Optimisation de l’utilisation d’un Robot de manutention liquide pour mener un haut débit avant chimique génétique écran d’Arabidopsis thaliana

Résumé

Un écran à haut débit de petites molécules de synthèse a été réalisé sur les espèces de plantes de modèle, Arabidopsis thaliana. Ce protocole, développé pour un robot de manipulation de liquides, augmente la vitesse d’écrans avant génétique chimique, accélérer la découverte de nouvelles petites molécules affectant la physiologie végétale.

Résumé

Génétique chimique est plus en plus utilisée pour décoder les caractères chez les plantes qui peuvent être récalcitrants à la génétique traditionnelle en raison de la redondance de gène ou de la létalité. Cependant, la probabilité d’une petite molécule synthétique étant bioactive est faible ; par conséquent, des milliers de molécules doivent être testés afin de trouver ceux d’intérêt. Manipulation robotique systèmes sont conçus pour gérer un grand nombre d’échantillons, augmentation de la vitesse avec laquelle une chimique peut être criblée outre minimiser/standardisation erreur de liquides. Pour obtenir un écran haut débit avant génétique chimique d’une bibliothèque de 50 000 petites molécules sur Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocoles utilisant un liquide multicanaux de paillasse robot de manutention ont été élaborés nécessitant un minimum participation du technicien. Avec ces protocoles, 3 271 petites molécules ont été découverts qui a provoqué des altérations phénotypiques visibles. 1 563 composés induisirent des racines courtes, coloration de 1 148 composés modifiés, 383 composés causés les poils absorbants et autres, hors-catégorie, altérations et la germination de 177 composés inhibées.

Introduction

Au cours des 20 dernières années chercheurs dans le domaine de la biologie végétale ont fait des progrès considérables, grâce à la génétique chimique avant et arrière, améliorer notre compréhension de la biosynthèse de la paroi de la cellule, le cytosquelette, la biosynthèse des hormones et de signalisation, gravitropisme, pathogenèse, biosynthèse de la purine et endomembranaire traite^1,2,3,4,5. Employant des techniques de génétique chimique avant permet l’identification des phénotypes d’intérêt et permet aux chercheurs de comprendre les fondements génotypiques des procédés particuliers. À l’inverse, génétique chimique inverse recherche les produits chimiques qui interagissent avec une protéine pré-déterminé cible⁶. Arabidopsis a été à l’avant-garde de ces découvertes en biologie végétale, parce que son génome est petit, mappé, avec mention. Il a un temps de génération court, et il y a plusieurs lignes de mutant/journaliste disponibles afin de faciliter l’identification des machines subcellulaire aberrante⁷.

Il y a deux principaux goulets d’étranglement qui ralentissent la progression d’avancer les écrans génétiques chimiques, le processus de sélection et de déterminer la cible du composé d’intérêt⁸initial. Une aide importante en augmentant la vitesse de sélection de petite molécule est l’utilisation de l’automatisation et l’équipement automatisé de⁹. Robots de manutention de liquides sont un excellent outil pour gérer les grandes bibliothèques de petites molécules et ont joué un rôle important dans la conduite des progrès dans les sciences biologiques¹⁰. Le protocole présenté ici vise à alléger le goulot d’étranglement lié au processus de sélection, permettant d’identifier des molécules bioactives petits à un rythme accéléré. Cette technique diminue la charge de travail et le temps pour le compte de l’opérateur tout en diminuant aussi le coût économique à l’enquêteur de principe.

