Calorespirometry: 一种功能强大、无创的研究细胞能量代谢的方法

摘要

该协议描述 calorespirometry, 直接和同时测量散热和呼吸, 这提供了一种无创的方法来评估能量代谢。该技术用于通过监测总的细胞能量流来评估有氧和厌氧途径对能源利用的贡献。

摘要

在基本生物和生物医学研究中使用的许多细胞系通过有氧和厌氧呼吸的结合来维持能量平衡。然而, 这两种途径在多大程度上促进了细胞能源生产的前景一直被忽视。在饱和葡萄糖中培养的转化细胞往往会减少对 ATP 生产的氧化磷酸化的依赖性, 这是由于基质层磷酸化的增加而得到补偿的。这种新陈代谢平衡的转变允许细胞增殖, 尽管存在线粒体毒素。在忽视转化细胞的新陈代谢平衡时, 药物筛选的结果可能会被误解, 因为在高葡萄糖存在下培养的模型细胞株可能无法检测到潜在的 mitotoxic 效应。浓度。该协议描述了两种强大的技术, respirometry 和量热, 这使得对细胞 ATP 生产的有氧和厌氧贡献的定量和无创评估。有氧和厌氧呼吸产生热量, 可以监测通过量热。同时, 测定氧耗率可以评估有氧呼吸的程度。当同时测量散热和耗氧量时, 可以确定 calorespirometric 比。实验得到的值可以与理论 oxycaloric 等效, 可判断厌氧呼吸的程度。因此, calorespirometry 提供了一种独特的方法来分析广泛的生物学问题, 包括药物的发展, 微生物的生长, 和基本生物能学在常氧和缺氧条件下。

引言

在生物系统中, 新陈代谢过程中的热释放或焓变化通常直接通过 O ₂消耗量和/或 CO₂ (通过 respirometry) 来监测。不幸的是, 当这些技术被隔离使用时, 关键信息就会丢失, 例如厌氧途径对细胞代谢的贡献。Calorespirometry 是一种强大的技术, 依赖于同时测量散热和呼吸。开创性的 calorespirometric 工作研究了完全氧合哺乳动物细胞的厌氧代谢, 并证明了有氧和厌氧途径同时贡献能量动态平衡, 尽管转化的细胞在完全氧合环境¹。Calorespirometry 已经被应用到各种各样的生物学问题上。一些例子包括研究低氧水平的动物热力学, 除草剂和雌激素对双壳贝类鳃的影响, 陆地有机体的新陈代谢, 以及有机土壤物质的微生物分解^2,3,4,5,6. 此外, calorespirometry 还揭示了冷冻前的代谢预处理改善了哺乳动物细胞的冷冻保存⁷。每种方法, 无论是量热和 respirometry, 都独立增加了我们对细胞和生物体生物能学的认识。然而, 可以通过使用 calorespirometry 来回答的基本生物学问题仍然是相对未探索的。

赫斯定律指出, 反应的总焓变化与初始和最终状态之间的通路无关。例如, 生化通路的总焓变化是通路内所有反应焓的变化总和。量热法提供了一种测量细胞热量的实时方法, 它不加区别地检测有氧和厌氧通路。这是基于没有在系统中交换能量的基础, 除非通过实验安瓿⁸的墙壁。散热的变化等于安瓿中所有代谢反应释放出的焓的变化。因此, 负焓与系统的热量损失相关。在过去四年里, 详尽的研究描绘了分解代谢和代谢的热力学景观。这是由美国国立医学图书馆 (NLM) 在国家卫生研究院 (PubMed) 索引的 "生物" 和 "量热" 搜索词下的研究文章的稳步增加所代表的。搜索结果显示, 在1970之前, 共有27份出版物参考生物量热仪;与此同时, 仅在 2016年, 就有546份出版物利用了这项技术。

热方法的建立, 以确定热生产。但是, 对于解决 respirometric 值, 还是给予了更大的灵活性。respirometric 度量可以由 o₂、CO₂或 o₂和 co₂组成。此外, O₂或 CO₂的测量可以通过各种技术完成, 其中包括 optrodes、克拉克型电极和可调谐二极管激光吸收光谱^{7、9、10 ,11}。虽然 CO₂生产在许多 respirometric 研究中是一个有价值的指标, 但培养细胞的培养基通常利用 bicarbonic 缓冲系统来控制 pH 值¹²¹³。为避免在碳酸氢钠系统中 CO₂测量的并发症, 以下用于区域性单元格 calorespirometry 的协议利用 O₂作为唯一 respirometric 参数。

