Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in Vivo içinde görüntüleme için

Özet

Orthotopic kafa içi enjeksiyon tümör hücrelerinin Beyin tümör biyolojisi, ilerleme, evrim ve terapötik yanıt çalışmaya kanser araştırmalarında kullanılmıştır. Burada gerçek zamanlı intravital görüntüleme ve miktar tümör preklinik glioblastoma modellerinde kitle sağlayan Floresans moleküler tomografi, tümör xenografts, mevcut.

Özet

Tumorigenicity olan bir tümör oluşturmak için yetenek kanser hücrelerinin kitle. İmmünyetmezligi fareler, subkutan kanseri hücreleri enjekte ve görünür ve elle tutulur olduktan sonra tümör kitle ölçüm hücreleri tumorigenic olup olmadığını belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olacaktır. Orthotopic enjeksiyonu kanser hücrelerinin en çok benzeyen menşe okudu tümör doku microenvironment xenograft tanıtmak amaçlanmaktadır. Beyin kanser araştırma kanser hücrelerinin tümör oluşumu ve analiz içinde beyin microenvironment benzersiz izin vermek için kafa içi enjeksiyon gerektirir. Kafa içi xenografts vivo içinde görüntüleme anında engrafted orthotopically farelerde tümör kitle izler. Burada Beyin tümör xenografts, Floresans moleküler tomografi (FMT) kullanımı raporu Kanser hücreleri ilk kızılötesi floresan proteinler ile transduced ve immün farelerin beyninde enjekte. Hayvanlar o zaman zaman uzun süre tümör kitle hakkında kantitatif bilgi edinmek için taranır. Hücre önceden etiketleme, tekrarlanabilir, uygun maliyetli ve güvenilir miktar her fare içinde tümör yükü için izin verir. Biz görüntüleme yüzeylerde enjekte için ihtiyaç ortadan kaldırılmıştır ve böylece hayvanlar üzerinde stres azalır. Bu yaklaşımın bir sınırlama çok küçük kitlelerin algılamak için yetersizlik tarafından temsil edilir; Ancak, diğer teknikleri daha büyük kitleler için daha iyi çözünürlüğe sahip. Bir uyuşturucu tedavisinin etkinliği veya genetik değişiklikler gliyom hücre satırları ve hasta elde edilen örnekler değerlendirmek için uygulanabilir.

Giriş

Kanser sanayileşmiş dünya insanlarda hastalık ile ilgili ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Son derece yüksek bir ölü sayısı ile yeni tedaviler şiddetle ihtiyaç vardır. Glioblastoma multiforme (GBM) beyin kanseri, beyin tümörü, stromal ve bağışıklık hücrelerinin türdeş olmayan nüfus oluşan son derece öldürücü bir türüdür. Merkezi beyin tümörü ABD göre birincil kötü huylu ve kötü huylu olmayan beyin tümörü insidansı yaklaşık 100.000 başına 22 vaka olması. Yaklaşık 11.000 yeni vaka 2017¹ABD'de tanısı için bekleniyor.

Preklinik çalışmaları, uyuşturucu, yordam veya insanlarda test önce etkili olduğu için tedavi olasılığını araştırmak. Preklinik çalışmalarda erken laboratuvar adımlardan biri ilaç tedavisi için potansiyel moleküler hedef insan xenograft model olarak tanımlanan ana bilgisayar canlı, implante kanser hücrelerini kullanarak tanımlayan iş. Bu bağlamda, kafa içi Beyin tümör xenograft modelleri hasta elde edilen xenografts (PDXs) kullanarak beyin tümör biyolojisi, ilerleme, evrim ve terapötik yanıt çalışma ve son zamanlarda biyolojik gelişimi için ilaç yaygın olarak kullanılmıştır Eleme ve kişiselleştirilmiş tıp^2,3,4.