Jusqu’ici, les bibliothèques plus chimiques analysés ont lieu entre 10 000 et 20 000 composés, certains avec jusqu'à 150 000 et certains avec aussi peu que 70^{9,11,12,13,14, 15 , 16}. le protocole présenté ci-après a été implémenté sur une bibliothèque de petite molécule de 50 000 composés (voir la Table des matières), un de la plus grande génétique chimique avant écrans menée sur Arabidopsis à ce jour. Ce protocole s’inscrit dans la tendance actuelle vers une efficacité accrue et la vitesse au sujet du avant génétique chimique, en particulier en ce qui concerne à la découverte de l’herbicide, découverte de l’insecticide, fongicide Découvrez, drug discovery et la biologie du cancer^{17 ,18,19,20,21}. Bien que mis en œuvre ici avec Arabidopsis, ce protocole, pourrait facilement être adaptés aux cultures de cellules, des spores et potentiellement même insectes dans un milieu liquide dans 96-, 384- ou plaques 1536 puits. En raison de sa petite taille, Arabidopsis se prête au dépistage en plaques bien 96. Toutefois, distribuer les graines uniformément entre les puits est un défi. Ensemencement de la main est exacte mais de forte intensité de main de œuvre, et qu’il existe des dispositifs conçus pour répartir les graines dans des plaques à 96 puits, ils sont coûteux à l’achat. Ici, nous montrons comment cette étape peut être contournée avec juste une petite perte en précision.

L’objectif général de cette méthode était de faire le dépistage d’une grande bibliothèque chimique contre Arabidopsis plus facile à gérer, sans compromettre la précision, via l’utilisation d’un robot de manipulation de liquides. L’utilisation de cette méthode améliore l’efficacité du chercheur en diminuant le temps nécessaire pour compléter la gestion de série de dilution initiale et des examens subséquents phénotypiques, ce qui permet une visualisation rapide des échantillons sous un microscope à dissection et rapide identification de nouvelles petites molécules bioactives. La figure 1 illustre les principaux résultats de ce protocole en 4 étapes.

Figure 1 : flux de travail dans l’ensemble de l’écran avant génétique chimique. Une vue d’ensemble du protocole pour être décrit avec quelque détail pour chacune des 4 étapes clés. 1 : recevant la bibliothèque chimique, 2 : faire la Dilution bibliothèque, 3 : rendre les plaques de dépistage et 4 : incubation et visualiser les plaques de projection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocole

1. création d’une bibliothèque de Dilution

1. Étiquettes de marquage de Dilution bibliothèque 625 à la main, s’assurer qu’ils correspondent à leur plaque correspondante de la bibliothèque chimique. De plus, se connecter au flux et tuyaux d’écoulement pour le multicanal Astuce lavage automatisé Labware positionneur (ALP) en les passant à travers le disque de la Console pour le réservoir de 5 gallons (voir Table des matières).
2. Accéder à l’ordinateur et allumez la pompe de lavage grâce à la connexion du contrôleur de périphérique à l’Alpe de lavage multicanale Astuce afin de faire circuler l’eau. Il s’éteindra automatiquement à la fin du protocole.
3. Charge, à la main, le gerbeur électrique 10 fixée pour le Carrousel de Stacker, dans l’ordre suivant dans les hôtels A - D (Figure 4, Stacker) ; une boîte de pointes de Pipette AP96 P20 dans la salle 1, quatre 96 puits V-plaques de fond en chambres de 2 à 5 avec les deux plaques supérieures contenant des concentrations de stock de la bibliothèque ordonnée et les deux plaques inférieures vide (Figure 5, Stacker). En outre, charger une seule boîte de pointes de Pipette AP96 P20 dans la salle 6 et quatre V de 96 puits-plaques de fond dans les salles 7 à 9 avec les deux plaques supérieures contenant des concentrations de stock de la bibliothèque ordonnée et les deux plaques inférieures vide (Figure 5, Stacker).
4. La valeur maximum, à la main, le pont avec un réservoir d’eau 300 mL sur P3, un bain d’EtOH 70 % 300 mL sur P7, astuce Loader ALP (TL1) et multicanal Astuce lavage ALP (TW1) (Figure 4, pont et Figure 5, pont).
5. En utilisant le logiciel d’exploitation, présenter des pointes de Pipette AP96 P20 du Stacker 10 et déplacez-les vers l’Alpe de chargeur Tip.
   NOTE : 1.5 par 1.12 tous se font avec le liquide de traitement logiciel de fonctionnement du robot ; Voir Table des matières.
6. Présenter 2 chambre d’Hotel A et séparer tous les quatre 96 puits V-fond plaques sur le pont, mettant le bas deux P4 et P8 et les deux premiers sur P5 et P9 (Figure 4).
7. Charger les pointes de Pipette P20 AP96 avec le chargeur de pointe ALP sur la 96 voies 200 µL tête. Aspirer 90 µL dans le réservoir d’eau de 300 mL et diluer dans le V de 96 puits-plaque de Dilution de fond sur P4. Répétez cette étape pour la plaque sur P8.
8. La composition de la plaque bibliothèque chimique sur P5 de répétitivement aspirant et 15 µL de distribution trois fois. En outre, aspirer 10 µL de la plaque de bibliothèque chimique au P5 et distribuer 10 µL dans la plaque de dilution sur P4.
9. Mélanger les solutions de la plaque sur P4 par répétitivement aspirer et distribuer 50 µL trois fois au total. Une fois mélangé, nettoyer les pointes de Pipette AP96 P20 par aspiration et la distribution de 70 µL de 70 % EtOH de P7, puis les laver dans l’Alpe multicanale astuce de lavage par aspiration et distribution d’un volume de 110 % d’eau quatre fois.
10. Répétez les étapes 1,8-1,9 pour la deuxième paire de plaques à P8 et P9. À la création du deuxième V 96 puits-plaque de fond Dilution, pile les plaques dans l’ordre suivant de bas en haut : P4, P5, P8 et P9. Ensuite, placez la pile sur un vide ALP statique ; soit P1, P2, P6, P10, P11, P12 et P13.
11. Répétez les étapes 1.6-1.10 jusqu'à 5 chambre à l’Hotel A est vide. Répétez l’étape 1.5 pour atteindre la salle 6, se déplaçant de nouvelles pointes de Pipette P20 AP96 vers l’Alpe de chargeur Tip et placer les pointes de Pipette AP96 P20 utilisé sur un alpage statique vide.
12. Répétez les étapes 1.6-1.10 jusqu'à 9 chambre d’Hotel A est vide. Toutefois, afin de procéder à l’hôtel B, les plaques et les conseils sur le pont doivent être rechargées en Hotel A.
13. Re-remplir à la main, le réservoir d’eau de 300 mL. Cette étape est fondamentale, et le programme informatique peut intégrer une pause détaillant ce message, obligeant l’utilisateur à frapper « continuer », avant d’effectuer l’étape suivante.
14. Répétez les étapes 1.5-1.13 pour les autres hôtels, assurant un réservoir d’eau plein 300 mL chaque fois avant de procéder à l’hôtel suivant.