在测量氧通量的同时, 某些 respirometers (参见材料表) 是为了详细评估线粒体功能而设计的。衬底-uncoupler 抑制剂-滴定 (套装) 协议是很好的建立和兼容的实验设计, 以测量膜电位或活性氧 (ROS) 形成¹⁴。所提出的完整细胞 calorespirometry 协议与化学 uncouplers 的引入相兼容, 如羰基氰化物-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) 和 f₀f₁-ATP 合成酶抑制剂寡霉素。通过添加 FCCP, 氧消耗可以从 ATP 生产中拆解, 这有助于评估潜在疗法对线粒体绩效¹⁵的影响。此外, 寡霉素的添加也照亮了泄漏呼吸的程度。因此, 在 calorespirometry 期间进行的 respirometric 测量与广泛的协议兼容, 旨在进一步阐明线粒体生理学。

同时测量散热和氧通量可以计算 calorespirometric (CR) 比。这个比率然后被比较对桑顿的恒定或理论 oxycaloric 等值, 范围在-430 到-480 焦摩尔^-1之间根据细胞线或组织利益和被补充的碳基体^{1, 16}. 因此, 一个更负的 CR 比率揭示了从厌氧途径到整体新陈代谢活动的贡献增加。例如, 常规肌肉组织呼吸的 CR 比率没有工作的活动性能范围从-448 到-468 焦 mol-1, 这是在理论 oxycaloric 等效^17,18的范围内。同时, 在高葡萄糖的培养基中培养的哺乳动物癌细胞, 在糖酵解和相对低线粒体接触¹⁹的情况下增强了乳酸发酵。这种表型结果在-490 至-800 焦摩尔^-1范围内的 CR 比值, 显示了更多的负 CR 比值^1,7, 在细胞代谢中的厌氧通路的增加参与, ^16,20。

商业和非营利细胞和组织分销商目前提供150多个物种的细胞线, 近4000个细胞系来源于人类。永生化细胞系是快速评估潜在疗法毒性的方便工具, 其中许多可能直接或间接干扰线粒体功能。在药物筛选过程中使用转换后的细胞可能具有有限的预测价值, 部分原因是因为华宝效应是许多癌症的标志。通常, 癌症产生 ATP 从基质层磷酸化和保持氧化还原平衡, 通过生产乳酸, 而不充分参与线粒体下有氧条件下¹⁹。制药业的发展是众所周知的昂贵和低效的, 约8的9化合物测试在人体临床试验未能达到市场批准²¹。虽然潜在的治疗可能通过初步筛选由于细胞株的细胞毒性低, 有可能这些化合物中的一些 mitotoxic。如果没有一个合适的方法来检测这些毒素如何损害不显示华宝效应的初级细胞的能量平衡, 关键信息往往是过度观察, 瓶颈治疗发展的早期阶段。

Calorespirometry 是一种实用的、无创的方法来分析各种生物样品中的代谢活动, 包括细胞和组织。所提出的协议的核心与一系列应用程序兼容。然而, 已经发现了一个并发症。永生化细胞通常培养在无葡萄糖培养基中补充半乳糖, 以增加氧化磷酸 (OXPHOS) 对能源生产的贡献, 以便使细胞敏感到潜在的 mitotoxins^{22, 23}。当样品放在热量计¹⁵使用的不锈钢安瓿中时, 这种代谢重新编程似乎不清楚分析。在葡萄糖培养基中培养的细胞继续从事高代谢活动几个小时。同时, 在半乳糖培养基中培养的细胞在安瓿的30分钟内减少了热量的产生, 使测量仅限于早期实验时间点。不幸的是, 这种行为阻碍了评估细胞增殖的机会。尽管有这一特定限制, 大多数应用都与 calorespirometric 分析兼容, 并且可以通过这种方法获得详细的代谢信息。

研究方案

1. 细胞培养

1. 维持人肝癌 (HepG2) 细胞在 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 含有10% 胎牛血清 (血清) 和附加基质 (10 毫米葡萄糖, 2 毫米谷氨酰胺, 1 毫米丙酮酸盐) 在37°c 在细胞培养孵化器 (5% CO₂, 95% 空气, 100% 湿度)。
   注: 在 respirometry 和量热仪的后续步骤中引用 DMEM 时, 请使用上述 DMEM 公式。
2. 将单元格在 1 x 10⁶细胞每100毫米培养板上, 每7天或在到达90% 融合之前, 每 3-4 天更新培养基。
3. 在细胞 60-80% 汇合时进行实验。

