Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Özet

Bu kağıt için ex vivo kalsiyum düşsel Drosophila beyin protokolünü açıklar. Bu yöntemde, doğal veya sentetik bileşikler beyindeki belli nöronlar etkinleştirmek için yeteneklerini test için tampon uygulanabilir.

Özet

Endokrin sinyal tarafından organ organ iletişim Örneğin, çevre beyne homeostazı korumak için çok önemlidir. Endokrin araştırma modeli hayvan, hangi genetik araçları ve genom bilgileri gelişmiş sahiptir, Drosophila melanogaster, giderek kullanılıyor. Bu makalede Drosophila beyin explants kalsiyum görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem, bir hormon beyne doğrudan sinyal algılama sağlar. İyi birçok peptid hormonlar G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs), kimin harekete geçirmek artışa neden olmaktadır intrasellüler Ca^{2 +}toplama yoluyla hareket bilinmektedir. Sinirsel harekete geçirmek de intrasellüler Ca^{2 +} düzeyleri, Ca^{2 +} akını ve endoplazmik retikulum (ER) depolanan Ca^{2 +} sürümü yükseltir. Bir kalsiyum sensör, GCaMP, bu Ca^{2 +} değişiklikleri izleyebilirsiniz. Bu yöntemde, GCaMP faiz nöronlarda ifade edilir ve GCaMP ifade larva beyin disseke ve kültürlü ex vivo. Test peptid sonra beyin explant için uygulanır ve GCaMP floresan değişiklikler CCD fotoğraf makinesi ile donatılmış dönen disk confocal mikroskop kullanarak algılanır. Bu yöntemi kullanarak, suda çözünen herhangi bir molekül test edilebilir ve sinirsel harekete geçirmek ile ilişkili çeşitli hücresel olaylar uygun floresan göstergeler kullanarak yansıma. Ayrıca, görüntüleme odası değiştirerek, bu yöntem diğer Drosophila organ veya diğer hayvanların organlarını görüntü için kullanılabilir.

Giriş

Organ organ iletişim çevresel değişiklikler ile başa çıkmak için homeostazı korumak için evrimsel korunmuş bir stratejidir. İnsanlarda, endokrin bezleri hormon arereleased çeşitli kan dolaşımı içine. Bu hormonların birçoğunu metabolik süreçleri ve^1,2besleme gibi temel davranışları düzenleyen beynin hipotalamus hedef. Birçok hormon memeli modelleri kullanarak tespit edilmiştir. Ancak, kendi eylem, özellikle içinde onlar katılmak, interorgan ağlar mekanizmaları büyük ölçüde belirsiz kalır.

Drosophila melanogaster organ organ iletişim eğitim için yararlı bir model olarak ortaya çıkmıştır. Böcekler, birçok fizyolojik süreçleri hormonlar tarafından kontrol edilir. Büyüme ve metamorfoz odaklanarak erken çalışmaları büyük böcekler kullanılır. Bu çalışmalarda, kaldırma veya belirli organ nakli arası organ sinyal molekülleri varlığını tahmin; daha sonra Juvenil hormon (JH), Prothoracicotropic hormon (PTTH) ve Ecdysone biyokimyasal olarak saflaştırılmış^3,4,5idi. Hücreler arası sinyal peptidler büyük bir ailenin böcek ömrü^6,7sırasında çeşitli fizyolojik olaylara karışmış olduğu düşünülmektedir. Belirli GPCRs geleneksel yaklaşımları kullanarak tanımlamak başlangıçta zor olmasına rağmen bu peptidler çoğunu G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs), hareket. Drosophila tüm genom dizisi⁸ yayın Drosophila biyoaktif peptidler onların Homoloji diğer böcekler içinde bulunanlara göre tanımlaması etkin atılım oldu. Ayrıca, birkaç peptidler reseptörleri hücre kültür esaslı GPCR-ligand bağlayıcı deneyleri kullanarak genom tahmin GPCRs üzerinden tespit edilmiştir. Daha sonra ifade analizleri Bu peptidler ve reseptörler tarafından elde edildi organ organ yolları öngördü. Özellikle, birçok sözde peptid reseptörlerinin beyin peptid hormonlar⁹uğrak bir olduğunu düşündüren beyindeki ifade edilir. Ayrıca, Drosophila gelişmiş genetik araçlarında peptid GPCR kombinasyon fizyolojik rolleri tanımlama için katkıda bulunmuştur. Örneğin, GAL4 ve LexA tabanlı ikili transkripsiyon sistemler gen nakavt veya overexpression dağınık şekilde ve geçici denetimli bir biçimde etkinleştirin. GAL4, Maya, tanımlanan bir transkripsiyon faktörü ters yönde harekete geçirmek sıra (UAS) adı verilen belirli bir CIS düzenleyici dizisine bağlanır. GAL4/UAS sisteminde doku özel sürücü hattı oluşturur veya Yanıtlayıcı satır ve sahne-özel GAL4 ifade taşır UAS akıntıya karşı gen faiz veya sürücü shRNA ifade için yapı. LexA/LexAop sistem benzer bir mekanizma dayanmaktadır. Doku özgü peptid-nakavt ve doku özgü GPCR nakavt hayvanların fenotipik analizleri peptid GPCR'ın sinyal modu ve site eylem hakkında bilgi ortaya çıkarabilir. Ancak, sadece genetik veri tarafından ulaşılabilir sonuçları sınırlıdır. Öte yandan, bir kez bir belirli peptit hormon sözde hedef bir doku veya hücre türüne aşağı daralmış, organ explants Imaging ex vivo kalsiyum peptid GPCR sinyal tarafından aracılı organ organ iletişim aydınlatmak için kullanılabilir. Gq birleştiğinde GPCR harekete geçirmek, açıklaması, Ca^{2 +} ER¹⁰nedeniyle intrasellüler Ca^{2 +} konsantrasyonu artar. Beyinde, sinir harekete geçirmek de intrasellüler Ca^{2 +} düzeyleri yükseltir. Böyle Ca^{2 +} artar bir kalsiyum sensör, huzurunda floresans emisyon¹¹' kaynaklanan Ca^{2 +} konformasyon değişiklikler geçer GCaMP tarafından tespit edilebilir.

Bu makalede, Drosophila beyin kullanarak görüntüleme yöntemi explants bir kalsiyum açıklanmıştır. Belirli nöronların harekete geçirmek bir peptid yeteneğini test etmek için bir test peptid GCaMP ifade beyin explant için uygulanır ve floresan değişiklikler confocal mikroskobu tarafından izlenir. GPCR katılımı sonra GPCR eksik bir mutant beyin kullanarak aynı tahlil gerçekleştirerek doğruladı. Bu görüntüleme ve genetik organ organ iletişim hakkında kesin bilgi peptidler tarafından sağlar-GPCRs. olası değişiklikler ve uygulamaları bu protokolün de ele alınmıştır.

Protokol

1. larva beyin Explants hazırlanması

1. Bir görüntüleme odası yapmak.
   Not: İstikrarlı kayıt beyin explants gergin gerekir. Burada, düşük maliyetli, el yapımı görüntüleme odası görüntüleme sistemi Ca^{2 +} içinde kullanılır.
   1. Forseps kullanarak, alt bölümünde ortada bulunan bir göçük montaj daha kolay (adım 1.3, Şekil 1) yapma larva beyin ventral sinir düğümü için oluşturmak için bir plastik kültür çanak (35 mm x 10 mm) kaşı.
   2. Bir kürdan ile yapıştırıcı küçük bir damla çukuru her iki yanına koyun ve bir tungsten çubuk (0,125 mm çap, 6-7 mm uzunluk) tutkal için ekleyebilirsiniz.
   3. Küçük bir parça macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcı kullanarak, yapmak dairesel duvar (10 mm çapında ve 3 mm yüksek) (Şekil 1) dent çevreleyen.
      Not: Duvar içinde boşluk daha sonra fosfat tamponlu tuz ile doldurulur (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M PO₄^{3 -}, pH 7.4 ± 0,05 25 ° c).
2. Hayvan hazırlık
   Not: kalsiyum görüntüleme için sık doku özgü GAL4 ve UAS-GCaMP6sbileşimlerini kullanarak elde edilir faiz hücre tipi kalsiyum göstergesi, GCaMP6s, ifade edilir. Sinyal aday reseptör aracılı emin olmak için GCaMP6s da bir mutant reseptör içinde arızalı ile ifade edilir.
   1. Deneysel karşılaştırmalar vahşi türü ve mutantlar gibi farklı genotip için gerekli olduğunda, maç test larva GCaMP6 ifade düzey varyasyonları ve fizyolojik farklılıklar gelişim dönemleri nedeniyle önlemek için yaş.
   2. Ebeveyn sinekler (30 sinekler her seks için) standart sinek gıda gıda yüzeyinde yumurta döşeme izin vermek 8 h için içeren bir kültür şişe bulundurun. 25 ° C ve 60-%70 bağıl nem bir 12-h koyu döngüsü altında kitle kültürü larvaları.
3. Larva beyin diseksiyon
   1. 90-120 h (AEL) döşeme yumurta sonra larva toplamak ve en az 3 kez yapisan gıda enkaz kaldırmak için distile su ile yıkayın.
   2. Yer bir larva bir kare 1.5-inç izle cam buz soğuk PBS ile dolu.
      Not: Sonraki iki adımı bu seyretmek cam diseksiyon mikroskop altında devam etmektedir.
   3. Forseps yavaşça larva orta parçası kapmak için kullanın. Başka bir forseps ağız kanca al ve yavaşça beyin vücudun geri kalanından içeren larva ön bölümünü ayırmak için ağız kanca çekmek için kullanın.
      Not: Alternatif olarak, cerrahi makas kullanılabilir.
   4. Ön uç forseps tarafından tutun ve larva mahvedecekler. Imaginal diskler, yağ organları ve yüzük bezi gibi beyin bağlı yabancı dokuyu. Yavaşça beyin ağız ayırın.
   5. PBS 200 µL macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcı görüntüleme odasında yapılan halka içine uygulanır. Yavaşça Pasteur pipet disseke beynine PBS ile emmek ve ardından görüntüleme odanın içine aktarın.
4. Beyin görüntüleme odasına ayarlama
   1. Forseps kas lifleri ventral gangliyon uzanan kapmak için kullanın. Beyin yavaşça göçük altında tungsten kabloyu takın.
   2. Başka bir forseps kullanarak, çekme tungsten tel biraz ilâ yer beyin (Şekil 1) görüntüleme için doğru konumda.

2. Ca^{2 +} floresans görüntüleri edinimi

Not: PBS içinde dalmış beyin explants 20 X su-daldırma objektif lens ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak yansıma (N.A. 0,5 =). PBS beyin hücrelerinde etkinleştirmez. Z ekseni görüntüleri gerekiyorsa, objektif lens piezoelektrik aktif lens nakliyeci ile monte edilir. Bir iplik disk confocal kafa zaman çözünürlüğü arttırmak için kullanılır. Düşük ışık görüntüleme için şarj kuplajlı cihaz kamera çarparak bir elektron mikroskobunun monte edilir. GCaMP6s floresan görüntüleme (uyarma/emisyon: 488/509 nm) uyarma bir dikroik ışın ayırıcı ve bir emisyon filtre ile 488-nm lazer gerektirir (Örn., 528 ± 38 nm bant bant filtre).

1. Beyin explant mikroskop altında içeren görüntüleme odası yerleştirin.
2. PBS dokunana dek objektif lens indirin. Alan parlak aydınlatma altında beyin getirin ve odak haline getirmek. Floresan ışık geçiş ve GCaMP6s etiketli hücreleri üzerinde odak noktası ayarlayın.
   Not: GCaMP6s bazal yeşil floresans görünür olmalıdır.
3. Edinme, 250 ms başlatmak/çerçeve uygun satın alma yazılımı kullanılarak su soğutmalı modunda 512 × 512 piksel çözünürlükte (Örn., µManager). CCD kamera dinamik alanı değerlerinin floresans elde, ama (rasgele adet), 1000'den daha düşük değil için pozlama süresi 16-bit görüntüleri (dinamik aralığı 0-65. 535 ') ile ayarlayın.
   Not: Düşük çekim hızı fotoğraf-GCaMP6s ağartma en aza indirmek için kullanılır. GCaMP6 ifade düzeyleri ve algılama sistemi duyarlılığını bağlıdır gibi çekim hızı her deneyde optimize edilmelidir. Bizim deneme kullanarak 100 ms olduğunu dilp2 > GCaMP6s. Z-bölümler için belirli bir görüntüleme derinliği gerekli olduğunda, birkaç z-bölümü görüntü pozlama zaman ve çerçeve aralıkları bağlı olarak elde edilebilir. Kamera yeterli Uzaysal Çözünürlük varsa, çekim hızı azaltmak için binning büyüklüğü (kasalar bir dijital piksel binned yonga üzerinde sayısı) artırılmalıdır.
4. Bir kez görüntü parametreleri belirlenir, peptid yönetim temel sinyal yoğunluklarda (F₀) tespit etmek için önce 1 dk. için görüntüleri almak.
5. Test peptid uygulanır; Bunun için 100 µL PBS peptid çözümün dağıtılması ve en iyi bir konsantrasyon vermeye larva banyo hemen içine pipette.
   Not: Yavaş yavaş peptid çözüm enjekte (Örneğin, akış hızı 20 µL/s) içine bir pipet kullanarak banyo çözüm. PBS içinde çözünmüş ilgisiz sentetik peptid bir negatif kontrol kullanılır.
6. Kayıt GCaMP6s emisyon birkaç dakika için.

3. veri analizi

Not: Görüntüleme verileri çevrimdışı ImageJ ile analiz edilir. Hızlandırılmış görüntüleme sırasında taşımak larva beyin pipetting neden olur. Bu nedenle, seri görüntülerin pozisyonel aberasyonları analiz daha önce düzeltilmelidir. Düzeltme gibi bir ImageJ eklenti, TurboReg kullanarak gerçekleştirilebilir.

1. Analiz yazılımı açın ve ilk kare (peptid uygulamadan önce) referans görüntü olarak kullanın.
2. Eklentileri seçin | Kayıt | TurboReg.
3. Seri resim dosyasının kaynak ve hedefolarak başvuru yansıması seçin.
4. Katı vücut (paralel deplasman ve görüntülerin rotasyon) ve ("Hızlı" Bunun yerine hızlı analiz kaba) doğru işleme yöntemi ve kalite için sırasıyla kontrol edin.
5. Toplu görüntü işleme başlamak için tıklatın.
6. Analiz kullanarak ilgi (ROIs) birden fazla bölgesini seçin | Araçlar | ROI Yöneticisi ImageJ içinde.
7. Piksel yoğunluğu daha tıklatarak ölçmek | Multi ölçü | Tamam ROI Yöneticisi penceresinde.
8. ΔF/F₀ hesaplamak = (F - F₀) nereye F yatırım getirisi şiddeti uyarıcı anda ise F₀ belirli bir deneysel olayından hemen önce bir zaman penceresi yoğunlukta /F₀, (Örneğin, 30 kare önceki uyarıcı başlangıçlı).
9. Birden fazla beyin örnekleri kullanarak, ortalama ve standart hata, her zaman bir noktada ortalamaya (SEM) elde etmek için istatistiksel işleme iletken denemeyi tekrarlamak.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralını kullanan, beyin insülin üreten hücreleri (IPCs) tarafından peptid hormon, CCHa2, aktivasyonu incelenmiştir. IPCs vahşi-türü beyin GCaMP6s ile etiketli dilp2 -GAL4¹² (Dr. Rulifson hediyesi) ve UAS-GCaMP6s¹³ (Dr. Kim hediyesi) bir birleşimini kullanarak. Larva beyin explants sentetik bir CCHa2 peptid ile tedavi edildi ve floresan GCaMP6s üzerinden gerçek zamanlı olarak kaydedildi. Bu deneyd...

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntemi Imaging Ca^{2 +} işlev hormonların beyinde sınamak için kullanışlı bir sistem olduğunu. İçinde vivo, beyin hormon çeşitli endokrin organ alır. Buna ek olarak, beyin sürekli artan spontan nöronal etkinleştirme Nedenleri duyusal bilgileri algılar. Bu ex vivo sistem böyle gürültü ortadan kaldırır ve in vivo görüntüleme daha daha iyi bir sinyal/noise oranı verir. Bu sistemde moleküllerin tek başına veya birlikte test edilebilir. Pept...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/