2. mélange de médias-graines en ajoutant aux plaques de contrôle

1. Faire ½ milieu de Murashige et Skoog (MS) médias avec 0,1 % Agar par l’ajout de 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar à 1 L DI H₂O. ajuster le pH à 5,7, bien que l’ajout d’hydroxyde de potassium 5 M tout en surveillant avec une sonde de pH.
2. Stériliser les graines en les secouant dans 1 % eau de Javel et SDS entre 15 et 30 min et puis rincez 4 fois avec un volume égal d’eau par centrifugation. Une fois que les graines sont stériles, les placer à 4 ° C de 24 heures à 7 jours pour vernilization. Le centre de ressources biologiques Arabidopsis décrit les autres méthodes de stérilisation, vernilization et²²de la croissance.
3. Ajoutez les graines aux médias à la main à une densité de 0,1 g/100 mL. Cette densité se traduit par une moyenne de 3-10 graines / puits d’une plaque de 96 puits.
4. Place, à la main, quatre plat de 96 puits-plaques de fond dans les salles 1 et 2 de l’hôtel A (Figure 6, Hotel A). Placez une boîte de pointes de Pipette AP96 P250 sur l’Alpe de chargeur Tip, un réservoir de 300 mL remplie avec le mélange de graines de médias créé aux étapes 2.1 à 2.3 sur P3 et un réservoir de 300 mL rempli avec 70 % EtOH sur P7 (Figure 4, pont et Figure 6 Pont).
   NOTE : 2.5 à 2.8 sont effectués avec le logiciel d’exploitation.
5. Présenter les pièces 1 et 2 à l’hôtel A et séparer les piles de quatre assiettes. Placer une assiette sur chacun des Alpes vide statique (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 et P12). Charger les pointes de Pipette AP96 P250 sur la 96 voies 200 µL tête.
6. Aspirer 90 µL dans le réservoir de médias-graine de 300 mL sur P3 et verser dans le premier plat de 96 puits-plaque de fond. Répétez ce processus jusqu'à ce que tous les huit plaques contiennent le mélange de graines de médias.
7. Nettoyer les pointes de Pipette P250 AP96 par aspiration et la distribution de 70 µL dans le réservoir de 300 mL rempli à 70 % EtOH sur P7. Lavez les pointes dans le multicanal Tip laver ALP par aspiration et un volume de 110 % de l’eau de distribution quatre fois, décharger les conseils à TL1 et rassembler les plaques à la main.