2. 呼吸和热量计的制备

1. 吸管2.2 毫升的 DMEM 进入呼吸室, 充分插入塞子, 并调整与塞子间隔工具, 以使最佳的氧气扩散从空气到介质。
2. 连续搅拌37摄氏度, 直至氧浓度 (蓝迹) 和氧通量 (红迹) 稳定。确保呼吸的软件被编程来解释实验中所用介质的氧溶解度。
   注: 不同介质有不同的氧溶解度系数 (例如, DMEM = 0.92)。
3. 在 DMEM 氧浓度稳定后, 用燃烧室打开, 选择氧浓度跟踪的稳定部分, 并校准100% 空气饱和度。
4. 校准0% 氧气选择稳定部分的氧气浓度的痕迹时, 没有氧气存在的房间。执行此步骤后, 20 µL 滴定230毫米硫酸钠钠或在所有氧气消耗的生物样品在实验结束。
5. 在100% 的空气校准呼吸, 关闭塞子, 并确保没有气泡出现在会议厅内。
   注: 当极谱氧传感器 (POS) 消耗氧气以测量氧分压时, 密闭腔内的氧通量会轻微增加。
6. 在10分钟的塞子被关闭, 确认呼吸是准备 HepG2 细胞通过观察稳定的氧气流量。
   注: 这里使用的热量计采用不锈钢安瓿, 需要一个安瓿作为参考。
7. 将2.5 毫升的 H₂o (dH₂o) [相等体积作为样本 (步骤 4)] 添加到热量计的参考安瓿并拧紧瓶盖, 如有必要, 使用钳子。清洁密封安瓿与气流, 并慢慢降低安瓿到位置1在参考通道的热量计。保持在位置1直到生物样品准备好。

3. Respirometry 和量热法制备 HepG2 细胞

1. 确认呼吸和热量计的制备和校准。温暖的 DMEM 和胰蛋白酶到37°c 在水浴。
2. 添加 DMEM 到一个新鲜的100毫米板和放置在孵化器, 以允许平衡的媒介为 CO₂和温度。
   注: 此介质将用于量热实验, 因此适当的体积取决于将使用的安瓿的数量。
3. 用倒置光显微镜确认细胞在 60-80% 汇合处, 然后用10毫升室温磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤100毫米板2x。
4. 添加3毫升的37°c 胰蛋白酶到100毫米细胞和孵化他们为 7-10 分钟在37°c 在细胞培养孵化器。将胰蛋白酶与3毫升的37°c DMEM 中和, 通过轻轻吹打20倍于5毫升吸管。
5. 将 DMEM 和胰蛋白酶中的6毫升悬浮细胞转移到无菌的15毫升圆锥管中, 在 175 x g 处将其离心为5分钟. 取出液体而不干扰细胞颗粒。
6. 并用重悬细胞颗粒在 ~ 5 毫升的 DMEM 和吸管它彻底地确保细胞彼此充分分离。
7. 删除100µL 的混合样本, 并使用 hemocytometer 上的所有8个字段进行彻底的单元格计数, 以确定单元格的总数。然后计算单元格泥沙的音量, 以便每50µL 生成 ~ 2 x 10⁶单元格。
   注意: 这将确保将 2 x 10⁶单元格添加到呼吸的每个分室中, 且介质位移最小。
8. 将细胞离心5分钟, 在 175 x g 并用重悬从步骤3.7 中计算出的 DMEM 量中的颗粒。
9. 执行单元格计数以确定在呼吸中每室注入 2 x 10⁶单元格所需的卷 (这应该是 ~ 50 µL)。储存在冰上的 respirometric 测量的细胞, 直到准备就绪。
10. 当浓缩的细胞样品在冰上时, 确定稀释量为 1 x 10⁵细胞/毫升的热量。
11. 将样本进行混合, 并在每个安瓿的 DMEM 中为 1 x 10⁵细胞/毫升准备3毫升的细胞。
    注: 样品稀释用的 DMEM 应为步骤3.3 中制备的平衡培养基。

