Calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사

요약

이 프로토콜 calorespirometry, 방열 및 에너지 대사를 평가 하는 비 침범 성 접근을 제공 하는 호흡의 직접 및 동시 측정에 설명 합니다. 이 기술은 총 세포 에너지 흐름을 모니터링 하 여 호 기성 및 혐 기성 경로 에너지 사용률에의 기여를 평가 하는 데 사용 됩니다.

초록

기본적인 생물 학적 및 생물 의학 연구에 사용 하는 많은 세포 선 둘 다 호 기성 및 혐 기성 호흡의 결합을 통해 에너지 항상성을 유지 합니다. 그러나,는 두 경로 세포 에너지 생산의 풍경에 기여 하는 정도 지속적으로 간과. 변형 된 세포 포도 당 레벨을 자주 포화에 교양 산화 인 산화 기질 수준 인 산화의 증가 의해 보상 된다 ATP 생산에 감소 종속성을 표시 합니다. 대사 균형에 있는이 교대는 미토 콘 드 리아 독 소의 존재에도 불구 하 고 증식 하는 세포 수 있습니다. 변환 된 셀의 변경 된 대사 균형, 무시에 제약 심사 결과 이후는 잘못 해석 될 수 있는 잠재적으로 mitotoxic 효과 수 있습니다 감지 되지 않을 높은 포도 당 존재 교양된 모델 셀 라인을 사용 하 여 농도입니다. 이 프로토콜은 두 개의 강력한 기술, respirometry 및 세포질 ATP 생산을 둘 다 호 기성 및 혐 기성 공헌의 양적 및 비 침 투 적인 평가 대 한 허용 하는 열 량의 페어링 설명 합니다. 호 기성 및 혐 기성 호흡 모니터링 을 통해 주사 될 수 있는 열을 생성 합니다. 한편, 산소 소비 속도 측정 하는 것은 호 기성 호흡의 정도 평가할 수 있습니다. 열 소비, 산소 소비와 동시에 측정은 때 calorespirometric 비율을 확인할 수 있습니다. 실험적으로 얻은 값 상응 이론 oxycaloric에 비해 다음 수 그리고 혐 기성 호흡의 정도 재판 될 수 있다. 따라서, calorespirometry 다양 한 약물 개발, 미생물 성장, 및 normoxic 및 hypoxic 조건 모두에서 기본적인 생체를 포함 하 여 생물학 질문을 분석 하는 독특한 방법을 제공 합니다.

서문

생물 학적 시스템, 물질 대사 도중 열 릴리스 또는 엔 탈피 변화는 일반적으로 중 하나를 직접 모니터링 (통해 직접 열 량) 또는 O₂ 소비 및 CO₂ 생산 (respirometry)를 통해 통해 간접적으로. 불행히도,이 기술은 격리에 사용 되는 경우 중요 한 정보 혐 기성 경로 세포질 물질 대사에의 기여 등 손실 됩니다. Calorespirometry 열 분산 및 호흡의 동시 측정에 의존 하는 강력한 기술입니다. 완전히 산소 포유류 세포에 있는 혐 기성 물질 대사를 조사 하 고 호 기성 및 혐 기성 경로 변형된 세포에도 불구 하 고 에너지 항상성의 동시 기여 시연 calorespirometric 작업을 개척 한 완전히 산소 환경¹. Calorespirometry 이후 다양 한 생물학 질문에 적용 되었습니다. 몇 가지 예로 동물 너 지론 낮은 산소 수준에서의 연구, bivalves, 지구 생물의 물질 대사 그리고 유기 토양 문제^2, 의 미생물 분해의 아가미에 제 초 제와 에스트로겐의 효과 ^{3 , 4 , 5 , 6}. 또한, calorespirometry는⁷세포 동결 전에 계시 어떻게 대사 늘어진 포유류의 cryopreservation 향상. 각 접근, 열 량 및 respirometry는 독립적으로 세포질 organismal 생체의 우리의 지식을 증가. 그러나, calorespirometry를 사용 하 여 응답 될 수 있다 기본적인 생물 학적 질문 상대적으로 미개척 남아 있습니다.

