Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para a ex vivo cálcio imagem latente do cérebro drosófila . Neste método, compostos naturais ou sintéticos podem ser aplicados para o buffer para testar sua capacidade de ativar neurônios particulares do cérebro.

Resumo

Órgão-órgão-a comunicação por sinalização endócrina, por exemplo, da periferia para o cérebro, é essencial para manter a homeostase. Como um animal de modelo para a investigação do sistema endócrino, Drosophila melanogaster, que tem sofisticadas ferramentas genéticas e informação do genoma, está sendo usado cada vez mais. Este artigo descreve um método para o tratamento de imagens de cálcio de explantes de cérebro de Drosophila . Esse método permite a detecção da sinalização direta de um hormônio no cérebro. É sabido que muitos Hormônios peptídicos agem através de receptores G-proteína-acoplados (GPCRs), cuja ativação causa um aumento na concentração Ca^{2 +}intracelular. Ativação neural também eleva intracelular Ca^{2 +} níveis, do influxo de Ca^{2 +} e a liberação de Ca^{2 +} armazenados no retículo endoplasmático (ER). Um sensor de cálcio, GCaMP, pode monitorar essas mudanças de Ca^{2 +} . Neste método, o GCaMP é expresso nos neurônios de interesse, e o cérebro larval GCaMP-expressando é dissecado e culta ex vivo. O teste de peptídeo é então aplicado ao explante cérebro, e as alterações fluorescentes em GCaMP são detectadas usando um microscópio confocal de fiação disco equipado com uma câmera CCD. Usando este método, qualquer molécula solúvel em água pode ser testada, e diversos eventos celulares associados a ativação neural podem ser fotografados usando os indicadores fluorescentes apropriados. Além disso, modificando a imagem da câmara, este método pode ser usado para a imagem de outros órgãos de drosófila ou os órgãos de outros animais.

Introdução

Órgão-órgão-a comunicação é uma estratégia evolutivamente conservada para manter a homeostase para lidar com as mudanças ambientais. Em humanos, uma variedade de arereleased de hormônios das glândulas endócrinas na circulação. Muitos desses hormônios como alvo o hipotálamo do cérebro, que regula os processos metabólicos e comportamentos fundamentais tais como alimentação^1,2. Muitos hormônios foram descobertos usando modelos de mamíferos. No entanto, os mecanismos de sua ação, especialmente as redes interorgan, em que participem, permanecem em grande parte obscuro.

Drosophila melanogaster emergiu como um modelo útil para estudar órgão-para-órgão comunicação. Em insetos, muitos processos fisiológicos são controlados pelos hormônios. Primeiros estudos centrada no crescimento e metamorfose usado grandes insetos. Nesses estudos, a remoção ou transplante de órgãos específicos previu a existência de moléculas sinalizadoras órgãos inter; mais tarde, hormônio juvenil (JH), hormônio Prothoracicotropic (PTTH) e isoinokosterone foram bioquimicamente purificada^3,4,5. Uma grande família de peptídeos de sinalização intercelulares é pensada para ser envolvido em vários eventos fisiológicos durante o ciclo de vida de inseto^6,7. A maioria destes peptídeos atuam sobre G-receptores (GPCRs), embora os GPCRs específicos foram inicialmente difícil identificar abordagens convencionais. A publicação do genoma de Drosophila sequência⁸ foi a descoberta que permitiu a identificação de peptídeos bioativos de Drosophila baseada sua homologia aos encontrados em outros insetos. Além disso, identificaram-se os receptores para vários péptidos de GPCRs previstos no genoma usando ensaios de ligação GPCR-ligante cell-cultura-based. Em seguida, as análises de expressão previram os caminhos de órgão-para-órgão eliciados estes peptídeos e receptores. Notavelmente, muitos dos receptores de peptídeos putativos são expressos no cérebro, sugerindo que o cérebro é um alvo principal do peptídeo hormônios⁹. Além disso, as ferramentas avançadas de genéticas em Drosophila têm contribuído para a identificação de funções fisiológicas das combinações de peptídeo-GPCR. Por exemplo, a GAL4 e LexA-baseado sistemas binários transcriptional permitem knockdown do gene ou superexpressão de forma controlada espacial e temporalmente. GAL4, um fator de transcrição identificado no fermento, vincula-se a uma sequência de cis-regulamentação específica denominada sequência de ativação Upstream (UAS). No sistema GAL4/UAS, linha excitador fornece tecido-específica ou expressão de GAL4 estágio específico e a linha de respondente carrega UAS montante do gene de interesse ou a construção, a expressão de shRNA de unidade. LexA/LexAop sistema é baseado em um mecanismo semelhante. Análise fenotípica de animais de GPCR-nocaute de peptídeo-knockdown e tecido-específica de tecido-específica pode revelar informações sobre modo do peptídeo-GPCR sinalização e local de ação. No entanto, as conclusões que podem ser alcançadas apenas por dados genéticos são limitadas. Por outro lado, uma vez que o alvo putativo de um hormônio peptídeo específico é reduzido a um tipo de tecido ou célula, cálcio ex vivo de imagem em explantes de órgão pode ser usado para elucidar a órgão-para-órgão comunicação mediada por sinalização de peptídeo-GPCR. Após a ativação de um GPCR Gq-acoplado, a concentração intracelular de Ca^{2 +} é aumentada devido à liberação de Ca^{2 +} do ER¹⁰. No cérebro, ativação neural também eleva os níveis intracelulares de Ca^{2 +} . Tais aumentos de Ca^{2 +} podem ser detectados por um sensor de cálcio, GCaMP, que sofre mudanças conformacionais na presença de Ca^{2 +} resultando em emissão de fluorescência¹¹.

Neste artigo, é descrito um método de imagem usando o cérebro de Drosophila explants de cálcio. Para testar a capacidade de um peptídeo para ativar os neurônios específicos, um peptídeo de teste é aplicado para o explante cérebro GCaMP-expressando, e mudanças de fluorescência são monitoradas pela microscopia confocal. O envolvimento do GPCR é então confirmado, realizando o mesmo ensaio usando um cérebro mutante falta GPCR. Esta combinação de genética e de imagem fornece informações precisas sobre o órgão-para-órgão de comunicação por peptídeos-GPCRs. possíveis modificações e aplicações do presente protocolo são também discutidas.