3. ajouter des petites molécules à plaques de dépistage

1. Charge, à la main, une boîte de pointes de Pipette AP96 P250 en salle 1 de l’hôtel A, deux V 96 puits-plaques de bibliothèque de Dilution de fond en chambres 2, 4, 6 et 8 et deux 96 bien à fond plat de dépistage plaques en chambres de 3, 5, 7 et 9 (Figure 4 Empileur et Figure 7, hôtel A). En outre, raccorder des tuyaux vers et depuis l’Alpe de lavage Tip multicanal pour le réservoir de 5 gallons.
   NOTE : 3.2 à 3.10 sont effectués avec le logiciel d’exploitation.
2. Configurer le pont pour contenir un réservoir 300 mL 70 % EtOH lavage P7 ; le réservoir de médias-graine peut rester sur le pont à P3 (Figure 4, pont et Figure 7, pont). En outre, allumez le lecteur de la Console via connexion du contrôleur de périphérique à faire circuler l’eau à travers l’Alpe de lavage Tip multicanale. Il s’éteindra automatiquement à la fin du protocole.
3. Présente la AP96 P250 Pipette Tip boîte de Hôtel A et déplacez-le vers l’Alpe de chargeur Tip.
4. Présenter le V de 96 puits-plaques de bibliothèque de Dilution de fond de 2 chambre d’Hotel A sur le deck et placer un P4 ALP statique et P8. Présenter le plat de 96 puits-plaques de projection du fond de la salle 3 de l’hôtel A sur le pont et placez une sur ALP statique P5 et sur P9.
5. Charger les pointes de Pipette P250 AP96 avec le chargeur de pointe ALP sur la 96 voies 200 µL tête.
6. Mélanger le V de 96 puits-plaque de Dilution de fond sur P4 par aspiration et 50 µL de distribution trois fois. Par la suite, aspirer 10 µL de cette plaque et verser dans le plat de 96 puits-plaque de fond préalable sur P5.
7. Mélanger les solutions dans la plaque à P5 en aspirant et 50 µL de distribution trois fois. Nettoyer les pointes de Pipette P250 AP96 avec de l’éthanol par aspiration et la distribution de 70 µL de 70 % EtOH provenant du réservoir à P7 et puis lavez les pointes à l’ALP multicanale Astuce lavage par aspiration et distribution d’un volume de 110 % de l’eau quatre fois.
8. Répétez les étapes 3.5 et 3.6 pour le second V 96 puits-plaque de bibliothèque de Dilution inférieure (P8) et plat de 96 puits-plaque de fond préalable (P9).
9. Empiler les deux 96 puits V-plaques de Dilution bibliothèque fond ensemble et les deux plaques de fond préalable 96 puits plat ensemble. Passer les plaques à statique Alpes P1, P2, P6, P10, P11, P12 et P13.
10. Répétez les étapes 3,4-3,9 trois fois, ajouter des produits chimiques dilués à projection plaques huit fois au total. Enfin, vérifiez le nombre de graines dans chaque loge des présélection des plaques conformation visual et compléter ces puits avec moins de trois graines par des graines stérilisées et vernalisées supplémentaires.

4. l’incubation et la visualisation des plaques de dépistage

1. Incuber les plaques à 96 puits à fond plat de dépistage pendant quatre jours dans une chambre à 22 ° C sur un cycle de lumière/obscurité de 16/8 dans un contenant étanche de la dessiccation. Visualiser les plaques 96 puits à fond plat de dépistage sous un microscope à dissection. Enregistrer tous les phénotypes aberrants pour complément d’enquête.