헤스의 법칙 반응의 총 엔 탈피 변화는 초기 및 최종 상태 사이의 통로의 독립을 주장 한다. 예를 들어, 생 화 확 적인 통로 총 엔 탈피 변화 통로 내의 모든 반응의 엔 탈피 변화의 합계입니다. 열 량 둘 다 호 기성 및 혐 기성 경로 감지 하는 무차별 세포 열 생산을 측정 하기 위한 실시간 방식을 제공 합니다. 이것은 에너지가 실험 용액⁸의 벽을 통해 서를 제외 하 고 시스템에서 교환 되는 재단을 기반으로 합니다. 방열에 변화는 변화는 용액에서 모든 대사 반응에서 발표 하는 엔 탈피와 동일. 따라서, 부정적인 엔 탈피는 시스템에서의 열 손실에 상관 한다. 지난 4 년간 철저 한 연구 놓을 anabolism의 열역학 풍경을 특징 있다. 이것은 꾸준한 상승 검색어 "생물학" 및 "열 량"으로 여는 미국 국립 도서관 의학 (NLM) 건강의 국가 학회 (PubMed)에서 색인 아래 연구 기사에 의해 표시 됩니다. 검색 계시는 1970 년 이전 총 27 간행물 참조 생물학적 주사; 한편, 2016 년 혼자, 546 간행물 기술을 활용.

열 메서드는 열 생산을 결정 하기 위해 설립. 그러나, 더 많은 유연성은 respirometric 값을 확인 하기 위해 부여 됩니다. Respirometric 측정 O₂, CO₂또는 O₂ 와 CO₂모두 구성할 수 있습니다. 또한, O₂ 또는 CO₂ 의 측정 optrodes, 클라크-유형 전극, 가변 다이오드 레이저 흡수 분광학^{7,,910 등 다양 한 기법에 의해 달성 될 수 있다 11}. CO₂ 생산은 많은 respirometric 연구에 귀중 한 통계, 경작된 한 세포에 대 한 중간 종종 pH 제어^12,13bicarbonic 버퍼 시스템을 사용 합니다. 합병증을 피하기 위해 CO₂ 측정의 중 탄산염 시스템에서 문화에 있는 세포의 calorespirometry에 대 한 다음과 같은 프로토콜 respirometric 매개 변수는 단독으로 O₂ 를 사용 합니다.

산소 유량을 측정 하 여 동시, 특정 respirometers ( 재료의 표참조)는 미토 콘 드 리아 기능의 상세한 평가 대 한 설계 되었습니다. 기판-uncoupler-억제제-titrations (정장) 프로토콜 잘 설립 하 고 실험 막 잠재적인 또는 반응성 산소 종 (선생님) 형성¹⁴를 측정 하도록 설계 되어와 호환 됩니다. 그대로 셀의 calorespirometry에 대 한 제시 프로토콜 카보닐기 시안-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) 등 F₀F₁-ATP synthase 억제제 oligomycin 화학 uncouplers의 소개와 호환 됩니다. FCCP의 추가 통해 산소 소비 미토 콘 드 리아 성능¹⁵에 잠재적인 치료의 영향을 평가 하기 위해 유용한 ATP 생산에서 결합 수 있습니다. 또한, oligomycin의 추가 누출 호흡의 정도 조명 했다. 따라서, calorespirometry 동안 수행 respirometric 측정 더 미토 콘 드리 아 생리학을 명료 하 게 하도록 설계 된 광범위 한 프로토콜와 호환 됩니다.