Görüntüleme yöntemleri intrakranial xenografts izlemek için en uygun fiyatlı ve non-invaziv vivo içinde biridir bioluminescence görüntüleme (BLI)^5,6,7,8. Ancak, bazı BLI sınırlamalar substrat yönetim ve kullanılabilirlik, enzim istikrar ve ışık Şoklama ve edinme⁹görüntüleme sırasında saçılma sayılabilir. Burada preklinik glioblastoma modelleri izlenecek yöntem Imaging alternatif olarak kızılötesi FMT raporu. Bu yöntem, sinyal Alım ve intracranially implant PDXs miktar, (bundan sonra FP720 adlandırılan) bir yakın kızılötesi floresan protein iRFP720^10,11 ifade ya da (bundan böyle FP635 adlandırılan), turboFP635 bir FMT görüntüleme sistemi ile gerçekleştirilir. FMT teknolojisini kullanarak, tümör olabilir orthotopic vivo içinde önce sırasında veya tedaviden sonra preklinik gözlemler için non-invaziv, substrat-Alerjik ve nicel bir şekilde izlenir.

Protokol

Deneysel araştırma hayvanlar ve lentivirus kanser hücrelerinin transduce gibi bulaşıcı hayvan Kurulusları program tarafından ve kurumsal Biyogüvenlik Kurulu tarafından önceden onay gerektirir. Bu iletişim kuralı (UCSD) University of California San Diego hayvan bakımı kuralları izler.

1. FP635 veya FP720 yapı Glioblastoma hücrelerle etiketlerine göre

1. Üretmek ve lentivirus Tiscornia vd tarafından açıklanan protokolüne göre arındırmak ¹²
2. Kültür yaklaşık 2.0 x 10⁶ DMEM artı % 10 fetal sığır serum (FBS) 15 cm tabak içinde insan gliyom hücre satırıyla hücrelerden; ya da kültür 2.0 x 10⁶ insan glioblastoma hasta kaynaklı (GBM-PDX) yuvar DMEM ile/B27 ile F12 1:1 orta takviyesi plus insan rekombinant epidermal büyüme faktörü (EGF; 20 ng/mL) ve FGF (10 ng/mL) bir T75 şişesi içinde.
3. 37 ° C, % 5 CO₂ve %100 bağıl nem tüm hücreleri korumak.
4. Hücreleri ayırmak.
   1. Tümörü hücreler için: süpernatant plakalar kaldır ve tripsin 1 X 3-5 mL gliyom hücrelere ekleme.
   2. GBM için yuvar: 15 mL tüp içine hücreleri pipetting tarafından hücreleri toplamak.
      1. Spin aşağı GBM küreler 200 x g masa üstü bir santrifüj oda sıcaklığında kullanarak 5 min için de.
      2. Süpernatant kaldırın ve 3-5 mL hücre dekolmanı çözeltisi ekleyin.
   3. 10-15 dk 37 ° C'de tüm hücreleri kuluçkaya.
5. Hücreleri yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından özenle ayırmak (küreler ve tümörü hücreleri tamamlandığından emin olun Disosiye) ve 5 min için 200 x g aşağı spin.
6. Süpernatant kaldırın ve yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından orta 5 mL hücrelerle resuspend. Hücre canlılığı trypan mavi dışlama tarafından belirler.
7. Plaka 1.0 x 10⁶ hedef hücre 10 cm tabak ile 5 mL pipetting tarafından orta de.
8. Hücreleri enfeksiyon (MOI) Tiscornia vd tarafından açıklandığı gibi 5 çokluğu, floresan proteinler ifade lentivirus ile transduce ¹² ve 37 ° C'de kuluçkaya
9. 24 saat sonra orta transduced hücrelerden kaldırma, taze orta 5 mL ekleyin ve ek 48 h 37 ° C'de için kuluçkaya
10. Enfekte hücreleri tek hücre süspansiyon adımlarda 1.4-1.6 açıklandığı içine ayırmak. Hücreleri 200 x g 5 min için de aşağı spin ve 500 µL çözüm sıralama resuspend (fosfat tamponlu tuz (PBS) % 1 FBS).
11. Hücre süspansiyon FACS tüpler içine pipette. 1 µL/mL 4', ölü hücreleri dışlamak için 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride hücrelerle birlikte leke. Negatif denetimleri Akış Sitometresi kapıları ayarlamak için gerekli (sigara transduced hücreleri ve sigara transduced hücreleri / DAPI lekeli).
12. Floresan-pozitif/DAPI-negatif hücreleri çözüm, sıralama içine Basu vd tarafından açıklandığı gibi sıralama ¹³ve 15 mL konik tüp içine sıralanmış hücreleri toplamak.
13. Spin aşağı 200 x g 5 min için de sıralanmış hücreleri, süpernatant kaldırmak ve kültür orta 5 mL resuspend. Tohum pipetting tarafından bir 10 cm çanak sıralanmış hücrelerde. En az 48-72 saat için 37 ° C'de kuluçkaya.
14. Hücreleri dissociating tarafından sıralanmış hücreleri genişletin aşağıdaki adımları 1.4-1.6 ve içine birden çok yemekler vivo deneyler için kaplama.
    Not: hücre hazırlık ve arıtma sıralama hakkında daha fazla bilgi için bkz: Basu vd. ¹³

