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摘要

原位颅内注射肿瘤细胞已用于癌症研究, 研究脑肿瘤生物学, 进展, 进化和治疗反应。本文提出了肿瘤移植的荧光分子层析成像技术, 为临床前的胶质瘤模型提供了实时活体成像和肿瘤质量定量。

摘要

致瘤性是癌细胞形成肿瘤肿块的能力。一种广泛使用的方法来确定细胞是否是癌变是通过注射 immunodeficient 小鼠皮下肿瘤细胞和测量肿瘤肿块后, 它变得可见和明显。原位注射癌细胞的目的是在微环境中引入异种异体, 最接近于所研究的肿瘤起源组织。脑癌研究需要颅内注射癌细胞, 以使肿瘤形成和分析在独特的微环境中的大脑。颅内移植的体内成像能瞬间监测原位嫁接小鼠的肿瘤质量。在这里, 我们报告的使用荧光分子层析成像 (裂变材料) 的脑肿瘤移植。癌细胞首先转基因近红外荧光蛋白, 然后注入免疫缺陷小鼠的大脑。然后对这些动物进行扫描, 以便在较长的时间内获得肿瘤肿块的定量信息。细胞预标记允许对每只老鼠的肿瘤负担进行有效、可重复和可靠的定量。我们消除了注射成像基质的需要, 从而减少了对动物的压力。这种方法的局限性表现为无法检测到非常小的质量;但是, 它比其他技术更能解决较大的质量问题。可用于评价胶质瘤细胞系和患者源性样品的药物治疗或基因改变的疗效。

引言

癌症是工业化世界人类疾病相关死亡的主要原因之一。由于死亡人数极高, 迫切需要新的治疗方法。胶质瘤多形性 (肾小球) 是一种极其致命的脑癌类型, 由脑肿瘤、基质和免疫细胞的异质群组成。根据美国中央脑肿瘤登记处的数据, 原发性恶性和非恶性脑肿瘤的发病率约为 10万, 约为22例。大约1.1万新的案件预计将被诊断在美国在 2017年1。

前临床研究调查的可能性, 药物, 程序, 或治疗是有效的之前, 在人类的测试。临床前研究的最早的实验室步骤之一是通过植入宿主生物体中的癌细胞来确定药物治疗的潜在分子靶点, 定义为人移植模型。在此背景下, 利用患者源性异体移植 (PDXs) 的颅内脑肿瘤移植模型已被广泛应用于研究脑肿瘤生物学、进展、进化和治疗反应, 最近对生物标志物的开发、药物筛选和个性化医学2,3,4。

最负担得起和无侵入性的体内成像方法之一监测颅内移植是生物发光成像 (BLI)5,6,7,8。然而, 一些 BLI 限制包括基质的管理和可用性, 酶的稳定性, 和光淬火和散射在成像采集9。在这里, 我们报告红外裂变材料作为一种替代成像方法, 以监测前胶质瘤模型。在这种方法中, intracranially 植入 PDXs 的信号采集和量化, 表达近红外荧光蛋白 iRFP72010,11 (从今以后称为 FP720) 或 turboFP635 (从今以后称为 FP635),是用裂变材料成像系统执行的。使用裂变材料技术, 可以在治疗前、期间或之后以无创性、无基质和定量的方式监测原位肿瘤的体内。

研究方案

使用实验研究动物和传染性药物, 如慢病毒北疆传感器癌细胞, 需要得到机构动物保育计划和机构生物安全委员会的事先批准。本议定书遵循加州大学圣地亚哥 (UCSD) 的动物保育指南。

1. FP635 或 FP720 结构对胶质瘤细胞的标记

  1. 根据 Tiscornia et描述的协议生成和纯化慢病毒北疆。12
  2. 培养大约 2.0 x 106细胞从人胶质瘤细胞线与 DMEM 加上10% 胎牛血清 (血清) 在 15 cm 盘;或文化 2.0 x 106人胶质瘤患者衍生 (肾小球-PDX) 球体与 DMEM/F12 1:1 培养基与 B27 补充和人类重组表皮生长因子 (EGF; 20 ng/毫升) 和在 T75 烧瓶 (10 ng/毫升)。
  3. 保持37°c、5% CO2和100% 相对湿度的所有单元格。
  4. 分离细胞。
    1. 对于胶质瘤细胞: 从盘子中取出上清, 并在胶质瘤细胞中加入3-5 毫升的胰蛋白酶1X。
    2. 对于肾小球球: 通过将细胞吹打成15毫升管来收集细胞。
      1. 在室温下使用台式离心机, 在 200 x g 处旋转球膜球体, 5 分钟。
      2. 取出上清液并添加3-5 毫升的细胞脱离溶液。
    3. 孵化所有细胞在37°c 10-15 分钟。
  5. 通过多次吹打, 仔细地分离细胞 (确保球体和胶质瘤细胞分离完成), 并在 200 x g 处旋转5分钟。
  6. 取出上清液, 用5毫升培养基并用重悬细胞, 吹打数次。用台盼蓝排除法确定细胞的生存能力。
  7. 板 1.0 x 106的目标细胞在 10 cm 盘与5毫升培养基由吹打。
  8. 传感器细胞与慢病毒北疆表达荧光蛋白在多重感染 (语言) 5 如所述的Tiscornia et。12并孵育37摄氏度。
  9. 24小时后, 将培养基从转基因细胞中取出, 加入5毫升新鲜培养基, 再孵育48小时37摄氏度。
  10. 将受感染细胞与步骤 1.4-1.6 所述的单细胞悬浮液分离。在500µL 的分类溶液 (磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 和1% 的血清) 下, 在 200 x g 的细胞上旋转5分钟和并用重悬。
  11. 将细胞悬浮液注入到外地管里。用1µL/毫升 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI) 二盐酸盐对细胞进行染色, 排除死细胞。需要负控制来设置流式细胞仪门 (非转基因和非转基因细胞/DAPI 染色)。
  12. 将荧光阳性/DAPI 阴性细胞归类为排序解决方案, 如巴苏et所述。13, 并将已排序的单元格收集到15毫升圆锥管中。
  13. 以 200 x g 为5分钟, 将已排列的细胞向下旋转, 移除上清, 并在5毫升培养基中并用重悬。用吹打将10厘米的盘子中排列的细胞播种。孵育37摄氏度至少48-72 小时。
  14. 通过游离步骤 1.4-1.6 中的单元格并将其电镀到体内实验中的多个菜肴中, 展开已排序的单元格。
    注: 有关细胞分类准备和纯化的详细信息, 请参阅巴苏et 。13

2. 颅内注射 iRFP 标记的胶质瘤细胞为 Immunodeficient 小鼠

注意: 在开始手术前, 要确保手术室和工具都是干净的。使用 immunodeficient 裸裸 (Foxn1女) 雄性或雌性小鼠, 介于4-5 周大和17-19 克颅内注射。动物应该被安置在至少3天在到达和在手术之前。

  1. 细胞制剂
    1. 将荧光阳性胶质瘤细胞分为单细胞悬浮 (步骤 1.4-1.6) 和并用重悬0.5 或 1.0 x10 6 细胞, 每个动物每次注射µL 的 PBS。将细胞悬浮液注入1.5 毫升的离心管并放置在冰上。
  2. 麻醉准备与管理
    1. 准备200µL 含氯胺酮 (100 毫克/千克) 和甲苯噻嗪 (10 毫克/千克) 每20克小鼠体重的盐水溶液。权衡动物, 计算适当的麻醉剂量。
    2. 提供腹腔注射麻醉, 并将眼膏应用于眼部, 以防止脱水。有关此步骤的详细信息, 请参阅凯瑟琳et 。14将动物放在预热的水热垫上37摄氏度。
    3. 检查动物是否被麻醉通过监测脚趾捏反应 (踏板反射), 通常在5-10 分钟以内。
  3. 颅内注射
    1. 加载一个5µL 汉密尔顿注射器 (钝尖针) 与细胞悬浮和安装在探头持有人。
    2. 将鼠标放在一个小动物立体定向的框架中, 并用耳棒和门牙适配器在描述的细节上塞金et . 来修复头部。15
    3. 用70% 乙醇和 betadine 溶液对头部进行消毒。确保手术部位完全不育。用小手术刀进行中间切口, 分离皮肤和结缔组织。
    4. 使用机器人将哈密尔顿注射器放在 bregma 点上。
    5. 移动探头支架1.0 毫米前后和2.0 毫米侧面从 bregma 点。用铅笔标记这个位置。
    6. 在这个位置, 小心地用微电机手持钻头在头骨上打一个洞, 将轻微的压力向下, 直到血管变得可见。不要扰乱蛛网膜和脑实质。
    7. 将针引入毛刺孔中, 并在脑膜表面下向前3.0 毫米。
    8. 使用电动立体定向喷油器设置体积 (2-5 µL) 和流速 (1 µL/分钟), 或手动执行注射。
    9. 注射后, 用1.0 毫米每1分钟提升针, 并用70% 乙醇清洗注射部位。
    10. 用手术钉或做外科缝合 (通常称为针), 并看到凯瑟琳et 等, 关闭皮肤伤口。14了解更多详细信息。
  4. 动物恢复
    1. 将动物转移到水热垫 (37 °c), 并监测体温, 呼吸率和心率, 直到完全恢复。管理每标准协议的镇痛。
      注: 有关立体定向过程、手术和坐标的详细信息, 请参阅其他报告5,14,15。

3. 裂变材料成像

注: 根据实验目的, 在治疗之前、期间或之后, 可对 iRFP 标记的胶质瘤细胞进行体内监测。为了成像目的, 麻醉动物使用异氟醚感应腔, 在扫描过程中保持成像盒, 以及在裂变材料成像仪的坞站中的图像。

  1. 将动物从笼中移除并放置在异氟醚感应腔内。关闭会议厅, 并打开氧气流量和蒸发器到3-5%。
  2. 监视动物, 直到它完全被麻醉, 通常在1-2 分钟以内. 无意识的动物不应该对外部刺激做出反应。
  3. 把被麻醉的动物从房间里取出, 把动物放在成像盒里, 首先放置头部适配器, 然后将动物朝下。确保头部位于卡带中心。
  4. 将卡带的顶部板放在顶部, 拧紧调整旋钮直到17毫米。
  5. 一旦这种动物在成像盒中是安全的, 就进行成像, 将卡带插入到裂变材料成像仪的内部坞站, 在那里泵浦异氟醚, 以保持动物麻醉。
  6. 通过双击软件图标来运行成像器和分析器软件。
  7. 在 "实验选项卡" 窗口中, 选择 "数据库" 和 "学习组"。
  8. 转到 "扫描选项卡" 窗口, 然后单击 "选择主题", 选择要查看的主题。另外, 在 "激光通道" 面板中选择激光通道。对于 FP635-labeled 细胞, 选择 "激光通道 635 nm", 并为 FP720-labeled 细胞, 选择 "激光通道 680 nm"。
  9. 通过单击 "扫描选项卡" 窗口中的 "捕获" 选项获取图像。然后, 通过单击并将捕获图像中的扫描字段拖动到确定数量的源位置 (通常在同侧侧的20-25 个来源) 中, 调整扫描字段。
  10. 检查 "添加到重建队列" 选项并在 "扫描选项卡" 窗口中命中 "扫描"。
  11. 等待扫描完成, 然后从坞站中取出成像磁带。
  12. 取下卡带的顶部板, 把动物放回笼子里。
  13. 对其余的动物重复步骤 3.1-3.12。

4. 图像分析

  1. 从图像和分析器软件中, 选择 "分析选项卡" 窗口。
  2. 通过单击 "分析选项卡" 窗口中 "数据集选择" 面板中的 "+" 按钮, 加载数据集和要分析的主题。
  3. 在 "分析选项卡" 窗口中加载图像后, 通过选择位于 "分析选项卡" 窗口左上角的椭圆形图标来执行感兴趣区域 (ROI) 分析。
  4. 在 "统计数据" 面板中, 右键单击 "分析选项卡" 窗口中的 "阈值" 列, 将阈值调整为零。
  5. "统计数据" 面板中的总值代表了植入小鼠大脑的荧光标签胶质瘤细胞的信号。
  6. 对其余的动物重复步骤 4.2-4.4。在 "分析选项卡" 窗口的 "数据集选择" 面板中, 分别单击 "+" 或 "−" 按钮, 加载或删除新主题。
    注: 有关裂变材料成像和软件操作的详细信息, 请参阅20.

结果

根据步骤 1.2, 对胶质瘤细胞 U87EGFRvIII (U87 细胞表达表皮生长因子受体变体 III) 进行了培养。慢病毒北疆是根据步骤1.1 生产和纯化的。p24 ELISA 法测定病毒浓度。细胞转基因与慢病毒北疆携带红外荧光蛋白根据步骤1.8。俄罗斯联邦普京 Verkhusha 博士亲切地提供了 FP720 10、11的质粒编码, FP635 向量是从商业供应商那里购买的.目标单元?...

讨论

肿瘤移植已被广泛应用于癌症研究中, 已经建立了一些成熟的成像技术: BLI;磁共振成像 (MRI);正电子发射层析成像 (PET), 计算机断层扫描 (CT);Fmt。每种方法都有利弊, 但最终会与提供的信息类型相辅相成。最常用的体内成像技术之一是 BLI5,6,7,8。BLI 和裂变材料条约都要求细胞工程 (与荧光素酶或红?...

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢弗雷德里克. 朗博士, PDX neurospheres 肿瘤中心。这项工作得到了失败的研究合作的支持, 美国脑肿瘤协会 (弗兰克 Furnari) 的子公司, R01-NS080939 (弗兰克 Furnari), 詹姆斯的麦基金会 (弗兰克 Furnari);贝尼特斯获得美国脑肿瘤协会 (ABTA) 奖的支持;Zanca 被美国-意大利癌症基金会博士后研究奖学金部分支持。弗兰克 Furnari 接受了来自路德维希癌症研究研究所的工资和额外支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/High Glucose HyClone/GESH30022.1
DMEM/F12 1:1 Gibco11320-082
FBSHyClone/GESH30071.03
AccutaseInnovative cell technologiesAT-104
TrypsinHyClone/GESH30236.01
B27 supplementGibco17504044
human recombinant EGF Stemcell Technologies2633
human recombinant FGFStemcell Technologies2634
DPBSCorning21-031-00
FACS tubesFalcon352235
DAPIThermoFisher Scientific62248
BlasticidinThermoFisher ScientificA1113903
p24 ELISA Clontech632200
XylazineAkornNDC 59399-110-20
KetamineZoetisNADA 043-403Controlled substance
OintmentDechronNDC 17033-211-38
Absorbable sutureCpMedicalVQ392
5 ul syringeHamilton26200-UCatalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell SorterSonySH8007
Mouse stereotaxic frame Stoelting51730
Motorized stereotaxic injectorStoelting53311
Micromotor hand-held drillForedomK1070
Mouse warming pad Ken Scientific CorporationTP-22G
Fluorescence Tomography System PerkinElmerFMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software Perkin Elmer 7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XPBeckman Coulter392049
Tissue Culture 100mm DishesOlympus Plastics25-202
Tissue Culture 150mm DishesOlympus Plastics25-203
Tissue Culture Flasks T75Corning430720U
50 mL conical tubesCorning430290
15 mL conical tubesOlympus Plastics28-101
Centrifuge Avanti J-20Beckman CoulterJ320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mLBeckman Coulter326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mmBeckman Coulter326823
Athymic nude miceCharles River LaboratoriesStrain Code  490 (Homozygous)Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.   

参考文献

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