Sıvı işleme bir yüksek üretilen iş ileri kimyasal genetik ekran Arabidopsis thaliana yapmak için Robot kullanımı en iyi duruma getirme

Özet

Sentetik küçük moleküllerin yüksek üretilen iş ekran modeli bitki türleri, Arabidopsis thalianayapılmıştır. Sıvı işleme robot için geliştirilen bu iletişim kuralı, ileri kimyasal genetik ekranlar, Bitki fizyolojisi etkileyen roman küçük moleküller keşfi hızlanan hızını artırır.

Özet

Kimyasal genetik giderek gen artıklık veya ölümcül nedeniyle geleneksel genetik inatçı olabilir bitkiler özellikleri kodunu çözmek için istihdam olmak. Ancak, sentetik bağlanabilecek küçük bir moleküldür biyoaktif olma olasılığı düşüktür; Bu nedenle, moleküller binlerce ilgi bulmak için test gerekir. Robot sistemleri çok sayıda örnekleri, hangi ile kimyasal bir kütüphane en aza/hata standartlaştırılması ek olarak taranması hızı artan işlemek için tasarlanmıştır işleme sıvı. Bir tezgah üstü çok kanallı sıvı kullanarak kitaplığa Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), üzerinde 50.000 küçük moleküllerin yüksek üretilen iş ileri kimyasal genetik ekranı ulaşmak için protokolleri robot işleme geliştirilmiş olup, tüm en az gerektiren teknisyen katılımı. Bu protokoller ile 3,271 küçük moleküller görünür fenotipik değişiklikler neden olduğu keşfedildi. 1,563 bileşikleri kısa kök, 1,148 bileşikler değişmiş renklendirme, 383 bileşikler neden kök saç ve diğer, Sigara kategorize, değişiklikler ve 177 bileşikler inhibe çimlenme indüklenen.

Giriş

Son 20 yılda bitki Biyoloji alanındaki araştırmacılar hücre duvarı sentezi, sitoiskeleti, hormon sentezi anlayışımızı geliştirmek ve sinyal kimyasal genetik yaklaşımları, ileriye ve geriye doğru kullanarak büyük atılımlar yapmış, gravitropism, Patogenez, pürin biyosentezi ve^1,2,3,4,5kaçakçılığı endomembrane. İleri kimyasal genetik teknikler kullanan fenotipleri ilgi kimliği sağlar ve belirli işlemleri genotypic temellerini anlamak araştırmacılar sağlar. Diğer taraftan, ters kimyasal genetik bir önceden belirlenmiş protein hedef⁶ile etkileşim kimyasallar arar. Eşlenen ve açıklamalı genomunu küçük olduğu için Arabidopsis bu keşifler bitki Biyoloji ön planda olmuştur. Bu kısa oluşturma süresi ve anormal hücre altı makine⁷tanımlaması kolaylaştırmak kullanılabilir birden çok mutant/muhabir hatları vardır.

İleri kimyasal genetik ekranlar ilerlemesini, ilk eleme süreci ve bileşik faiz⁸hedef belirleme yavaş iki önemli performans sorunları vardır. Küçük molekül seçimi hızını artırarak büyük bir yardım otomasyon ve otomatik ekipman⁹kullanmaktır. Sıvı işleme robotlar büyük kütüphaneler küçük moleküllerin işleme için mükemmel bir araçtır ve biyolojik bilimler¹⁰' ilerleme sürüş vesile olmuştur. Burada sunulan Protokolü biyoaktif küçük moleküller hızlı bir hızda. kimliği etkinleştirme tarama süreci ile ilgili performans sorunu hafifletmek için tasarlanmıştır Bu teknik emek ve zaman operatör adına da ilke araştırmacı için ekonomik maliyet azalan süre yükünü azaltır.

