前体钙成像用于可视化大脑对果蝇内分泌信号的反应

摘要

本文介绍了 果蝇脑的体外钙成像协议。在这种方法中, 自然或合成化合物可以应用到缓冲, 以测试他们的能力, 激活特定神经元的大脑。

摘要

通过内分泌信号, 例如从外围到大脑, 器官对器官的传播对于维持稳态是必不可少的。作为内分泌研究的动物模型, 具有成熟基因工具和基因组信息的果蝇正在越来越多地被使用。本文介绍了一种用于果蝇脑外植体的钙成像方法。这种方法能够检测到大脑中荷尔蒙的直接信号。众所周知, 许多肽荷尔蒙通过 G 蛋白偶联受体 (受体) 作用, 其活化导致胞内 Ca^{2 +}浓度增加。神经激活还提升了胞内 ca^{2 +}级别, 从 ca^{2 +}的流入和释放 ca^{2 +}存储在内质网 (ER)。钙传感器 GCaMP 可以监视这些 Ca^{2 +}的更改。在该方法中, GCaMP 表达在感兴趣的神经元中, GCaMP 表达的幼虫脑被解剖和培养为前体.然后将试验肽应用于脑外植体, 用装有 CCD 摄像机的旋转圆盘共焦显微镜检测 GCaMP 的荧光变化。使用这种方法, 任何水溶性分子都可以进行测试, 与神经活化相关的各种细胞事件可以使用适当的荧光指示器进行成像。此外, 通过修改成像室, 该方法可用于图像其他果蝇器官或其他动物的器官。

引言

器官对器官的沟通是一种进化保守的策略, 用于维持动态平衡以应对环境变化。在人类中, 各种激素 arereleased 从内分泌腺体进入循环。许多这些荷尔蒙的目标是大脑的下丘脑, 它调节新陈代谢过程和基本行为, 如喂养^1,2。许多荷尔蒙是用哺乳动物模型发现的。然而, 它们的行动机制, 特别是他们参与的 interorgan 网络, 在很大程度上仍然不清楚。

果蝇已成为研究器官与器官沟通的有用模型。在昆虫中, 许多生理过程是由荷尔蒙控制的。早期研究侧重于生长和变形使用大昆虫。在这些研究中, 特定器官的移除或移植预测了器官间信号分子的存在;后来, 青少年激素 (JH), Prothoracicotropic 激素 (PTTH) 和昆虫蜕皮激素生化^纯化3, 4, 5.在昆虫生命周期的^6、7中, 大量的细胞间信号肽被认为涉及各种生理事件。大多数这些肽作用于 G 蛋白偶联受体 (受体), 虽然特定的受体最初难以识别使用常规方法。果蝇全基因组序列⁸的发布是一个突破, 它使果蝇生物活性肽的鉴定与其他昆虫的同源性有关。此外, 用细胞培养为基础的 GPCR 配体结合试验, 从基因组预测的受体中发现了几种多肽受体。其次, 表达分析预测这些肽和受体诱发的器官对器官通路。值得注意的是, 许多假定的肽受体在大脑中表达, 这表明大脑是肽类激素的主要目标⁹。此外, 在果蝇中, 先进的基因工具有助于鉴定肽 GPCR 组合的生理作用。例如, 基于 GAL4 和莱克萨的二进制转录系统可以在空间和世俗控制的方式下使基因击倒或过度表达。GAL4 是酵母中识别的转录因子, 它与一种称为上游活化序列的特定顺规序列结合在一起。在 GAL4/UAS 系统中, 驱动程序行提供了组织特定的或特定于阶段的 GAL4 表达式, 而应答器线携带感兴趣的基因或构造来驱动 shRNA 表达式的无人机上游。莱克萨/LexAop 系统基于类似的机制。表型分析的组织特异性肽击倒和组织特异性 GPCR 的动物可以揭示的信息, 肽 GPCR 信号的模式和行动地点。然而, 仅仅通过遗传数据就可以得出的结论是有限的。另一方面, 一旦特定肽类激素的假定目标被缩小到组织或细胞类型, 在器官外植体中的活体钙成像可以用来阐明由肽 GPCR 信号介导的器官对器官的传播。在 Gq 耦合的 GPCR 激活后, 由于从 ER¹⁰释放 ca^{2 +} , 胞内 ca^{2 +}浓度增加。在大脑中, 神经激活还提升了胞内 Ca^{2 +}级。此类 Ca^{2 +}的增加可以通过钙传感器检测, GCaMP 在 Ca^{2 +}的存在下发生构象变化, 导致荧光发射¹¹。

本文介绍了一种使用果蝇脑外植体的钙成像方法。为了测试多肽激活特定神经元的能力, 将测试肽应用于 GCaMP 表达的脑外植体, 并通过共聚焦显微镜对荧光变化进行监测。GPCR 的参与, 然后确认通过执行相同的化验, 使用突变的大脑缺乏 GPCR。这种成像和遗传学的结合提供了关于多肽受体的器官与器官通讯的精确信息. 还讨论了此协议的可能修改和应用。

研究方案

1. 幼虫脑外植体的制备

1. 制作一个成像室。
   注意: 稳定的记录要求将脑外植体拴在一起。这里, 在 Ca^{2 +}成像系统中使用了一个低成本、手工制作的成像室。
   1. 使用镊子, 划伤塑料培养皿 (35 毫米 x 10 毫米) 的底部中心, 为幼虫大脑的腹神经节创造一个凹痕, 使安装更加容易 (步骤 1.3,图 1)。
   2. 用牙签, 放置一小滴超强力胶水在凹痕的两边, 并附上一个钨棒 (0.125 毫米直径, 6 至7毫米长度) 的胶水。
   3. 使用一小块腻子样的可重用胶粘剂, 使凹痕 (图 1) 周围的圆形壁 (直径10毫米和3毫米高)。
      注: 墙内的空间后将填充磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS; 0.14 米氯化钠, 0.0027 米氯化钾, 0.01 米 PO₄^3-, pH 7.4 @ 0.05 在25°c)。
2. 动物制剂
   注: 对于钙成像, 钙指示器, GCaMP6s, 是表达的细胞类型的兴趣, 这是通常实现使用组织特定的 GAL4 和UAS-GCaMP6s的组合。为了确保信号通过候选受体介导, GCaMP6s 也表达在受体缺陷的突变体中。
   1. 当对不同基因型如野生型和突变体进行实验比较时, 年龄匹配试验幼虫避免 GCaMP6 表达水平的变化和生理上的差异, 由于发育阶段。
   2. 保持父母苍蝇 (每性别30苍蝇) 在一个文化小瓶, 其中含有标准的飞行食品8小时, 允许产卵的食物表面。在12小时的光暗循环下, 在25摄氏度和 60-70% 相对湿度下, 培养幼虫的质量。
3. 幼虫脑解剖
   1. 在产卵后90-120 小时 (AEL), 收集幼虫, 用蒸馏水冲洗至少3次, 以除去附着的食物碎片。
   2. 将一个幼虫放在一个1.5 寸的方形手表玻璃上, 里面装满了冰冷 PBS。
      注: 下两步是在这个手表玻璃下进行解剖显微镜。
   3. 用镊子轻轻抓住幼虫中间部分。使用另一钳抓住嘴钩和拉嘴钩轻轻地把包含大脑的幼虫的前部与身体的其余部分分开。
      注: 另外, 可以使用手术剪刀。
   4. 用镊子抓住前尖, 把幼虫翻出来。除去附着在大脑上的多余的组织, 如形象盘、脂肪体和环腺。轻轻地将大脑与口器分开。
   5. 将200µL 的 PBS 应用于在成像室中由腻子状可重用胶粘剂制成的环内。用 PBS 轻轻吮吸被解剖的大脑, 然后把它转移到成像室。
4. 将大脑设置成成像室
   1. 使用钳抓取肌肉纤维从腹神经节延伸。将大脑轻轻插入钨线下面的凹痕。
   2. 使用另一个钳, 将钨线稍稍向上拉, 将大脑置于正确的成像位置 (图 1)。

2. 获取 Ca^{2 +}荧光图像

注: 在 PBS 中浸泡的脑外植体采用荧光显微镜, 配备20X 水浸泡物镜 (0.5)。PBS 不会激活大脑中的细胞。如果需要 Z 轴图像, 物镜将与压电激活的透镜移动器一起安装。采用旋转圆盘共焦头, 提高了时间分辨率。对于低光成像, 电子倍增电荷耦合装置相机安装在显微镜上。GCaMP6s 荧光成像 (激发/发射: 488/509 nm) 需要一个 488 nm 激光器的励磁与分色光束分配器和发射过滤器 (e. g, 528, 38 nm 带通滤波器)。

1. 在显微镜下放置包含脑外植体的成像室。
2. 降低物镜, 直到它触及 PBS。在光明场光照下, 定位大脑并将其聚焦。切换到荧光灯, 并调整 GCaMP6s-labeled 细胞的焦点。
   注意: GCaMP6s 的基底绿色荧光应该是可见的。
3. 使用适当的采集软件 (e. g, µManager), 在水冷模式下以 512 x 512 像素的分辨率开始获取250毫秒/帧。调整曝光时间, 在 CCD 摄像机的动态范围内获得荧光值, 但不低于 1000 (任意单位), 具有16位图像 (动态范围 0-65,535)。
   注意: 低曝光时间应用于减少 GCaMP6s 的光漂白。在每个实验中应优化曝光时间, 因为这取决于 GCaMP6 的表达水平和检测系统的灵敏度。这是 100 ms 在我们的实验中使用dilp2 > GCaMP6s.当给定成像深度需要 z 段时, 可以根据曝光时间和帧间隔来获取多个 z 剖面图像。如果相机有足够的空间分辨率, 则应增加 binning 大小 (芯片上的寄存器数, 将作废成一个数字像素), 以减少曝光时间。
4. 一旦确定了成像参数, 在肽管理之前采取1分钟的图像来检测基线信号强度 (F₀)。
5. 应用试验肽;为此, 在 PBS 中溶解100µL 肽溶液, 并将其直接注入幼虫浴中, 以产生最佳浓度。
   注: 肽溶液应缓慢注射 (例如, 流速20µL/秒) 进入浴缸溶液使用吸管。在 PBS 中溶解的不相关合成肽被用作阴性对照。
6. 记录 GCaMP6s 发射数分钟。

3. 数据分析

注意: 图像数据与 ImageJ 进行离线分析。在时间推移成像, 吹打导致幼虫大脑移动。因此, 在分析前应纠正序列图像的位置畸变。更正可以使用 ImageJ 插件执行, TurboReg 如下所示。

1. 打开分析软件, 并使用第一帧 (在多肽应用程序之前) 作为参考图像。
2. 选择插件 |注册 |TurboReg。
3. 选择串行图像文件作为Source , 并将引用图像作为目标。
4. 检查刚体(图像的平行位移和旋转) 和精确("快速") 的处理方法和质量分别是粗而快速的分析。
5. 单击批处理开始图像处理。
6. 使用分析 | "选择多个感兴趣的区域 (ROIs)" |工具 |ImageJ 中的 ROI 管理器。
7. 单击更多 |多项措施 |OK在 ROI 管理器窗口中。
8. 计算ΔF₀ = (f f₀)/f₀, 其中 f 是刺激时的 ROI 强度, 而 f₀是在特定实验事件之前 (例如, 30 帧之前) 的时间窗口中的强度。刺激发作)。
9. 用多个脑样本重复实验, 进行统计处理, 获得平均 (SEM) 在每个时间点的平均值和标准误差。

结果

利用这一协议, 研究了肽类激素 CCHa2 对脑胰岛素生成细胞的活化作用。野生型脑的化学品方案使用dilp2GAL4¹² (来自 Rulifson 博士的礼物) 和UAS-GCaMP6s¹³ (金博士的礼物) 的组合标记了 GCaMP6s。采用合成 CCHa2 肽对幼虫脑外植体进行治疗, 并实时记录 GCaMP6s 的荧光。在这个实验中, 图像是从一个单一的焦平面获得的。每个 IPC 群集包含?...

讨论

此处描述的 Ca^{2 +}成像方法是一种用于测试大脑中荷尔蒙功能的有用系统。在体内,大脑接收来自各种内分泌器官的荷尔蒙。此外, 大脑不断感知上升的感官信息, 这会导致自发的神经元活化。此前体系统消除了此类噪音, 并产生了比体内成像更好的信号/噪声比。在这个系统中, 分子可以单独或组合测试。除了肽荷尔蒙, 任何水溶性分子, 包括天然或合成化合物, 都可以应用?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/