Fluorescence moléculaire tomographie pour l’imagerie In Vivo des xénogreffes de glioblastome

Résumé

Orthotopique injection intracrânienne des cellules tumorales a été utilisée dans la recherche sur le cancer pour étudier la biologie de tumeur de cerveau, progression, évolution et réponse thérapeutique. Nous présentons ici la tomographie moléculaire de xénogreffes tumorales, à fluorescence qui fournit une imagerie intravitale en temps réel et la quantification d’une tumeur de masse dans des modèles précliniques de glioblastome.

Résumé

Tumorigénicité est la capacité des cellules cancéreuses pour former une tumeur masse. Une approche largement utilisée pour déterminer si les cellules sont tumorigènes est en injectant des souris immunodéficientes par voie sous-cutanée avec les cellules cancéreuses et de mesurer la masse de la tumeur, après qu’il devienne visible et palpable. Orthotopique injections de cellules cancéreuses visent à introduire la xénogreffe dans le microenvironnement qui ressemble le plus le tissu d’origine de la tumeur à l’étude. Recherche sur le cancer du cerveau nécessite une injection intracrânienne des cellules cancéreuses pour permettre la formation de tumeurs et d’analyse dans le microenvironnement unique du cerveau. L’imagerie in vivo des xénogreffes intracrâniennes surveille instantanément la masse de la tumeur de souris orthotopically greffée. Nous rapportons ici l’utilisation de la tomographie moléculaire de fluorescence (FMT) des xénogreffes de tumeurs de cerveau. Les cellules cancéreuses sont tout d’abord transduites avec près de protéines fluorescentes infrarouges et ensuite injectées dans le cerveau des souris immunodéficientes. Les animaux sont ensuite analysés pour obtenir des informations quantitatives sur la masse de la tumeur sur une longue période de temps. Cellule avant étiquetage permet de quantification rentable, fiable et reproductible de la charge tumorale au sein de chacune des souris. Nous avons éliminé la nécessité d’injecter des substrats d’imagerie et ainsi réduit le stress sur les animaux. Une limitation de cette approche est représentée par l’incapacité à détecter de très petites masses ; Toutefois, il a une meilleure résolution pour les plus grandes masses que les autres techniques. Il peut être appliqué afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement médicamenteux ou des altérations génétiques des lignées de cellules de gliome et échantillons dérivés de patient.

Introduction

Le cancer est une des principales causes de décès par maladie chez l’homme dans le monde industrialisé. Avec un nombre extrêmement élevé de morts, les nouveaux traitements sont requis de toute urgence. Glioblastome multiforme (GBM) est un type extrêmement mortelle de cancer du cerveau, composé de populations hétérogènes tumeur stromale et immunitaire des cellules du cerveau. Selon le registre de tumeur de cerveau Central des Etats-Unis, l’incidence des tumeurs cérébrales malignes et bénignes primaires est environ 22 cas pour 100 000 habitants. Environ 11 000 nouveaux cas devraient être diagnostiqués aux Etats-Unis en 2017¹.

Les études précliniques enquêter sur la probabilité d’une drogue, procédure ou traitement efficace avant les essais chez l’homme. Parmi les premières étapes de laboratoire dans les études précliniques consiste à identifier des cibles moléculaires potentielles pour le traitement de la toxicomanie à l’aide de cellules cancéreuses implantées dans un organisme hôte, définis comme des modèles de xénogreffes humaines. Dans ce contexte, les modèles de xénogreffes de tumeurs intracrâniennes cerveau utilisant des xénogreffes dérivés de patient (PDXs) ont été largement utilisées pour étudier la biologie de tumeur de cerveau, progression, évolution et réponse thérapeutique et plus récemment pour le développement de biomarqueurs, de drogues dépistage et personnalisé médecine^2,3,4.

Un des plus abordables et non invasif en vivo méthodes pour surveiller les xénogreffes intracrâniennes d’imagerie est bioluminescence d’imagerie (BLI)^5,6,7,8. Toutefois, certaines limitations de BLI incluent administration de substrat et disponibilité, stabilité de l’enzyme et léger trempe et diffusion au cours de la formation image acquisition⁹. Nous rapportons ici le FMT infrarouge comme une alternative à l’imagerie méthode pour surveiller les modèles précliniques de glioblastome. Dans cette méthode, acquisition de signaux et quantification de données implantés PDXs, exprimant une protéine fluorescente proche infrarouge iRFP720^10,11 (désormais appelé FP720) ou turboFP635 (désormais appelée FP635), est réalisée avec un FMT système d’imagerie. Utilisant la technologie FMT, l’orthotopic tumeurs peuvent être surveillés en vivo avant, pendant ou après le traitement, d’une manière non invasive, sans substrat et quantitative pour observations précliniques.