4. 量热法

1. 确保热量计与计算机连接, µW 中的热信号是可观测和稳定的。
2. 将2.5 毫升的细胞在 1 x 10⁵细胞/mL (~ 2.5 x 10⁵细胞) 中添加到每个安瓿, 确保足够的空气在安瓿和介质的盖子之间, 以允许气体扩散。
3. 立即拧紧瓶盖, 必要时使用钳子。清洁密封安瓿, 使用气流去除任何外部碎片, 并慢慢降低安瓿的位置1的热量计。记录安瓿降低到位置1的时间。
4. 允许安瓿在位置1处坐15分钟。
   注意: 在这15分钟期间, 细胞将被注射入呼吸 (步骤 5)。这确保在确定 CR 比时, 同样的时间间隔用于热量生产和氧气消耗。
5. 15分钟在位置 1, 慢慢地降低参考和样品安瓿到位置2。记录安瓿降低的时间, 并测量至少30分钟。

5. Respirometry

1. 在15分钟间隔内, 安瓿在热量计中的位置 1, 开始 respirometric 研究。
2. 通过吹打彻底混合细胞样本, 以确保一个均匀的溶液, 并注入 < 50 µL 细胞样本到呼吸的每个腔内, 最终浓度为 ~ 2 x 10⁶细胞/室。记录单元格注入呼吸的时间。
3. 注射后, HepG2 细胞连续搅拌37摄氏度。至少等待 20-30 分钟的氧气流量稳定和氧浓度的稳定下降。
4. 选中屏幕右侧的O₂每 V 的通量选项卡, 并突出显示氧气流量的稳定部分。选择标记, 然后统计和记录 O₂通量 (每 v) 的数据。此记录将用于计算 CR 比率。
   注意: 步骤5.5 和5.6 是可选的。寡霉素和 FCCP 的滴定揭示了漏呼吸和最大不耦合呼吸的情况。
5. 注入1µL 4 毫克/毫升寡霉素到每个房间, 并允许〜10分钟的氧气流量稳定。通过以下步骤记录稳定的漏呼吸率5.4 通过突出一个稳定部分的氧气流量的痕迹后寡霉素添加。
6. 滴定 2-µL 注射0.2 毫米 FCCP 进入每个室, 允许氧通量稳定后每次注射。继续滴定直到达到最大通量, 如随后的 FCCP 滴定略有下降所示。在最大通量期间记录稳定的呼吸速率。

6. Calorespirometric 比的计算

1. 对使用 hemocytometer 的所有8个字段的 1 x 10⁵单元格/mL 中准备的样本进行最终单元格计数, 以确定添加到安瓿 (2.5 mL) 中的单元格总数。
2. 确定一个时间来记录测量, 从热量计和呼吸, 稳定的信号在同一时间存在。参考当安瓿被降低到位置2和注入细胞进入呼吸时记录的时间。
3. 通过将光标放在显示热量输出的迹线上, 在步骤确定的时间和表达为µW/百万细胞时, 记录热生产。收集氧气消耗数据, 并确保它被表示为 pmol O₂ x s^-1 x 万元单元格。
4. 要计算 CR 比率, 首先将µW 转换为焦/秒, 然后除以 O₂/秒的摩尔上的焦/秒, 以获取表示为焦/摩尔 O₂的 CR 比率。注意: CR 比率在焦/摩尔 O₂中显示。
   (请参见辅助文件 1)

结果

calorespirometric 测量的重现性取决于适当和一致的样品准备。如果板块生长过度, 细胞培养所制备的样品不应使用, 因为细胞计数可能由于结块而变得不准确。此外, 由于在丛生细胞中的基底扩散有限, 可能会发生热量流动减少。因此, 在使用粘附细胞时, 选择一个融合在 60-80% 之间的板并在实验之前改变中等 24 h 是至关重要的。

适当的仪器校准和维护对于信息和可重现的 calorespiro...

讨论

calorespirometry 的目的是定量评价有氧和厌氧途径对代谢活动的贡献, 并获得细胞能量通量的综合观点。这是通过同时测量散热和氧通量, 然后用计算的 CR 比与理论 oxycaloric 当量的比较来完成的。对于可重现和可靠的数据, 必须考虑几个关键步骤。维持一种无菌、健康的细胞培养是至关重要的。细菌或真菌污染可能导致被挪用的热量生产或氧气消耗量, 使 CR 比率没有意义。此外, 细胞计数不当, 样本混...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium