/AHolds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly
ToothpickLocal ProviderN/APushes seeds from spatula to wells
Murashige and Skoog Basal Salt MixturePhytoTechnology LaboratoriesM524Add to MS media mixture
MES Free Acid MonohydrateFisher ScientificICN19483580Added to MS media to decrease pH
Agar PowderAlfa Aesar9002-18-0Increases thickness of media to support seed suspension
5M KOHSigma-Aldrich484016Increases pH to adequate levels
1L Media Storage BottleCorning1395-1LHolds enough media for a screen
Polypropylene Centrifuge TubesCorning431470Sterilizes seeds prior to vernilization
pH ProbeDavis InstrumentsYX-58825-26Used for making media
ALPs (Automated Labware Positioners) Users ManualBeckman CoulterPN 987836Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX
Biomek 2000 Stacker Carousel Users GuideBeckman Coulter609862-AAAids in setting up the Stacker Carousel
Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users ManualBeckman CoulterPN 987834Used to frame the Multichannel Pod
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup GuideBeckman CoulterPN B32335ABUsed to aid in setting up the Biomek FX
Biomek Software User's ManualBeckman CoulterPN 987835Used to set up and understand the Software

Ссылки

  1. Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
  2. Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
  3. McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
  4. Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
  5. Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
  6. De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
  7. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
  8. Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
  9. Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
  10. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  11. DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
  12. Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
  13. Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
  14. Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
  15. Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
  16. De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
  17. Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  18. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  19. Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
  20. Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
  21. Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
  22. . Seed Handling Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013)
  23. Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
  24. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
  25. Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
  26. Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
  27. Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены