Ex Vivo Кальция изображений для визуализации мозга ответы на эндокринных сигнализации в дрозофилы

Резюме

Этот документ описывает протокол для ex vivo кальция томография головного мозга дрозофилы . В этом методе натуральных или синтетических соединений может применяться в буфер, чтобы проверить свои способности для активации определенной нейронов в головном мозге.

Аннотация

Орган орган связи, эндокринных сигнализации, например, от периферии к мозгу, имеет важное значение для поддержания гомеостаза. Как животное модель эндокринных исследований, Drosophila melanogaster, который сложных генетических инструменты и информацию геном, все чаще используется. Эта статья описывает метод для кальция томографии мозга эксплантов дрозофилы . Этот метод позволяет выявлять прямой сигнализации гормона в мозг. Хорошо известно, что многие пептидные гормоны действуют через G-белок-рецепторы (GPCR), чьи Активация приводит к увеличению концентрации внутриклеточного Ca^{2 +}. Нейронные активации также повышает внутриклеточное Ca^{2 +} уровней, от Ca^{2 +} приток и выхода Ca^{2 +} хранятся в эндоплазматический ретикулум (ER). Датчиком кальция, GCaMP, можно контролировать эти Ca^{2 +} изменения. В этом методе, GCaMP выражается в нейронах интерес, и выражая GCaMP личинок мозг расчлененные и культивировали ex vivo. Пептид тест затем применяется к экспланта мозга, и флуоресцентные изменения в GCaMP обнаруживаются с помощью вращающийся диск Конфокальный микроскоп оснащены ПЗС-камеры. С помощью этого метода, может быть проверена любая молекула, растворимый в воде, и различных клеточных события, связанные с нервной активации может отражаться с использованием соответствующих показателей флуоресцентные. Кроме того изменяя тепловизионной камеры, этот метод может использоваться для изображения другие Drosophila органов или органов других животных.

Введение

Орган орган коммуникация является эволюционно сохранены стратегия для поддержания гомеостаза справляться с экологическими изменениями. В организме человека, различные гормоны arereleased от эндокринных желез в кровоток. Многие из этих гормонов целевой гипоталамусе мозга, который регулирует метаболические процессы и основных поведения, таких как кормления^1,2. Многие гормоны были обнаружены с помощью млекопитающих моделей. Однако механизмы их действия, особенно межорганных сетей, в которых они участвуют, остаются во многом неясными.

Drosophila melanogaster стала полезной моделью для изучения орган орган коммуникации. У насекомых многие физиологические процессы находятся под контролем гормонов. Ранние исследования, сосредоточив внимание на рост и метаморфозы используется крупными насекомыми. В этих исследованиях удаления или трансплантации органов конкретных предсказал существование межучрежденческого органа сигнальных молекул; позже биохимически очищенных^3,,45были несовершеннолетних гормонов (JH), Prothoracicotropic гормон (Переднегрудь) и экдистероидов. Считается, что большое семейство межклеточной сигнализации пептидов быть вовлечены в различных физиологических событий во время жизненного цикла насекомых^6,7. Большинство из этих пептидов действуют на G-белок-рецепторы (GPCR), хотя конкретные GPCR были изначально трудно идентифицировать с помощью традиционных подходов. Публикация на весь геном дрозофилы последовательности⁸ был прорыв, который позволил идентификации дрозофилы биоактивные пептиды, основанный на их гомологии для тех, кто в других насекомых. Кроме того были определены рецепторов для нескольких пептидов из GPCR, предсказал в геноме используя основанные на клетки культура GPCR-лиганд привязки анализов. Далее выражение анализы предсказал пути орган орган, вызвало эти пептиды и рецепторы. Примечательно многие из предполагаемых пептид рецепторов выражаются в головном мозге, предполагая, что мозг является одной из основных целей пептидных гормонов⁹. Кроме того дополнительные генетические инструменты в дрозофилы способствовали идентификации физиологической роли пептид ХВГФ комбинаций. Например GAL4 и двоичные транскрипционный анализ систем, основанных на LexA позволяют нокдаун гена или гиперэкспрессия пространственно и височно контролируемым образом. GAL4, транскрипционный фактор, выявленных в дрожжи, привязывается к определенной СНГ регуляторные последовательности называется вверх по течению последовательности активации (бас). В системе GAL4/Уан водитель линия обеспечивает ткани конкретных или стадии конкретных GAL4 выражения и линии ответчик несет UAS вверх по течению гена интереса или конструкцию привода индуцируемый выражение. LexA/LexAop система основана на аналогичный механизм. Фенотипические анализы ткани конкретных пептид нокдаун и ткани конкретных GPCR-нокдаун животных может раскрыть информацию о режиме сигнальный пептид GPCR и сайт действий. Однако выводы, которые могут быть достигнуты лишь путем генетических данных ограничены. С другой стороны после предполагаемого целевой конкретной пептидный гормон сужано вниз к типу ткани или клетки, ex vivo кальция изображений в орган эксплантов может использоваться для уточнения связи орган орган, при посредничестве сигнальный пептид GPCR. После активации Gq в сочетании GPCR внутриклеточный Ca^{2 +} концентрация увеличивается из-за выхода Ca^{2 +} ER¹⁰. В головном мозге нейронные активации также поднимает внутриклеточных Ca^{2 +} уровнях. Такое Ca^{2 +} увеличение могут быть обнаружены датчиком кальция, GCaMP, который претерпевает конформационные изменения в присутствии Ca^{2 +} результате флуоресценции выбросов¹¹.

В этой статье описан кальция, которые эксплантах изображений методом дрозофилы мозга. Для проверки способности пептидной активировать определенных нейронов, пептид тест применяется к экспланта мозга выразив GCaMP, и флуоресценции изменения контролируются confocal микроскопии. Участие GPCR затем подтвердил, выполнив же анализа с использованием мутантов мозга отсутствует GPCR. Эта комбинация изображений и генетики предоставляет точную информацию о связи орган орган, пептиды-обсуждаются также GPCR. возможные изменения и применение настоящего Протокола.

протокол

1. Подготовка эксплантов личиночной мозга

1. Сделайте тепловизионные камеры.
   Примечание: Стабильная запись требует привязал эксплантов мозга. Здесь в Ca^{2 +} система используется лоу кост, ручной тепловизионные камеры.
   1. С помощью щипцов, поцарапайте центр нижней пластиковой культуры блюдо (35 мм x 10 мм) для создания вмятину на вентральной ганглия личиночной мозга, делая легче монтажа (шаг 1.3, рис. 1).
   2. С зубочисткой поместите небольшую каплю суперклея на обе стороны Дент и прикрепить электроды (0,125 мм диаметр, длина 6-7 мм) на клей.
   3. С помощью небольшой кусок шпаклевки как многоразовые клей, сделать бра (10 мм в диаметре и высотой 3 мм) окружающих Дент (рис. 1).
      Примечание: Пространство внутри стены будет позднее наполнен фосфатный буфер (PBS; 0,14 М NaCl, 0,0027 M KCl,₄PO 0,01 М^{3 -}, рН 7,4 ± 0,05 при 25 ° C).
2. Подготовка животных
   Примечание: Для изображений кальция, кальция индикатор, GCaMP6s, выражается в типе ячейки интерес, который обычно достигается с помощью сочетания ткане-GAL4 и Бла-GCaMP6s. Чтобы убедиться, что сигнал опосредовано через рецептор кандидата, GCaMP6s выражается также в мутанта дефекты рецептора.
   1. Когда требуются экспериментальные сопоставления для различных генотипов как дикого типа и мутантов, возраст матч тест личинки во избежание GCaMP6 выражение уровня, вариации и физиологические различия, вызванные стадии развития.
   2. Держите родителей мух (30 мух для каждого пола) в культуры флакон, содержащий стандартные летать пищу для 8 h разрешить яйцекладка на поверхности продовольствия. Личинки культуру в массы под 12-h свето тени цикла при 25 ° C и 60-70% относительной влажности.
3. Рассечение личиночной мозга
   1. В 90-120 ч после откладки яиц (AEL) собирать личинок и мыть их по крайней мере 3 раза с дистиллированной водой для удаления остатков адэрентных пищи.
   2. Место личинки на площади 1,5 дюймовый смотреть стакан наполнен лед холодной PBS.
      Примечание: Следующие два шага осуществляется в этом смотреть стекла под микроскопом рассечения.
   3. Используйте корнцанг аккуратно схватить средней части личинка. Используйте другую щипцами, чтобы захватить рот крючки и тянуть рот крючки осторожно, чтобы отделить переднюю часть личинок, содержащие мозг от остальной части тела.
      Примечание: в качестве альтернативы, Ножницы хирургические может использоваться.
   4. Удерживайте передней оконечности щипцами и поверните личинку наизнанку. Удаление посторонних ткани прилагается к мозгу, например имагинальных дисков, жир тела и кольцо железы. Аккуратно отделите мозг от ротовые.
   5. Применить 200 мкл PBS внутри кольца из шпаклевки как многоразовые клей в тепловизионной камере. Нежно сосать расчлененных мозга с PBS в пипетка Пастера, а затем передать его в тепловизионной камеры.
4. Настройка мозга в тепловизионной камеры
   1. Используйте пинцет, чтобы захватить мышечных волокон, простирающейся от брюшной ганглии. Аккуратно вставьте мозга в Дент под Вольфрамные проволоки.
   2. Используя другую щипцами, тянуть провода вольфрама слегка до место мозга в правильное положение для изображений (рис. 1).

2. приобретение Ca^{2 +} флуоресценции изображений

Примечание: Мозг эксплантов погружен в PBS отражаются с помощью микроскопа флуоресценции оснащены 20 X объектив погружения в воду (н.а. = 0,5). PBS не активировать клетки в головном мозге. Если требуются Z-axis изображения, объектив монтируется с пьезоэлектрический активированный объектив двигателем. Конфокальный голову спиннинг диск используется для повышения времени резолюции. Для низкой освещенности изображения, электрон, умножая зарядовой камеры монтируется на микроскопе. Томографии GCaMP6s флуоресцентным (возбуждения/выбросов: 488/509 Нм) требует 488 нм лазер для возбуждения с дихроичным пучка сплиттер и фильтра выбросов (например., 528 ± 38 Нм группы полосовой фильтр).

1. Место обработки изображений камеру, содержащую экспланта мозга под микроскопом.
2. Ниже объектива, пока он не коснется PBS. Под ярко поле освещения позиция мозга и приведения его в фокус. Переключитесь на дневной свет и отрегулируйте фокус на GCaMP6s-меченых клетки.
   Примечание: Базальной зеленой флуоресценцией GCaMP6s должны быть видны.
3. Начать приобретение на 250 мс/рамы с разрешением в 512 × 512 пикселей в водоохлаждающие режиме, с использованием соответствующего приобретения программного обеспечения (например., µManager). Отрегулируйте время экспозиции для получения значений флуоресценции в рамках динамического диапазона камеры на ПЗС, но не менее 1000 (условные единицы), с 16-битные изображения (динамический диапазон 0-65535).
   Примечание: Время низкого воздействия должно использоваться для сведения к минимуму фото отбеливание GCaMP6s. Время экспозиции должны быть оптимизированы в каждом эксперименте, как это зависит от уровня выражения GCaMP6 и чувствительность системы обнаружения. Это был 100 мс в наш эксперимент с использованием dilp2 > GCaMP6s. При z секции требуются для заданной глубине обработки изображений, несколько z раздел изображения могут быть приобретены в зависимости от воздействия времени и кадров интервалы. Если камера имеет достаточно пространственным разрешением, биннинга размер (количество регистров на чипе, которая будет сегментирования в один пиксел цифровой) следует увеличить уменьшить время экспозиции.
4. После того, как определяются параметры визуализации, принимать изображения за 1 мин до администрации пептидные для выявления исходных интенсивности сигнала (₀F).
5. Применить тест пептид; для этого растворить 100 мкл раствора пептида в PBS и Пипетка непосредственно в личиночной ванну для получения оптимальной концентрации.
   Примечание: Пептид раствор следует вводить медленно (например, потока скорость 20 мкл/с) в ванной решения с помощью пипетки. Несвязанные синтетический пептид, растворенных в PBS используется в качестве отрицательного контроля.
6. Запись GCaMP6s выбросов за несколько минут.

3. анализ данных

Примечание: Изображения данные анализируются в автономном режиме с ImageJ. При покадровой съемки, закупорить вызывает личиночной мозга для перемещения. Таким образом позиционные аберраций последовательных изображений должны быть исправлены перед анализом. Коррекция может производиться с использованием ImageJ плагина, TurboReg следующим образом.

1. Откройте программное обеспечение для анализа и использовать первый кадр (перед применением пептида) в качестве эталонного образа.
2. Выберите плагины | Регистрация | TurboReg.
3. Выберите последовательный образ файла в качестве источника и ссылки изображение в качестве целевой.
4. Проверьте Твердого тела (параллельного перемещения и вращения изображений) и точность («Быстрый» является грубым но быстрого анализа вместо) для метода обработки и качества, соответственно.
5. Выберите пакет для запуска обработки изображения.
6. Выберите несколько областей, представляющих интерес (ROI) с помощью анализ | Инструменты | Менеджер по ROI в ImageJ.
7. Измерения интенсивности пикселей, нажав более | Мера Multi | OK в окне менеджера ROI.
8. Рассчитать ΔF/F₀ = (F - F₀) / f₀, где F — ROI интенсивности во время стимул, и F₀ является интенсивность в окно времени непосредственно перед событием экспериментальный (например, 30 фоторамки предшествующих Начало стимул).
9. Повторите эксперимент с использованием нескольких образцов мозга, проведение статистической обработки для получения среднего и Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) в каждый момент времени.

Результаты

Используя этот протокол, активации мозга инсулин продуцирующих клеток (МПХБ), пептидный гормон, CCHa2, был рассмотрен. МПХБ одичал тип мозга были помечены с GCaMP6s с помощью комбинации dilp2 -GAL4¹² (подарок от доктора Rulifson) и Бас-GCaMP6s¹³ (подарок о?...

Обсуждение

Ca^{2 +} изображения метод, описанный здесь является полезной системы для тестирования функции гормонов в головном мозге. В естественных условиях, мозг получает гормонов из различных эндокринных органов. Кроме того мозг воспринимает постоянно, по возрастанию сенсорной информац?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/