Şimdiye kadar en kimyasal kitaplıkları analiz 10.000 ve 20.000 bileşikleri, bazı kadar 150.000 ve bazı az 70^{9,11,12,13,14,} ile arasında düzenlenen ^{15 , 16}. burada tanıttı protokolü 50.000 bileşikler (bkz. Tablo reçetesi) küçük molekül Kütüphanesi hayata geçirildi, bir büyük ileri kimyasal genetiğin ekranlar üzerinde yürütülen Arabidopsis bugüne. Özellikle ilgilidir gibi herbisit bulma, böcek ilacı bulma, mantar ilacı doğru artan verimlilik ve hız ile ilgili ileri kimyasal genetik, mevcut trendi ile bu iletişim kuralını uyar keşfetmek, ilaç keşif ve kanser Biyoloji^{17 ,18,19,20,21}. Burada Arabidopsis ile uygulanan rağmen bu iletişim kuralı, kolayca olabilir hücre kültürleri, sporları ve potansiyel olarak bile böcekler için adapte 96, 384 veya 1536-şey tabak içinde sıvı ortamda. Kendi küçük boyutları nedeniyle, Arabidopsis mükellef taraması 96 iyi tabak içinde. Ancak, kuyular arasında eşit şekilde tohumu dağıtma bir mücadeledir. El tohum emek yoğun doğrudur ve tohum 96-şey kalıplara dağıtmak üzere tasarlanan aygıt olsa, onlar satın almak pahalıdır. İşte, nasıl bu adım küçük bir kayıp ile doğruluk atlatılabilmişlerdir göstermektedir.

Bu yöntem genel amacı doğruluğu, üzerinden bir sıvı işleme robot kullanımı ödün vermeden Arabidopsis daha yönetilebilir karşı büyük bir kimyasal Kütüphane eleme yapmaktı. İlk seyreltme serisi yönetimi ve örnekleri bir diseksiyon mikroskop altında ve hızlı hızlı görselleştirme izin sonraki fenotipik ekranlar tamamlamak için geçen süre azaltarak, bu yöntemin kullanılması araştırmacının daha etkili olmasını sağlar kimliği roman biyoaktif küçük moleküller. Şekil 1 4 adımda bu protokolün önemli sonuçlar gösterilmektedir.

Şekil 1: genel iş akışı ileri kimyasal genetik ekranın. Bazı detay ile her 4 önemli adımlar için açıklanan protokol genel bir bakış. 1: kimyasal Kütüphane, 2 alma: seyreltme Kütüphane, 3 yapım: yapım eleme plakaları ve 4: kuluçka ve eleme kaplamalar görselleşebilme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

