전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

요약

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

초록

내 분 비 신호에 의해 기관 대 기관 통신 예를 들어 뇌에 주변에서은 항상성 유지 하기 위한 필수. 내 분 비 연구 모델 동물로, 초파리 melanogaster, 어떤은 정교한 유전자 도구 및 게놈 정보, 점점 사용 되고있다. 이 문서에는 초파리 뇌 explants의 칼슘 이미징 하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 직접 뇌에 호르몬의 신호 감지 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 많은 펩 티 드 호르몬 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs), 누구의 활성화 세포내 캘리포니아^{2 +}농도 있는 증가 일으키는 통해 행동. 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아^{2 +} 레벨을, 캘리포니아^{2 +} 유입 및 캘리포니아^{2 +} 바인딩과 그물 (ER)에 저장 된 자료를 올린다. 칼슘 센서, GCaMP, 이러한 Ca^{2 +} 변화를 모니터링할 수 있습니다. 이 방법에서는, GCaMP의, 신경에 표현 하 고 GCaMP을 표현 하는 애벌레 뇌를 해 부하 고 교양 비보 전. 테스트 펩 티 드 다음 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 GCaMP에 장착 된 CCD 카메라 회전 디스크 confocal 현미경을 사용 하 여 검색. 이 메서드를 사용 하 여 모든 수용 성 분자는 시험 될 수 있다, 그리고 신경 활성화와 관련 된 다양 한 셀룰러 이벤트 적절 한 형광 표시기를 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 또한, 이미징 챔버를 수정 하 여 이미지 다른 초파리 장기 나 다른 동물의 장기를이 메서드를 사용할 수 있습니다.

서문

기관 대 기관 통신 환경 변화에 대처 하기 위해 항상성 유지 하기 위한 진화론 보존된 전략 이다. 인간, 순환으로 내 분 비 동맥에서 호르몬 arereleased의 다양 한. 이러한 호르몬의 많은 신진 대사 과정 및^1,2먹이 등 기본적인 동작을 조절 하는 두뇌의 시상 하 부 대상. 많은 호르몬 포유류 모델을 사용 하 여 발견 되었습니다. 그러나, 그들의 행동, 특히 있는 그들이 참여, interorgan 네트워크의 메커니즘 크게 불분명 남아 있습니다.

초파리 melanogaster 기관 대 기관 통신 공부에 대 한 유용한 모델로 떠오르고 있다. 곤충, 많은 생리 적인 과정은 호르몬에 의해 제어 됩니다. 초기 연구 성장과 변형에 초점을 맞추고 큰 곤충을 사용. 이 연구에서 제거 또는 특정 장기의 이식 예측 간 장기 신호 분자;의 존재 나중에, 젊은 호르몬 (JH), Prothoracicotropic 호르몬 (PTTH), 및 Ecdysone 화학적 정화^3,,45했다. 세포 신호 펩 티 드의 큰 가족 곤충 라이프 사이클^6,7동안 다양 한 생리 적 행사에 참여 하 생각 된다. 이러한 펩 티이 드의 대부분 비록 특정 GPCRs 처음 전통적인 방법을 사용 하 여 식별 하기 어려운 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)에서 작동 합니다. 초파리 전체 게놈 순서⁸ 의 간행물이 이었다 초파리 생리 활성 펩 티 드는 다른 곤충에서 발견 된에 그들의 상 동에 따라 식별을 사용 하는 획기적인. 또한, 여러 가지 펩 티 드에 대 한 수용 체는 GPCRs GPCR 리간드 바인딩 분석 셀-문화-기반을 사용 하 여 게놈에 예측에서 확인 되었다. 다음, 식 분석 예측 기관 대 기관 경로 이러한 펩 티 드와 수용 체에 의해 elicited. 특히, 상 상속 펩 티 드 수용 체의 많은 두뇌, 두뇌 펩 티 드 호르몬⁹의 주요 목표는 제안 표현 됩니다. 또한, 초파리 에서 유전자 고급 도구 펩 티 드 GPCR 조합의 생리 적 역할의 id에 공헌 했다. 예를 들어, GAL4 및 LexA 기반 이진 transcriptional 시스템 활성화 유전자 최저 또는 overexpression 공간 및 일시적으로 제어 방식. GAL4, 효 모에서 확인 된 녹음 방송 요인 특정 cis 규제 시퀀스 라는 상류 활성화 순서 (UAS)에 바인딩합니다. GAL4/UAS 시스템에서 드라이버 라인 제공 조직 관련 또는 단계 특정 GAL4 표현과 응답자 선 관심 또는 드라이브 shRNA 식 구조 유전자의 상류 UAS 운반. LexA/LexAop 시스템 비슷한 메커니즘을 기반으로 합니다. 조직의 특정 펩 티 드-최저와 조직 특정 GPCR 최저 동물의 phenotypic 분석 펩 티 드 GPCR 신호 모드와 행동의 사이트에 대 한 정보를 알아낼 수 있습니다. 그러나, 유전자 데이터에 의해서만 도달 될 수 있는 결론 제한 됩니다. 다른 한편으로, 특정 펩 티 드 호르몬의 상 상속 대상 조직 또는 세포 유형으로 좁혀입니다, 일단 비보 전 칼슘 기관 explants 이미징 펩 티 드 GPCR 신호에 의해 중재 기관 대 기관 통신 명료 하 사용할 수 있습니다. Gq 결합 GPCR의 활성화, 세포내 캘리포니아^{2 +} 농도¹⁰응급실 캘리포니아^{2 +} 의 출시로 인해 증가 된다. 뇌, 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아^{2 +} 레벨을 올린다. 이러한 Ca^{2 +} 증가 칼슘 센서, GCaMP, 캘리포니아^{2 +} 형광 방출¹¹결과의 구조적 변화를 겪 습에 의해 감지할 수 있습니다.

이 문서에서는, 초파리 뇌를 사용 하 여 이미징 방법 explants 칼슘 설명 되어 있습니다. 특정 뉴런을 활성화 하는 펩 티 드의 능력을 테스트 하기 위해 테스트 펩 티 드 GCaMP 표현 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 confocal 현미경 검사 법에 의해 모니터링 됩니다. GPCR의 참여는 GPCR 부족 돌연변이 두뇌를 사용 하 여 동일한 분석 결과 수행 하 여 다음 확인 된다. 이미징 및 유전학의이 조합은 펩 티 드에 의해 기관 대 기관 통신에 대 한 정확한 정보를 제공 합니다-GPCRs. 가능 수정 및이 프로토콜의 응용 프로그램 또한 토론 된다.

프로토콜

1입니다. 애벌레 뇌 Explants의 준비

1. 이미징 챔버를 확인 합니다.
   참고: 안정적인 녹음 두뇌 explants 곁 수 있어야 합니다. 여기, 낮은-비용, 손으로 만든 이미징 챔버는 Ca^{2 +} 이미징 시스템에 사용 됩니다.
   1. 집게를 사용 하 여 쉽게 장착 (1.3, 그림 1단계)를 만드는 애벌레 두뇌의 복 부 신경 절에 대 한 덴트를 만드는 플라스틱 문화 접시 (35 m m x 10 m m)의 하단 중앙 스크래치.
   2. 이쑤시개와 덴트의 양쪽에 superglue의 작은 방울을 놓고 접착제를 텅스텐 막대 (0.125 m m, 6 ~ 7 m m 길이)를 연결 합니다.
   3. 퍼 티 같이 재사용할 수 있는 접착제의 작은 조각을 사용 하 여, 확인 (10 m m 직경에서 및 높이 3 m m) 원형 벽 주변 덴트 (그림 1).
      참고: 벽 내부의 공간 나중으로 채워질 것 이다 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 0.14 M NaCl, KCl, 0.0027 M 0.01 M 포₄^3-, 25 ℃에서 pH 7.4 ± 0.05).
2. 동물 준비
   참고: 칼슘 이미징, 칼슘 표시기, GCaMP6s, 표현 된다 세포 유형의 관심, 일반적으로 조직의 특정 GAL4 UAS-GCaMP6s의 조합을 사용 하 여 이루어집니다. 신호 후보 수용 체를 통해 중재 된다 되도록 GCaMP6s 수용 체에 결함이 있는 돌연변이 또한 표현 된다.
   1. 다른 genotypes 야생 타입 등 돌연변이 대 한 실험 비교 필요한 경우 GCaMP6 식 수준 변화와 발달 단계에 따른 생리 적 차이 피하기 위해 일치 시험 애벌레 나이.
   2. 포함 하는 음식의 표면에 계란-누워 있도록 8 h에 대 한 표준 비행 거리 음식 문화 유리병에 부모의 파리 (30 파리 각 섹스에 대 한)을 유지. 25 ° C와 60-70% 상대 습도에서 12 h 빛 어두운 주기에서 질량에는 문화 애벌레
3. 애벌레는 두뇌의 해 부
   1. (AEL) 누워 계란 후 90-120 h, 애벌레를 수집 하 고 그들에 게 부착 식품 이물질 제거를 증류수와 적어도 3 번을 씻어.
   2. 장소는 1.5 인치 사각 시계 유리에 유 충은 얼음 차가운 PBS 가득합니다.
      참고: 다음 두 단계 해 현미경이 시계 유리에 수행 됩니다.
   3. 집게를 사용 하 여 부드럽게 유 충의 중간 부분을 잡아. 다른 집게를 사용 하 여 입 후크를 유 충을 포함 하는 시체의 나머지 부분에서 뇌의 앞쪽 부분을 부드럽게 입 고리를 당겨.
      참고: 또는, 수술가 위 사용할 수 있습니다.
   4. 겸 자에 의해 앞쪽 끝을 누른 유 충을 안으로 밖으로 설정 합니다. 외부 조직 imaginal 디스크, 지방 기관, 링 선 등 뇌에 연결을 제거 합니다. 부드럽게는 mouthparts에서 뇌를 분리 합니다.
   5. PBS의 200 µ L 이미징 챔버에 퍼 티 같은 재사용 접착제의 링의 안쪽에 적용 됩니다. 부드럽게 파스퇴르 피 펫에 PBS 가진 해 부 뇌를 빨 아 하 고 이미징 챔버로 전송.
4. 두뇌 이미징 챔버로 설정
   1. 집게를 사용 하 여 복 부 신경에서 연장 하는 근육 섬유를 잡아. 텅스텐 와이어 아래 덴트에 두뇌를 부드럽게 삽입 합니다.
   2. 다른 집게를 사용 하 여, 풀 텅스텐 와이어를 약간 장소 두뇌 이미징 (그림 1)에 대 한 올바른 위치에.

2. Ca^{2 +} 형광 이미지 수집

참고: PBS에 몰입 하는 뇌 explants는 몇 군데 물 침수 렌즈 X 20을 갖춘 형광 현미경을 사용 하 여 (없음 = 0.5). PBS는 뇌에서 세포를 활성화 하지 않습니다. Z 축 이미지, 필요한 경우 활성화 압 전 렌즈 발동기로 대물 렌즈 마운트입니다. 회전 디스크 confocal 머리는 시간 분해능을 향상 하는 데 사용 됩니다. 낮은 조명 촬영에 대 한 전 하 결합 소자 카메라 멀티 전자 현미경에 장착 됩니다. GCaMP6s 형광 이미징 (여기/방출: 488/509 nm) 여기 dichroic 빔 스플리터와 방출 필터 488 nm 레이저를 요구 한다 (예., 528 ± 38 nm 대역 대역 통과 필터).

1. 포함 하는 현미경 뇌 explant 이미징 챔버를 놓습니다.
2. 그것은 PBS를 건드리면 때까지 대물 렌즈를 낮춥니다. 필드 밝은 조명 아래 뇌 놓고 초점으로 그것을. 형광 빛을 전환 하 고 GCaMP6s 라는 세포에 초점을 조정 합니다.
   참고:는 GCaMP6s의 기저 녹색 형광 표시 되어야 합니다.
3. 250 ms에서 수집을 시작/냉각 모드 적절 한 수집 소프트웨어를 사용 하 여 512 × 512 픽셀의 해상도에서 프레임 (예., µManager). 16 비트 이미지 (동적 범위 0-65535) CCD 카메라의 동적 범위에서 형광 값을 1000 (임의의 단위) 보다 낮게 하지 노출 시간을 조정 합니다.
   참고: 낮은 노출 시간에 GCaMP6s의 사진-표백을 최소화 하기 위해 사용 해야 합니다. 그것은 GCaMP6의 식 수준 및 탐지 시스템의 감도에 따라 노출 시간 각 실험에 최적화 되어야 합니다. 그것은 사용 하 여 우리의 실험에서 100 ms dilp2 > GCaMP6s. Z-섹션 주어진된 이미징 깊이 대 한 필요한 경우, 여러 z 섹션 이미지 노출 시간과 프레임 간격에 따라 취득 수 있습니다. 카메라 공간 해상도 충분 한 경우, 노출 시간을 줄이기 위해 범주화 크기 (하나의 디지털 픽셀으로 범주화 하는 칩에 레지스터의 수)를 증가 한다.
4. 이미지 매개 변수를 확인 하는 펩 티 드 관리 기준 신호 강도 (F₀)를 검색 하기 전에 1 분 동안 이미지 걸릴.
5. 적용 테스트 펩 티 드. 이 위해, PBS에서 펩 티 드 솔루션의 100 µ L를 녹이 고 직접 최적 농도를 애벌레 욕조에 플라스틱.
   참고: 펩 티 드 솔루션 천천히 주입 되어야 한다 (예를 들어, 흐름 속도 20 µ L/s)는 피 펫을 사용 하 여 목욕 솔루션으로. 없는 합성 펩 티 드 PBS에 녹아 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
6. 몇 분 동안 GCaMP6s 방출을 기록 합니다.

3. 데이터 분석

참고: 영상 데이터는 오프 라인으로 ImageJ로 분석 된다. 시간 경과 화상 진 찰 동안 pipetting 이동 애벌레 뇌를 발생 합니다. 따라서, 직렬 이미지의 위치 착오 분석 하기 전에 수정 해야 합니다. 수정 된 ImageJ 플러그인, TurboReg를 사용 하 여 다음과 같이 수행할 수 있습니다.

1. 분석 소프트웨어를 열고 (펩 티 드 응용 프로그램) 전에 첫 번째 프레임 참조 이미지를 사용 합니다.
2. 플러그인을 선택 | 등록 | TurboReg.
3. 원본 으로 직렬 이미지 파일 및 대상으로 참조 이미지를 선택 합니다.
4. 체크 리 짓 바디 (병렬 변위 및 이미지의 회전)와 정확한 ("빠른"는 빠른 분석 하지만 거친 대신) 처리 방법 및 품질, 각각.
5. 일괄 이미지 처리 시작을 클릭 합니다.
6. 분석을 사용 하 여 관심사 (ROIs)의 여러 영역을 선택 | 도구 | 투자 수익 관리자 ImageJ에.
7. 더 많은 를 클릭 하 여 픽셀 강도 측정 | 다중 측정 | 확인 ROI 관리자 창에서.
8. Δ/F₀ 를 계산 = (F-F₀) /F₀, 어디 F 투자 수익 강도, 자극의 시간에서 이며 F₀ 특정 실험 이벤트 직전 시간대에 강도 (예를 들어, 30 프레임 앞에 자극 증상)입니다.
9. 반복 실험 여러 뇌 샘플을 사용 하 여, 평균 및 각 시간 지점에서 평균 (SEM)의 표준 오차를 통계 처리를 수행 합니다.

결과

이 프로토콜을 사용 하는 펩 티 드 호르몬, CCHa2에 의해 뇌 인슐린 생산 세포 (IPCs)의 정품 인증 시험 되었다. 야생-타입 두뇌의 IPCs GCaMP6s로 표시 했다 dilp2-GAL4¹² (박사 Rulifson 선물), UAS-GCaMP6s¹³ (김 박사 선물)의 조합을 사용 하 여. 애벌레 두뇌 explants 합성 CCHa2 펩 티 드로 치료 했다 그리고 GCaMP6s에서 형광 실시간으로 기록 했다...

토론

캘리포니아^{2 +} 이미징 방법을 여기에 설명 된 뇌에서 호르몬의 기능을 테스트 하기 위한 유용한 시스템입니다. Vivo에서 두뇌 다양 일 분 비 장기에서 호르몬을 받습니다. 더하여, 두뇌는 끊임없이 자연 신경 활성화를 일으키는 원인이 되는 감각 정보를 오름차순 인식. 이 비보 전 시스템 같은 노이즈를 제거 하 고 vivo에서 영상 보다 더 나은 신호/잡음 비율을 생성 합니?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/