Protocole

L’utilisation des animaux de recherches expérimentales et des agents infectieux, tels que les lentivirus à transmettre les cellules cancéreuses, requièrent l’approbation préalable par le programme institutionnel de soins aux animaux et par le Comité institutionnel de biosécurité. Ce protocole suit les directives de protection des animaux de l’Université de Californie à San Diego (UCSD).

1. marquage des cellules de glioblastome avec FP635 ou FP720 Construct

1. Produire et purifier les lentivirus selon le protocole décrit par Tiscornia et al. ¹²
2. La culture environ 2,0 x 10⁶ cellules d’une lignée de cellules de gliome humain avec DMEM plus 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) dans un plat de 15 cm ; culture 2.0 x 10⁶ glioblastome humain dérivé de patient (GBM-PDX) domaine avec DMEM ou F12 le milieu 1:1 avec B27 supplément plus humain facteur de croissance épidermique recombinant (EGF ; 20 ng/mL) et FGF (10 ng/mL) dans une fiole de T75.
3. Maintenir toutes les cellules à 37 ° C, 5 % de CO₂et 100 % d’humidité relative.
4. Dissocier les cellules.
   1. Pour les cellules de gliome : Retirez le surnageant des plaques et l’ajout de 3 à 5 mL de trypsine 1 X pour les cellules de gliome.
   2. Pour le GBM sphères : recueillir les cellules en pipettant également, les cellules dans un tube de 15 mL.
      1. Tournez en bas les sphères GBM à 200 x g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de table à la température ambiante.
      2. Retirez le surnageant et ajouter 3 à 5 mL de solution de détachement cellulaire.
   3. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 10-15 min.
5. Soigneusement se dissocient les cellules en pipettant également monter et descendre plusieurs fois (faire en sorte que soient remplis les sphères et les cellules de gliome dissocié) et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
6. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu en pipettant également monter et descendre plusieurs fois. Déterminer la viabilité cellulaire exclusion bleu trypan.
7. Plaque de 1,0 x 10⁶ des cellules cibles dans un plat de 10 cm avec 5 mL de milieu de pipetage.
8. Transduce cellules avec lentivirus exprimant des protéines fluorescentes à la multiplicité d’infection (MOI) 5 tel qu’il est décrit par Tiscornia et al. ¹² et incuber à 37 ° C.
9. Après 24h, retirer le support des cellules transduits, ajouter 5 mL de milieu frais et incuber pendant supplémentaire 48 h à 37 ° C.
10. Se dissocient les cellules infectées en une suspension de cellules individuelles tel que décrit dans les étapes 1.4-1.6. Tournez en bas les cellules à 200 x g pendant 5 min et remettre en suspension dans 500 µL de solution de tri (solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % FBS).
11. Distribuer la suspension cellulaire dans des tubes de FACS. Co, détachant les cellules 1 µL/ml de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dihydrochlorure d’exclure les cellules mortes. Contrôles négatifs sont tenus de mettre en place les portes cytomètre de flux (cellules transduites non et non-transduites / DAPI colorées).
12. Trier les cellules fluorescentes-positif/négatif DAPI dans tri solution, tel que décrit par Ben Ali et al. ¹³et de recueillir les cellules triées dans un tube conique de 15 mL.
13. Tournez en bas les cellules triées à 200 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et remettre en suspension dans 5 mL de milieu de culture. Ensemencez les cellules triées dans un plat de 10 cm de pipetage. Incuber à 37 ° C pendant au moins 48 à 72 heures.
14. Développez les cellules triées en dissociant les cellules suivant étapes 1.4-1.6 et plaquant dans plusieurs plats pour des expériences in vivo .
    Remarque : Pour plus de détails sur la cellule Tri préparation et purification, voir Ben et al. ¹³

2. intracrânienne Injection de cellules de glioblastome iRFP-tag dans des souris immunodéficientes

Remarque : Avant de commencer l’intervention, assurez-vous que la salle de chirurgie et outils sont propres pour la procédure. Utilisez immunodéficientes nue (Foxn1^nu) mâles ou femelles souris athymiques, entre 4-5 semaines et g 17-19 pour les injections intracrâniennes. Animaux devrait être logés pendant au moins 3 jours après leur arrivée et avant la chirurgie.