2. immünyetmezligi fareler içine iRFP öğesini Glioblastoma hücre kafa içi enjeksiyon

Not: ameliyat başlamadan önce Araçlar ve cerrahi Oda yordamı için temiz olduğundan emin olun. İmmünyetmezligi korele çıplak (Foxn1^nu) erkek ya da dişi fareler, 4-5 hafta yaşlı ve kafa içi enjeksiyonlar için 17-19 g arasında kullanın. Hayvanlar en az 3 gün boyunca geldikten sonra ve ameliyattan önce yer.

1. Hücre hazırlık
   1. Hasat ve floresan pozitif tümörü hücreleri tek hücre süspansiyon (Adım 1.4-1.6) ayırmak ve 2-5 µL PBS enjeksiyon hayvan başına ücret, 0,5 veya 1.0 x 10⁶ hücrelerde resuspend. 1.5 mL microcentrifuge tüp ve buz üzerinde yer içine hücre süspansiyon pipette.
2. Anestezi hazırlama ve yönetim
   1. 200 µL serum fizyolojik çözüm ketamin (100 mg/kg) ve xylazine fare vücut ağırlığının 20 gram (10 mg/kg) içeren hazır olun. Hayvanlar tartmak ve anestezi uygun doz hesaplayın.
   2. Mayi iğne anestezi sağlamak ve oftalmik merhem su kaybı önlemek için gözler için geçerlidir. Bu adım hakkında daha fazla bilgi için bkz: Kathleen vd. ¹⁴ Place bir Önceden ısıtılmış su termal yastık 37 ° C'de üzerinde hayvan
   3. Hayvanların ayak çimdik yanıt (pedal refleks), izleme tarafından genellikle 5-10 dk içinde anestezi ki kontrol edin.
3. Kafa içi enjeksiyon
   1. 5 µL yük Hamilton şırınga (künt ucu iğne) hücre süspansiyon ve sonda tutucu bağlama ile.
   2. Fareyi bir küçük hayvan stereotaksik çerçevesine yerleştirin ve kulak Bar ve çetin vd tarafından açıklanan detayları takip kesici bağdaştırıcısı kullanarak kafa tamir ¹⁵
   3. Başından % 70 etanol ve betadine solüsyonu ile dezenfekte. Cerrahi sitesi olduğunu tamamlamak steril emin. Küçük bir neşter ile orta bir kesi gerçekleştirmek ve cilt ve bağ dokusu ayrı.
   4. Hamilton şırınga micromanipulator kullanarak bregma noktasına yerleştirin.
   5. Sonda tutucu 1.0 mm hastanın ve 2.0 mm yanal bregma noktasından hareket. Bu konumunu bir kalemle işaretlemek.
   6. Bu konumda dikkatle kan damarları görünür olana kadar aşağı doğru hafif basınç uygulayarak bir micromotor el matkapla kafatası içinde bir delik açın. Araknoid mater ve beyin parankimi bozmak değil.
   7. İğne burr deliğe tanıtmak ve pial yüzeyinin altında 3,0 mm ilerlemek.
   8. Birim (2-5 µL) ve akış hızı (1 µL/dak) motorlu stereotaksik enjektör kullanarak enjeksiyon ayarlamak veya el ile enjeksiyon gerçekleştirir.
   9. Enjeksiyon sonra iğne yavaş yavaş 1.0 mm her 1dk artan tarafından çıkarın ve % 70 etanol ile enjeksiyon yeri temizleyin.
   10. Yakın cilt cerrahi zımba ile veya cerrahi dikiş (genellikle dikiş anılacaktır) yaparak yara ve Kathleen ve ark. görmek ¹⁴ daha fazla ayrıntı için.
4. Hayvan Kurtarma
   1. Hayvan su termal pad (37 ° C) için aktarım ve vücut ısısı, solunum hızı ve kalp hızı, tam kurtarma kadar izlemek. Analjezi başına standart iletişim kuralları yönetmek.
      Not: diğer raporları^5,14,15cerrahi ve koordinatları, stereotaktik yordam hakkında daha fazla bilgi için bkz:.

3. FMT görüntüleme

Not: deneysel amacı göre iRFP öğesini glioblastoma hücreler olabilir önce sırasında veya tedaviden sonra vivo içinde izlenen. İçin amaç düşsel, hayvanlar isoflurane indüksiyon odası kullanarak anestezi, tarama ve görüntü FMT Imager yerleştirme istasyonundaki sırasında görüntüleme bir kasete koru.

1. Kafes ve isoflurane indüksiyon odası yerde hayvan kaldırın. Odası kapatın ve oksijen akışı ve % 3-5 için Buharlaştırıcı açın.
2. Hayvan izlemek kadar tamamen anestezi, genellikle 1-2 dk. baygın içinde hayvanlar dış uyaranlara yanıt.
3. İmzalat hayvan odasından kaldırın ve hayvan görüntüleme kasete ilk olarak, baş adaptör yerleştirerek koymak aşağı bakacak şekilde hayvan yerleştirerek takip ettim. Baş kaset ortasına bulunduğundan emin olun.
4. Kaset üst plaka üstüne yerleştirin ve ayar düğmeleri 17 mm kadar sıkın.
5. Bir kez bu hayvan görüntüleme kasete güvenlidir, görüntüleme için kaset nerede isoflurane pompalanır anestezi hayvan tutmak için iç Dok FMT Imager ekleyerek devam edin.
6. Imager ve analyzer yazılımı yazılım simgesini çift tıklatarak çalıştırın.
7. "Deneysel sekmesi" penceresinde, "Veritabanı" ve "çalışma grubu" seçin.
8. "Tarama sekmesini" pencereye git ve görüntü konuya "konu seçin" tıklatarak seçin. Ayrıca, "Lazer kanal" panelinde lazer kanalını seçin. FP635 etiketli hücreleri için "lazer kanal 635 nm" seçin ve "Kanal 680 nm lazer" FP720 etiketli hücreleri için seçin.
9. Bir görüntü elde etmek "Tarama sekme" penceresinde "Yakalama" seçeneğini tıklatarak. Sonra tarama alanını tıklatıp kaynak konumları, genellikle içinde 20-25 kaynakları Ipsilateral tarafı için kararlı bir dizi için yakaladığınız görüntüyü tarama alanına sürükleyerek ayarlayın.
10. "Yeniden yapılanma Kuyruğa Ekle" seçeneğini işaretleyin ve "Tarama" "Tarama sekmesini" penceresinde vurmak.
11. Tarama tamamlanana kadar bekleyin ve ardından görüntüleme kaset takma biriminden çıkarma.
12. Kaset üst plaka çıkarın ve hayvan arka kafesin içine yerleştirin.
13. Tekrarlamak belgili tanımlık merdiven 3.1-3.12 hayvanları geri kalanı için.