Résultats

La capacité à exactement et efficacement caractériser les phénotypes basées sur l’ajout de petites molécules au dépistage des concentrations sous un microscope à dissection est l’objectif final de cette méthode de génétique chimique avant sur Arabidopsis. Les phénotypes observés lorsque tous les 50 000 composés ont été menées est diverses et peut être divisée en plusieurs classes distinctes (Figure 2). Figu...

Discussion

Ce protocole est conçu pour aider les chercheurs dans la réalisation d’un écran de génétique chimique avant sur Arabidopsis. Nous fournissons des résultats représentatifs d’un écran de 50 000 composés (Figure 2 et Figure 3), un des plus grands écrans avant génétique chimique effectuée sur Arabidopsis à ce jour^9,13,23. L’utilisation d’un robot de ma...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keyboard	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Mouse	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer Screen	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening Library	ChemBridge	N/A	Chemical library
Biomek Software	Beckman Coulter	N/A	Runs and designs the Biomek FX
Device Controller	Beckman Coulter	719366	Operates the water pump/tip washing station
Stacker Carousel Pendent	Beckman Coulter	148240	Manual operation of Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker Carousel	Beckman Coulter	148520	Rotary unit that houses all FX Stacker 10's
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
Biomek FX	Beckman Coulter	https://www.beckman.com/liquid-handlers	Robot that performs the desired operations
Accuframe	Artisan Technology Group	76853-4	Frames arm to place components corretly
Framing Fixture	Beckman Coulter	719415	Centers arm in the Accuframe
Multichannel Tip Wash ALP	Beckman Coulter	719662	Washes the tips after the ethanol bath
Tip Loader ALP	Beckman Coulter	719356	Pneumatically loads tips onto the arm
Air Compressor	Local Provider	N/A	Provides air for pneumatic tip loading
MasterFlex Console Drive	Cole-Parmer	77200-65	Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer
Air Hose	Local Provider	N/A	Provides air from air compressor to Tip Loader
Water Hose	Local Provider	N/A	Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer
Static ALP's	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Supports equipment for the Screen
5 Gallon Reserviour	Local Provider	N/A	Recirculates the dirty water from cleaning the tips
Grippers	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Grabs and moves the equipment to the correct places
96-Channel 200 µL Head	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Holds the 96 tips used within the screen
AP96 P200 Pipette Tips	Beckman Coulter	717251	Used to make the screening library
96 Well Flat Bottom Plate	Costar	9018	Aids in visulization of screen
96 Well V-Bottom Plate	Costar	3897	Aids in storing of dilution library
AlumaSeal 96 Sealing Film	MedSci	F-96-100	Seals for storage both the chemicle library and dilution library
Plastic ziplock sandwich bags	Local Provider	N/A	Used to ensure a humid environment for screen
AP96 P20 Pipette Tips	Beckman Coulter	717254	Used in the dilution library creation
Growth Chamber	Percival	AR36L3	Germinates seeds for phenotypic visulization
Spatula	Local Provider	N/A	Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly
Toothpick	Local Provider	N/A	Pushes seeds from spatula to wells
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Add to MS media mixture
MES Free Acid Monohydrate	Fisher Scientific	ICN19483580	Added to MS media to decrease pH
Agar Powder	Alfa Aesar	9002-18-0	Increases thickness of media to support seed suspension
5M KOH	Sigma-Aldrich	484016	Increases pH to adequate levels
1L Media Storage Bottle	Corning	1395-1L	Holds enough media for a screen
Polypropylene Centrifuge Tubes	Corning	431470	Sterilizes seeds prior to vernilization
pH Probe	Davis Instruments	YX-58825-26	Used for making media
ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual	Beckman Coulter	PN 987836	Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX
Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide	Beckman Coulter	609862-AA	Aids in setting up the Stacker Carousel
Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual	Beckman Coulter	PN 987834	Used to frame the Multichannel Pod
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide	Beckman Coulter	PN B32335AB	Used to aid in setting up the Biomek FX
Biomek Software User's Manual	Beckman Coulter	PN 987835	Used to set up and understand the Software