1. Préparation de cellules
   1. Récolter et dissocier les cellules fluorescentes de positif-gliome dans une suspension de cellules individuelles (1.4-1.6 étapes) et remettre en suspension 0,5 ou 1,0 x 10⁶ cellules de 2 à 5 µL de PBS par injection par animal. Pipetter, la suspension de cellules dans un tube microtubes de 1,5 mL et le déposer sur la glace.
2. Gestion et préparation de l’anesthésie
   1. Préparez 200 µL d’une solution saline contenant la kétamine (100 mg/kg) et xylazine (10 mg/kg) par 20 grammes de poids corporel de souris. Peser les animaux et on calcule la dose appropriée de l’anesthésie.
   2. Fournir une injection intrapéritonéale de l’anesthésie et pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter la déshydratation. Pour plus d’informations sur cette étape, voir Kathleen et al. ¹⁴ Place l’animal sur un pad thermique de l’eau préchauffée à 37 ° C.
   3. Vérifier que les animaux sont anesthésiés par la surveillance de la réponse de pincée d’orteil (réflexe de pédale), généralement dans les 5-10 min.
3. Injection intracrânienne
   1. Charger un µL 5 seringues Hamilton (aiguille pointe émoussée) avec suspension de cellules et de monter dans le support de sonde.
   2. Placez la souris dans un petit cadre stéréotaxique animaux et fixer la tête en utilisant les barres de l’oreille et l’adaptateur incisive après les détails décrits par Cetin et al. ¹⁵
   3. Désinfecter la tête avec 70 % d’éthanol et Bétadine solution. Assurez-vous que le champ opératoire est terminer stérile. Effectuer une incision médiane avec un petit scalpel et séparer la peau et les tissus conjonctifs.
   4. Placer la seringue de Hamilton sur le point de bregma utilisant le micromanipulateur.
   5. Eloignez la sonde titulaire 1,0 mm antéro-postérieure et 2.0 mm latérale du point de bregma. Marquer cette position avec un crayon.
   6. À cet endroit, soigneusement faire un trou dans le crâne avec une perceuse à main micromoteur en appliquant une légère pression vers le bas jusqu'à ce que les vaisseaux sanguins deviennent visibles. Ne pas interrompre le parenchyme arachnoïdien de mater et le cerveau.
   7. Introduire l’aiguille dans le trou de trépan et advance 3,0 mm au-dessous de la surface de la pie-mère.
   8. Mettre en place le volume (2 à 5 µL) et débit (1 µL/min) d’injection à l’aide d’un injecteur stéréotaxique motorisé ou effectuer manuellement l’injection.
   9. Après l’injection, retirer l’aiguille progressivement par ordre croissant de 1,0 mm toutes les 1 min et nettoyer le site d’injection avec l’éthanol à 70 %.
   10. Fermer la peau plaie avec agrafes chirurgicales ou en faisant des sutures chirurgicales (souvent dénommés "points") et voir Kathleen et al. ¹⁴ pour plus de détails.
4. Récupération de l’animale
   1. Transférer l’animal à un pad thermique de l’eau (37 ° C) et de surveiller la température corporelle, rythme respiratoire et cardiaque, jusqu'à la guérison complète. Administrer une analgésie par des protocoles standard.
      Remarque : Pour plus d’informations sur la procédure stéréotaxique, chirurgie et coordonnées, voir autres rapports^5,14,15.

3. FMT imagerie

Remarque : Selon le but expérimental, le glioblastome iRFP-tag, les cellules peuvent être surveillés en vivo avant, pendant ou après le traitement. Pour le but de l’imagerie, anesthésier les animaux à l’aide d’une chambre à induction isoflurane, maintenir dans une cassette d’imagerie pendant le balayage et l’image dans le socle de l’imageur FMT.

1. Retirer l’animal de la cage et le place dans la chambre de l’induction de l’isoflurane. Fermer la chambre et sur alimentation en oxygène et vaporisateur à 3-5 %.
2. Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il est complètement anesthésié, généralement à 1-2 min. inconscient animaux ne doit pas répondre à des stimuli externes.
3. Retirer l’animal anesthésié de la chambre et mettre l’animal dans la cassette d’imagerie en plaçant l’adaptateur de tête tout d’abord, puis en plaçant l’animal face vers le bas. Assurez-vous que la tête se trouve dans le centre de la cassette.
4. Placer la platine supérieure de la cassette sur le dessus et serrer les boutons de réglage jusqu'à 17 mm.
5. Une fois que l’animal est sûr dans la cassette d’imagerie, passez à l’imagerie en y insérant la cassette de la station d’accueil interne de l’imageur FMT, où l’isoflurane est pompée pour garder l’animal anesthésié.
6. Lancez le logiciel imageur et analyseur en double-cliquant sur l’icône du logiciel.
7. Dans la fenêtre de l’onglet « expérimental », sélectionner le « Database » et le « Groupe d’étude ».
8. Ouvrez la fenêtre de l’onglet « Scan » et sélectionnez l’objet à l’image en cliquant sur « Sélectionner le sujet ». Aussi, sélectionnez le canal de laser dans le panneau « Canal de Laser ». Pour les cellules marquées FP635, sélectionnez « laser canal 635 nm » et pour marqué FP720 cellules, sélectionnez « laser canal 680 nm ».
9. Acquérir une image en cliquant sur l’option « Capture » dans la fenêtre de l’onglet « Scan ». Ensuite, réglez le champ de balayage en faisant glisser le champ de balayage de l’image capturée à un nombre déterminé d’emplacements source, habituellement dans les sources de 20-25 pour le côté ipsilatéral.
10. Cochez l’option « Ajouter à la file d’attente de la reconstruction » et cliquez sur « Scan » dans la fenêtre de l’onglet « Scan ».
11. Attendez que le balayage est terminé et puis retirez la cassette d’imagerie de la station d’accueil.
12. Enlever la plaque supérieure de la cassette et remettre l’animal dans la cage.
13. Répétez les étapes 3.1-3.12 pour le reste des animaux.

4. image Analysis

1. Dans le logiciel imageur et analyseur, sélectionnez la fenêtre de l’onglet « analyse ».
2. Charger le dataset et l’objet à analyser en cliquant sur le bouton « + » dans le Dataset « jury » de la fenêtre de l’onglet « analyse ».
3. Une fois que l’image a été chargé dans la fenêtre de l’onglet « analyse », effectuez la région de l’analyse de l’intérêt (ROI) en sélectionnant l’icône ellipsoïde, située dans le coin supérieur gauche de la fenêtre de l’onglet « analyse ».
4. Ajustez le seuil à zéro dans le panneau « données statistiques » par clic droit sur la colonne « seuil » dans la fenêtre de l’onglet « analyse ».
5. La valeur totale du panneau « Données statistiques » représente le signal provenant des cellules de glioblastome fluorescent-étiquetées implantés dans le cerveau de souris.
6. Répétez les étapes 4.2-4.4 pour le reste des animaux. Charger ou supprimer un nouveau sujet en cliquant sur le « + » ou « − » bouton, respectivement, dans le Dataset « jury » de la fenêtre de l’onglet « analyse ».
   Remarque : Pour plus d’informations sur l’imagerie FMT et le fonctionnement de logiciels, voir^20.

Résultats

U87EGFRvIII de cellules de glioblastome (U87 cellules surexprimant la variante de récepteur de l’EGF III) ont été cultivés selon l’étape 1.2. Lentivirus a été produit et purifiée selon étape 1.1. La concentration virale était déterminée par p24 analyse ELISA. Les cellules étaient transduites avec lentivirus portant des protéines fluorescentes infrarouges selon étape 1.8. Le plasmide codant FP720^10,11 a été aim...

Discussion

Xénogreffes tumorales ont été largement utilisés dans la recherche sur le cancer et un certain nombre de techniques d’imagerie bien établis a été développé : BLI ; résonance magnétique imagerie (IRM) ; tomographie d’émission de positons (TEP), calculée (CT) ; FMT. Chacune de ces approches est livré avec les avantages et les inconvénients, mais finalement se complètent mutuellement avec le type de renseignements fournis. Un des plus couramment utilisés en vivo technologie d’imagerie est...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/High Glucose	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	Gibco	11320-082
FBS	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
Trypsin	HyClone/GE	SH30236.01
B27 supplement	Gibco	17504044
human recombinant EGF	Stemcell Technologies	2633
human recombinant FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS	Corning	21-031-00
FACS tubes	Falcon	352235
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248
Blasticidin	ThermoFisher Scientific	A1113903
p24 ELISA	Clontech	632200
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Ketamine	Zoetis	NADA 043-403	Controlled substance
Ointment	Dechron	NDC 17033-211-38
Absorbable suture	CpMedical	VQ392
5 ul syringe	Hamilton	26200-U	Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter	Sony	SH8007
Mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730
Motorized stereotaxic injector	Stoelting	53311
Micromotor hand-held drill	Foredom	K1070
Mouse warming pad	Ken Scientific Corporation	TP-22G
Fluorescence Tomography System	PerkinElmer	FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software	Perkin Elmer	7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP	Beckman Coulter	392049
Tissue Culture 100mm Dishes	Olympus Plastics	25-202
Tissue Culture 150mm Dishes	Olympus Plastics	25-203
Tissue Culture Flasks T75	Corning	430720U
50 mL conical tubes	Corning	430290
15 mL conical tubes	Olympus Plastics	28-101
Centrifuge Avanti J-20	Beckman Coulter	J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL	Beckman Coulter	326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Athymic nude mice	Charles River Laboratories	Strain Code  490 (Homozygous)	Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.