1. seyreltme kitaplığı oluşturma

1. 625 seyreltme Kütüphane plakaları el ile kimyasal kitaplığından kendi karşılık gelen plakasına eşleştikleri sağlanması etiketleyin. Ayrıca, bağlantı akışı ve akış hortumlar için çok kanallı ipucu yıkama otomatik aygıtlar Pozisyoner (ALP) dışarı 5 galon rezervuar konsol sürücü geçerek ( Tablo malzemelerigörmek).
2. Bilgisayara erişmek ve çok kanallı ipucu yıkama ALP için aygıt denetleyicisi bağlantısı üzerinden yıkama pompası su geçirilip yorumlanması için dolaştırmak için açın. Bu protokol sonunda otomatik olarak kapanır.
3. Yük, el, Stacker 10'ın Stacker Carousel, otel A - D (şekil 4, Stacker); aşağıdaki sırayla bağlı bir kutu AP96 P20 pipet ipuçları Oda 1, dört 96-şey V-Odalar 2-5 alt levha sipariş edilen Kütüphane ve iki alt plaka hisse senedi konsantrasyonları içeren iki üst plakalı boş (şekil 5, Stacker). Ayrıca, Oda 6 ve dört 96-şey V AP96 P20 pipet ipuçlarında, bir kutu yüklemek-Odalar 7-9 alt levha sipariş edilen Kütüphane ve iki alt plaka hisse senedi konsantrasyonları içeren iki üst plakalı boş (şekil 5, Stacker).
4. P3, 300 mL % 70 alkol banyo P7 üzerinde üzerinde 300 mL su haznesi ile güverte, el ile ayarla ipucu yükleyici ALP (TL1) ve çok kanallı ipucu yıkama ALP (TW1) (şekil 4, güverte ve şekil 5, güverte).
5. İşletim yazılımı kullanarak, Stacker 10'dan AP96 P20 pipet ipuçları sunmak ve ipucu yükleyici ALP taşıyın.
   Not: 1.5 1.12 tüm aracılığıyla robotun çalışma yazılım işleme sıvı ile yapılır; Tablo malzemelerigörmek.
6. Mevcut Oda 2 otel a ve tüm dört 96-şey V ayrı-alt tabaklar güverte üzerinde alt yerleştirerek iki P4 ve P8 ve ilk iki P5 ve P9 (şekil 4).
7. AP96 P20 pipet ipuçları ile uç yüklü ALP 96-kanal 200 µL baş üzerine yükleyin. 300 mL su rezervuar 90 µL Aspire edin ve 96-şey V dağıtmak-alt seyreltme plaka P4 üzerinde. P8 tabağa için bu adımı yineleyin.
8. P5 kimyasal Kütüphane tabağa hkr alıyorum ve 15 µL üç kez dağıtımı ile karıştırın. Ayrıca, P5 kimyasal Kütüphane tabağa üzerinden 10 µL Aspire edin ve P4 seyreltme tabağın içine 10 µL dağıtmak.
9. P4 tabağa çözümleri sürekli alıyorum ve 50 µL dağıtımı tarafından toplam üç kez karıştırın. Temiz karışınca alıyorum ve % 70 70 µL dağıtımı tarafından AP96 P20 pipet ipuçları sonra onları yıkama çok kanallı ipucu yıkama ALP alıyorum ve su dört bir %110 hacim dağıtımı tarafından alkol P7, üzerinden zaman.
10. P8 ve P9 Tabaklarda ikinci çifti için 1,8 1,9 adımları yineleyin. İkinci 96-şey V oluşturma üzerine-alt seyreltme plaka, plaka ile aşağıdaki sırada alt üst yığını: P9, P5, P8 ve P4. Sonra yığının üzerinde bir boş statik ALP yer; P1, P2, P6, P10, P11, P12 veya P13.
11. Oda 5 otel a boş 1.6-1,10 tamamlayana dek. Oda 6 ulaşan, yeni AP96 P20 pipet ipuçları için ipucu yükleyici ALP hareketli ve kullanılan AP96 P20 pipet ipuçları üzerinde boş bir statik ALP yerleştirerek üzerine 1.5 adımı yineleyin.
12. Oda otel 9 A boş 1.6-1,10 tamamlayana dek. Ancak, otel B için devam etmek için tabakalar ve ipuçları güvertede otel A. yeniden yüklenmesi gerekir
13. , El ile 300 mL su haznesi yeniden doldurun. Bu adım çok önemlidir ve bilgisayar programı 'devam, sonraki adımı gerçekleştirmeden önce' vurmak kullanıcı gerektiren bu mesajı ayrıntılı bir duraklama dahil edebilirsiniz.
14. Sonraki Hotel'e devam etmeden önce her zaman bir tam 300 mL su haznesi sağlanması kalan otel 1.5-1,13 arasındaki adımları yineleyin.

2. medya-tohum karışımı plakaları eleme için ekleme

1. ½ Murashige ve Skoog (MS) medya ile % 0,1 Agar 4.3 g MS Salts, 0.50 g MES, 1.0 g Agar 1 L DI H₂O. eklenmesiyle ayarlamak pH 5,7 için yine de 5 M potasyum hidroksit ilavesi ile pH probe izleme sırasında.
2. Onları % 1 çamaşır suyu ve SDS 15 ve 30 dk arasında sallayarak tohum sterilize ve sonra 4 kez Santrifüjü tarafından eşit bir su hacmi ile durulayın. Tohum steril olduğunda, onları vernilization için 7 gün 24 saat üzerinden 4 ° C yerleştirin. Arabidopsis biyolojik kaynak merkezi sterilizasyon, vernilization ve büyüme²²ek yöntemlerini açıklar.
3. Tohum medyaya bir yoğunluk 0,1 g/100 mL el ile ekleyin. Bu yoğunluğu 3-10 tohum iyi bir 96-şey plaka başına ortalama sonuçlanır.
4. Yer, elle, dört 96-şey düz-Oda sayısı 1 ve 2 otel a (6 rakam, otel A) alt levha. İpucu yükleyici ALP AP96 P250 pipet ipuçları bir kutu yerleştirin, 2.1-2,3 üzerinde P3 adımlarda oluşturduğunuz medya-tohum karışımı ile 300 mL su deposu dolu ve 300 mL su deposu dolu ile % 70 alkol P7 üzerinde (şekil 4, güverte ve şekil 6 Güverte).
   Not: 2,5 ile 2,8 işletim yazılımı ile yapılır.
5. Oda sayısı 1 ve 2 otel a mevcut ve dört tabak yığınları ayırın. Bir tabak her boş statik Alpler (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 ve P12) üzerinde yerleştirin. AP96 P250 pipet ipuçları 96-kanal 200 µL kafasına yük.
6. P3 üzerinde 300 mL medya-tohum rezervuar 90 µL Aspire edin ve ilk 96-şey düz dağıtmak-alt plaka. Tüm sekiz plakaları medya-tohum karışımı içeren kadar bu işlemi yineleyin.
7. AP96 P250 pipet keyif alıyorum ve 70 µL % 70 ile dolu 300 mL rezervuar dağıtımı temizleyin alkol P7 üzerinde. İpuçları çok kanallı ipucu yıkama ALP içinde alıyorum ve su bir %110 hacim dört kez dağıtımı tarafından yıkama ipuçları TL1, kaldırma ve tabakları el ile toplamak.

3. küçük moleküller plakaları eleme için ekleme

1. Yük, elle, bir kutu AP96 P250 pipet ipuçları Oda 1, otel haline A, iki 96-şey V-2, 4, 6 ve 8 oda ve iki 96 de düz-alt eleme kalıplara Odalar 3, 5, 7 ve 9 (şekil 4 alt seyreltme Kütüphane kalıplara Stacker ve Şekil 7, otel A). Ayrıca, hortumlar ve çok kanallı ipucu yıkama ALP 5 galon su deposu üzerinden bağlayın.
   Not: 3.10 üzerinden 3.2 işletim yazılımı ile yapılır.
2. Güverte P7 bir 300 mL % 70 alkol yıkama rezervuar içeren yapılandırma; medya-tohum rezervuar P3, güvertede yaptı (şekil 4, güverte ve Şekil 7, güverte). Buna ek olarak, çok kanallı ipucu yıkama ALP suda dolaşmaya aygıt denetleyicisi bağlantısı üzerinden konsol sürücü açın. Bu protokol sonunda otomatik olarak kapanır.
3. AP96 P250 pipet İpucu kutusunu Hotel A'dan sunmak ve ipucu yükleyici ALP taşıyın.
4. 96-şey V mevcut-alt seyreltme Kütüphane plakaları otel Oda 2 A güverte ve statik ALP P4 ve P8 üstünde bir yer. 96-şey düz sunmak-alt tarama plakalar üzerinden Oda 3 otel a güverte ve bir statik ALP P5 ve P9 üstünde bir yer.
5. AP96 P250 pipet ipuçları ile uç yüklü ALP 96-kanal 200 µL baş üzerine yükleyin.
6. 96-şey V mix-alt seyreltme plaka alıyorum ve üç kez 50 µL dağıtımı P4 üzerinde. Bu, bu plaka 10 µL Aspire edin ve 96-şey düz dağıtmak-alt tarama plaka üzerinde P5.
7. P5 plaka çözümlerinde alıyorum ve üç kez 50 µL dağıtımı ile karıştırın. AP96 P250 pipet ipuçları etanol ile temiz alıyorum ve % 70 70 µL dağıtımı tarafından alkol P7 ve sonra yıkama ipuçları çok kanallı ipucu yıkama alıyorum ve % 110 hacmi dağıtımı ALP, dört kez su rezervuar.
8. İkinci 96-şey V için 3.5 ve 3.6 adımları yineleyin-alt seyreltme Kütüphane plaka (P8) ve 96-şey düz-alt tarama plaka (P9).
9. Yığın iki 96-şey V-alt seyreltme Kütüphane tabak birlikte ve iki 96-şey düz alt tarama tabak birlikte. Tabakları statik ALPs P1, P2, P6, P10, P11, P12 veya P13 taşıyın.
10. 3.4-3,9 üç kez adımları yineleyin, tarama için seyreltilmiş kimyasallar ekleyerek toplam sekiz kez tabaklar. Son olarak, her iyi görsel uyum aracılığıyla tarama plakaların tohumların numarayı denetleyin ve bu wells ile ek steril ve vernalized tohum tarafından üçten tohum ek.

4. kuluçka ve görselleştirme plakaları tarama

1. 96-şey düz-alt eleme plakaları dört gün boyunca 22 ° c çevre bir odasında bir 16/8 açık/koyu döngüsünde bir kuruma geçirmez konteyner kuluçkaya. 96-şey düz-alt eleme plakaları diseksiyon mikroskop altında görselleştirin. Daha fazla araştırma yapılması için tüm anormal fenotipleri kaydedin.

Sonuçlar

Doğru ve verimli bir şekilde fenotipleri konsantrasyonları diseksiyon mikroskop altında eleme, küçük moleküller ilavesi dayalı karakterize bu yöntem Arabidopsis. üzerinde ileri kimyasal genetiğin sonu hedefi yeteneğidir Ne zaman tüm 50.000 bileşikler ekranlı gözlenen fenotipleri farklı ve çeşitli farklı sınıflar (Şekil 2) kırık. Şekil 3A -F diseksiyon mikroskop altında düşü...

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı araştırmacılar Arabidopsis ileri kimyasal genetik ekranda yerine getirmeye yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Biz temsilcisi sonuçları sağlamak 50.000 bileşikleri (Şekil 2 ve şekil 3) ekranında, en büyük ileri kimyasal genetik ekranlar birini^9,13,23bugüne kadar Arabidopsis üzerinde gerçekleştirilen. Sıvı işleme robot kullan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keyboard	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Mouse	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer Screen	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening Library	ChemBridge	N/A	Chemical library
Biomek Software	Beckman Coulter	N/A	Runs and designs the Biomek FX
Device Controller	Beckman Coulter	719366	Operates the water pump/tip washing station
Stacker Carousel Pendent	Beckman Coulter	148240	Manual operation of Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker Carousel	Beckman Coulter	148520	Rotary unit that houses all FX Stacker 10's
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
Biomek FX	Beckman Coulter	https://www.beckman.com/liquid-handlers	Robot that performs the desired operations
Accuframe	Artisan Technology Group	76853-4	Frames arm to place components corretly
Framing Fixture	Beckman Coulter	719415	Centers arm in the Accuframe
Multichannel Tip Wash ALP	Beckman Coulter	719662	Washes the tips after the ethanol bath
Tip Loader ALP	Beckman Coulter	719356	Pneumatically loads tips onto the arm
Air Compressor	Local Provider	N/A	Provides air for pneumatic tip loading
MasterFlex Console Drive	Cole-Parmer	77200-65	Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer
Air Hose	Local Provider	N/A	Provides air from air compressor to Tip Loader
Water Hose	Local Provider	N/A	Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer
Static ALP's	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Supports equipment for the Screen
5 Gallon Reserviour	Local Provider	N/A	Recirculates the dirty water from cleaning the tips
Grippers	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Grabs and moves the equipment to the correct places
96-Channel 200 µL Head	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Holds the 96 tips used within the screen
AP96 P200 Pipette Tips	Beckman Coulter	717251	Used to make the screening library
96 Well Flat Bottom Plate	Costar	9018	Aids in visulization of screen
96 Well V-Bottom Plate	Costar	3897	Aids in storing of dilution library
AlumaSeal 96 Sealing Film	MedSci	F-96-100	Seals for storage both the chemicle library and dilution library
Plastic ziplock sandwich bags	Local Provider	N/A	Used to ensure a humid environment for screen
AP96 P20 Pipette Tips	Beckman Coulter	717254	Used in the dilution library creation
Growth Chamber	Percival	AR36L3	Germinates seeds for phenotypic visulization
Spatula	Local Provider	N/A	Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly
Toothpick	Local Provider	N/A	Pushes seeds from spatula to wells
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Add to MS media mixture
MES Free Acid Monohydrate	Fisher Scientific	ICN19483580	Added to MS media to decrease pH
Agar Powder	Alfa Aesar	9002-18-0	Increases thickness of media to support seed suspension
5M KOH	Sigma-Aldrich	484016	Increases pH to adequate levels
1L Media Storage Bottle	Corning	1395-1L	Holds enough media for a screen
Polypropylene Centrifuge Tubes	Corning	431470	Sterilizes seeds prior to vernilization
pH Probe	Davis Instruments	YX-58825-26	Used for making media
ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual	Beckman Coulter	PN 987836	Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX
Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide	Beckman Coulter	609862-AA	Aids in setting up the Stacker Carousel
Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual	Beckman Coulter	PN 987834	Used to frame the Multichannel Pod
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide	Beckman Coulter	PN B32335AB	Used to aid in setting up the Biomek FX
Biomek Software User's Manual	Beckman Coulter	PN 987835	Used to set up and understand the Software