4. görüntü analizi

1. Imager ve analyzer yazılımı, "Analiz sekmesi" pencereyi seçin.
2. Veri kümesi ve konu "Analiz sekmesi" penceresinin "Veri kümesi seçimi" panelinde "+" düğmesini tıklatarak analiz etmek için yükleyin.
3. "Analiz sekmesi" penceresinde görüntü yüklendikten sonra "Analiz sekmesi" penceresinin sol üst köşesinde bulunan elips simgesini seçerek bölgesi faiz (ROI) analizi gerçekleştirin.
4. Eşik "istatistik veri" panelinde yanında doğru tıkırtı "Analiz sekmesi" penceresinde "eşik" sütun sıfır olarak ayarlayın.
5. Toplam değer "İstatistik veri" Masası'ndaki fare beyninde implante floresan öğesini glioblastoma hücrelerden sinyali temsil eder.
6. 4.2-4.4 hayvanları geri kalanı için yineleyin. Yüklemek veya yeni bir konu kaldırmak "+" veya "−" düğmesini, sırasıyla, "Analiz sekmesi" pencere "Veri kümesi seçimi" panelinde.
   Not: FMT görüntüleme ve yazılım işlemi hakkında daha fazla bilgi için bkz:^20.

Sonuçlar

Glioblastoma U87EGFRvIII hücreleri (EGF reseptör değişken III aşırı ifade U87 hücreleri) adım 1.2 göre kültürlü. Lentivirus üretilen ve adım 1.1 göre saf. Viral konsantrasyon p24 tarafından belirlendi ELISA analiz. Hücreleri adım 1.8 göre kızılötesi floresan protein taşıyan lentivirus ile transduced. FP720^10,11 kodlama plazmid lütfen Dr V.V. Verkhusha tarafından sağlanan ve FP635 vektör ticari bir sat?...

Tartışmalar

Tümör xenografts kapsamlı kanser araştırmalarında hem de bir dizi köklü görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir: BLI; Manyetik rezonans görüntüleme (MRG); Pozitron emisyon tomografisi (PET), bilgisayarlı tomografi (CT); FMT. Her bu yaklaşımların artıları ve eksileri ile gelir, ama sonuçta birbirini tamamlayıcı bilgiler türü ile. Görüntü teknolojisi en sık kullanılan vivo içinde biridir BLI^5,6,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/High Glucose	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	Gibco	11320-082
FBS	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
Trypsin	HyClone/GE	SH30236.01
B27 supplement	Gibco	17504044
human recombinant EGF	Stemcell Technologies	2633
human recombinant FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS	Corning	21-031-00
FACS tubes	Falcon	352235
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248
Blasticidin	ThermoFisher Scientific	A1113903
p24 ELISA	Clontech	632200
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Ketamine	Zoetis	NADA 043-403	Controlled substance
Ointment	Dechron	NDC 17033-211-38
Absorbable suture	CpMedical	VQ392
5 ul syringe	Hamilton	26200-U	Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter	Sony	SH8007
Mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730
Motorized stereotaxic injector	Stoelting	53311
Micromotor hand-held drill	Foredom	K1070
Mouse warming pad	Ken Scientific Corporation	TP-22G
Fluorescence Tomography System	PerkinElmer	FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software	Perkin Elmer	7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP	Beckman Coulter	392049
Tissue Culture 100mm Dishes	Olympus Plastics	25-202
Tissue Culture 150mm Dishes	Olympus Plastics	25-203
Tissue Culture Flasks T75	Corning	430720U
50 mL conical tubes	Corning	430290
15 mL conical tubes	Olympus Plastics	28-101
Centrifuge Avanti J-20	Beckman Coulter	J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL	Beckman Coulter	326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Athymic nude mice	Charles River Laboratories	Strain Code  490 (Homozygous)	Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.