Protocolo

1. preparação do cérebro Larval explantes

1. Fazer uma câmara de imagens.
   Nota: A gravação estável requer que os explantes de cérebro estar amarrados. Aqui, uma câmara de imagem de baixo custo, feito à mão é usada no Ca^{2 +} sistema de imagem.
   1. Usando fórceps, arranhe o fundo centro de um prato de cultura plástico (35 x 10 mm) para criar um dente para o gânglio ventral do cérebro larval tornando a montagem mais fácil (etapa 1.3, Figura 1).
   2. Com um palito de dente, coloque uma pequena gota de cola em ambos os lados do dent e anexar uma vareta de tungstênio (0,125 mm de diâmetro, 6 a 7 mm de comprimento) para a colagem.
   3. Usando um pequeno pedaço de massa-como adesivo reutilizável, fazer uma parede circular (10 mm de diâmetro e 3 mm de altura) ao redor do dente (Figura 1).
      Nota: O espaço dentro da parede será posteriormente preenchido com solução salina tamponada fosfato (PBS; 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M PO₄^-3, pH 7,4 ± 0,05 a 25 ° C).
2. Preparação de animais
   Nota: Para a imagem latente de cálcio, um indicador de cálcio, GCaMP6s, é expressa no tipo de célula de interesse, que é comumente alcançado usando combinações de tecido-específica GAL4 e UAS-GCaMP6s. Para garantir que o sinal é mediado pelo receptor de candidato, GCaMP6s também é expresso em um mutante com defeito no receptor.
   1. Quando comparações experimentais para genótipos diferentes tais como o tipo selvagem e mutantes são necessárias, larvas de teste de partida de idade para evitar GCaMP6 expressão nível de variações e diferenças fisiológicas devido aos estádios de desenvolvimento.
   2. Espantar moscas parentais (30 moscas para cada sexo) em um frasco de cultura contendo o padrão alimentar voar para 8 h permitir que a postura de ovos na superfície do alimento. Larvas de cultura de massa, sob um ciclo claro-escuro de 12-h em 25 ° C e 60-70% de umidade relativa.
3. Dissecação do cérebro larval
   1. A 90-120 h após (AEL) de postura de ovos, coletar larvas e lavá-los pelo menos 3 vezes com água destilada para remover os resíduos de comida aderentes.
   2. Lugar uma larva em um vidro de relógio quadrado 1,5 polegadas cheio de gelo frio PBS.
      Nota: Nas duas próximas etapas são realizadas neste vidro de relógio sob o microscópio de dissecação.
   3. Use pinças para agarrar delicadamente o parte do meio da larva. Use outra pinça para agarrar os ganchos da boca e puxar os ganchos de boca suavemente para separar a parte anterior da larva que contém o cérebro do resto do corpo.
      Nota: Como alternativa, uma tesoura cirúrgica pode ser usada.
   4. Segure a ponta anterior por fórceps e virar do avesso a larva. Remova tecido externos conectado ao cérebro, como discos imaginária, corpos de gordura e glândula de anel. Suavemente separa o aparelho bucal do cérebro.
   5. Aplicam-se 200 µ l de PBS no interior do anel feito de massa de vidraceiro, como adesivo reutilizável na câmara de imagens. Chupar suavemente o cérebro dissecado com PBS para uma pipeta Pasteur e então transferi-lo para a câmara de imagem.
4. Configuração do cérebro para a câmara de imagem
   1. Use a pinça para pegar fibras musculares, estendendo-se desde os gânglios ventrais. O cérebro suavemente Insira o dente debaixo do fio de tungstênio.
   2. Usando outra pinça, puxe o fio de tungstênio ligeiramente até colocar o cérebro na posição correta para a imagem (Figura 1).

2. aquisição de imagens de fluorescência do Ca^{2 +}

Nota: Explantes cérebro imergidos em PBS são fotografadas usando um microscópio de fluorescência, equipado com uma lente objetiva de imersão de água de 20x (N.A. = 0,5). PBS não ativa as células do cérebro. Se forem necessárias imagens do eixo z, a lente objetiva é montada com um motor de lente piezoelétrico ativado. Uma cabeça confocal de disco giratório é usada para aumentar o tempo de resolução. Para a imagem latente de pouca luz, um elétron multiplicando o dispositivo de carga acoplada câmera é montado no microscópio. A imagem latente de fluorescência GCaMP6s (excitação/emissão: 488/509 nm) requer um laser de 488 nm para a excitação com um divisor de feixe dicroicas e um filtro de emissão (ex., 528 filtro de passa-banda de banda ± 38 nm).

1. Coloque a câmara de imagem que contém o cérebro explante sob o microscópio.
2. Baixe a lente objetiva até que toca a PBS. Sob a iluminação de campo claro, posicione o cérebro e trazê-lo em foco. Interruptor de luz fluorescente e ajustar o foco sobre as células GCaMP6s-rotulados.
   Nota: A fluorescência verde basal do GCaMP6s deve ser visível.
3. Iniciar a aquisição de 250 ms/moldura em uma resolução de 512 × 512 pixels no modo Water-cooled, usando o software de aquisição apropriado (ex., µManager). Ajuste o tempo de exposição para obter valores de fluorescência dentro do intervalo dinâmico da câmera CCD, mas não inferior a 1000 (unidades arbitrárias), com imagens de 16 bits (0-65.535 de gama dinâmica).
   Nota: Um tempo de exposição baixo deve ser usado para minimizar a foto-branqueamento do GCaMP6s. Tempo de exposição deve ser otimizado em cada experimento, pois depende dos níveis de expressão de GCaMP6 e a sensibilidade do sistema de detecção. Foi a 100 ms em nosso experimento usando dilp2 > GCaMP6s. Quando z-seções são necessárias para uma determinada profundidade de imagem, várias imagens de z-seção podem ser adquiridas dependendo os intervalos de tempo e quadro de exposição. Se a câmera tem suficiente resolução espacial, o tamanho binning (número de registros no chip que vai ser guardado em um pixel digital) deve ser aumentado para reduzir o tempo de exposição.
4. Uma vez que os parâmetros de imagem são determinados, com imagens para 1 min antes da administração de peptídeo para detectar intensidades de sinal de linha de base (F₀).
5. Aplicar o teste de peptídeo; para isso, dissolver 100 µ l de solução de peptídeo em PBS e pipetar isso diretamente para o banho larval para produzir uma concentração ideal.
   Nota: A solução de peptídeo deve ser injetada lentamente (por exemplo, fluxo taxa 20 µ l/s) para a solução de banho com uma pipeta. Independente peptídeo sintético dissolvido em PBS é usado como um controle negativo.
6. Registro da emissão de GCaMP6s por alguns minutos.

3. análise de dados

Nota: Dados de imagem são analisados off-line com o ImageJ. Durante a lapso de tempo de imagem, pipetagem faz com que o cérebro larval mover. Portanto, aberrações posicionais das imagens seriais devem ser corrigidas antes da análise. A correção pode ser realizada usando um ImageJ plug-in, TurboReg da seguinte maneira.

1. Abra o software de análise e usar o primeiro quadro (antes da aplicação do peptide) como uma imagem de referência.
2. Selecione Plugins | Registo | TurboReg.
3. Escolha o arquivo de imagem serial como a fonte e a imagem de referência como o alvo.
4. Verifique Corpo rígido (paralelo deslocamento e rotação de imagens) e precisos ("Rápido" é grosseiro mas rápida análise em vez disso) para o método de processamento e qualidade, respectivamente.
5. Clique em lotes para iniciar o processamento de imagem.
6. Selecione várias regiões de interesse (ROIs) usando Analyze | Ferramentas | Gerente de ROI no ImageJ.
7. Medir a intensidade do pixel clicando mais | Medida de multi | Okey na janela Gerenciador de ROI.
8. Calcular ΔF/F₀ = (F - F₀) f₀, onde F é a intensidade ROI no momento do estímulo, e F₀ é a intensidade em uma janela de tempo imediatamente antes de um evento experimental particular (por exemplo, 30 frames precedendo o aparecimento de estímulo).
9. Repita a experiência usando várias amostras de cérebro, realizando o tratamento estatístico para obter a média e o erro padrão da média (SEM) em cada ponto de tempo.

Resultados

Usando este protocolo, a ativação do cérebro células produtoras de insulina (IPCs) pelo hormônio peptídeo, CCHa2, foi examinada. IPCs do selvagem-tipo cérebro foram rotulados com GCaMP6s usando uma combinação de dilp2 -GAL4¹² (um presente do Dr. Rulifson) e UAS-GCaMP6s¹³ (um presente do Dr. Kim). Larval cérebro explantes foram tratados com um peptídeo sintético de CCHa2, e a fluorescência de GCaMP6s foi gravada...

Discussão

O Ca^{2 +} imagem método descrito aqui é um sistema útil para testar o funcionamento dos hormônios no cérebro. In vivo, o cérebro recebe hormônios de vários órgãos do sistema endócrino. Além disso, o cérebro constantemente vê crescente de informações sensoriais, que provoca a ativação neuronal espontânea. Este sistema ex vivo elimina tal ruído e produz uma relação sinal/ruído melhor do que na vivo de imagem. Neste sistema, as moléculas podem ser testadas isoladam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/