방열 및 산소 유량의 동시 측정 calorespirometric (CR) 비율의 계산에 대 한 수 있습니다. 이 비율은 손 튼의 상수 또는 이론적인 oxycaloric,-430-480 kJ mol^-1 셀 선 또는 관심의 조직에 따라 하 고 보충된 탄소 기판^1, 사이 범위에 비해 다음은 ¹⁶. 따라서, 더 많은 부정적인 CR 비율 전반적인 신진 대사 활동을 증가 기여 혐 기성 경로에서 보여준다. 예를 들어 작업의 활성 성능 없이 일상적인 근육 조직 호흡에 대 한 CR 비율-468 kJ mol-1 범위 내에 이론적인 oxycaloric 동등한^17,18의-448에서 배열 한다. 한편, 높은 포도 당에 있는 매체에서 경작 된 포유류 세포 분해를 수행 하는 향상 된 젖 산 발효를 표시 하 고 상대적으로 낮은 미토 콘 드 리아 참여¹⁹. -800 kJ mol^-1, 더 많은 부정적인 CR 비율^{1,7에 의해 표시 된 세포질 물질 대사에 혐 기성 경로의 높게 한 참여를 보여주는에-490의 범위에서 CR 비율에서이 표현 형 결과 16,20}.

상업 기도 하 고 비영리 세포 및 조직 유통 업체 현재 약 4000 셀 라인 150 종 이상 제공 셀 라인에서에서 파생 된 인간. 불멸 하 게 세포는 신속 하 게 많은 방해할 수 있습니다 직접 또는 간접적으로 미토 콘 드 리아 기능 잠재적인 치료제의 독성을 평가 하기 위한 편리한 도구입니다. 약물 검사 하는 동안 변환 된 셀을 사용 하 여 있을 수 있습니다 제한 된 예측 값의 부분에 바르 부르 크 효과, 많은 암의 특징 때문에. 종종, 암 기질 수준 인 산화에서 ATP를 생성 하 고 완벽 하 게 호 기성 조건¹⁹mitochondrion 종사 하지 않고 젖 산의 생산을 통해 산화 환 원 균형을 유지. 제약 개발 악명 비용이 많이 드는 이며 비효율적 시장 승인²¹달성에 실패 하는 인간 임상 시험에서 테스트 9 화합물에서 약 8. 잠재적인 치료제는 셀 라인에서 낮은 세포 독성으로 인해 초기 심사를 통과할 수 있습니다, 하는 동안 이러한 화합물 중 일부 mitotoxic는 가능 하다. 어떻게 이러한 독 소는 바르 부르 크 효과 표시 하지 않는 1 차 셀의 에너지 균형을 손상 할 수 있다을 감지 하는 적합 한 메서드, 없이 중요 한 정보는 종종 bottlenecking 초기 단계에 치료 개발-보였다.

Calorespirometry 생물 학적 샘플, 세포와 조직 등의 다양 한 신진 대사 활동을 분석 하는 실용적, 비 침 투 적인 접근 이다. 제시 프로토콜의 핵심 응용 프로그램의 범위와 호환 됩니다. 그러나 한 합병증,, 발견 되었습니다. 불멸 하 게 세포 보충 잠재적인 mitotoxins^{22, 세포를 민감하게 하기 위하여 에너지 생산을 위한 산화 인 산화 (OXPHOS)의 기여를 증가 시키는 갈 락 토스와 포도 당 자유로운 매체에 자주 교양 23}. 이 대사 프로그래밍 샘플¹⁵열 량 계 사용 하는 스테인리스 ampules에 놓으면 분석을 보이지 않게 하기 위해 나타납니다. 세포 포도 당 매체에 경작 몇 시간 동안 높은 신진 대사 활동에 종사 계속 합니다. 한편, 갈 락 토스 매체에 경작 된 세포 용액, 초기 실험 시간 포인트를 제한 하는 측정에 그들의 배치의 30 분 이내 열 생산 감소. 이 문제는 불행 하 게도, 그들의 세포질 확산을 평가 하기 위해 기회를 방해. 이 특정 제한에도 불구 하 고 대부분 응용 프로그램은 호환 calorespirometric 분석 하 고이 접근을 통해 상세한 변화 정보를 얻을 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 배양

1. 인간의 간세포 암 (HepG2) 셀 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 추가 기판 (10 mM 포도 당, 2 mM 글루타민 그리고 1 mM pyruvate)를 포함 하는 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 유지 (5% CO 2 , 95% 공기, 습도 100%).
   주: DMEM respirometry와 열 량에 대 한 이후 단계에서 참조 되는 경우 위의 DMEM 배합을 사용 합니다.
2. 1 x 10⁶ 세포 격판덮개 세포 100 m m 문화 접시와 subculture 그들 모든 7 일 또는 90 %confluency 도달 하기 전에 고 매체 마다 3-4 일 갱신.
3. 세포는 60-80% 합칠 때 실험을 수행 합니다.

2입니다. 준비의 Respirometer 및 열 량 계

1. Respirometer 챔버로 DMEM의 2.2 mL를 피펫으로 완벽 하 게, 마 개를 삽입 하 고 스 토퍼 공백 도구 보통 공기에서 최적의 산소 보급 수 있도록 조정.
2. 저 어 지속적으로 37 ° C에서 산소 농도 (블루 추적) 및 산소 유량 (빨간 추적) 안정 될 때까지. Respirometer의 소프트웨어 실험에 사용 된 매체의 산소 용 해도 담당 하도록 프로그래밍 되어 있는지 확인 합니다.
   참고: 다른 미디어는 다른 산소 용 해도 계수 (예를 들어, DMEM 0.92 =).
3. DMEM 챔버 열기와 산소 농도의 안정화, 후 산소 농도 추적의 안정적인 부분을 선택 하 고 100% 공기 포화에 대 한 그것을 교정.
4. 0% 산소 산소 챔버에 존재 하는 때 산소 농도 추적의 안정적인 부분을 선택에 대 한 보정 수 있습니다. 20 µ L 적정 230 m m 나트륨 dithionite 또는 모든 산소는 실험의 끝에 생물학 견본에서 사용 후 후이 단계를 수행 합니다.
5. respirometer의 100% 공기 교정 후 마 개를 닫고 챔버에 아무 거품이 있는지 확인.
   참고: 산소 유량에 약간의 증가 감지 됩니다 폐쇄 실에서 polarographic 산소 센서로 (POS)는 산소 부분 압력을 측정 하기 위해 산소를 소비 한다.
6. 폐쇄 되 고 스 토퍼의 ~ 10 분, 후 안정 산소 유량을 관찰 하 여는 respirometer HepG2 세포에 대 한 준비 되는지 확인 합니다.
   참고: 여기에 사용 된 열 량 계 스테인리스 ampules 활용 하며 한 용액을 참조로 사용할 수 있습니다.
7. 열 량 계에의 참조 용액에 H₂O (dH₂O)의 [샘플 (단계 4)와 같은 볼륨] 2.5 mL를 추가 하 고 필요한 경우 펜을 사용 하 여 모자를 조입니다. 공기 흐름이 봉인된 용액을 청소 하 고 천천히 열 량 계에의 참조 채널 1 위치에 용액을 낮은. 생물학 견본 준비 될 때까지 위치 1에 남아 있다.

3. Respirometry와 열 량에 대 한 HepG2 세포의 준비

1. Respirometer 고 열 량 계 준비 및 보정을 확인 합니다. 따뜻한 DMEM 그리고 물 욕조에 37 ° C에 트립 신.
2. DMEM CO₂ 와 온도 대 한 매체의 평형 수 있도록 인큐베이터에서 신선한 100 mm 접시를 추가 합니다.
   참고:이 매체 주사 실험에 대 한 적절 한 볼륨 ampules 사용 될 수에 따라 달라 집니다 그래서 사용 됩니다.
3. 세포는 60-80% 합칠, 다음 세척 100 mm 접시 2 x 10 mL 실내 온도 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 거꾸로 가벼운 현미경으로 확인 합니다.
4. 셀의 100 mm 접시에는 37 ° C trypsin의 3 mL를 추가 하 고 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 7-10 분 동안 그들을 품 어. 37 ° C DMEM의 3 mL와 트립 신을 무력화 하 고 부드럽게 5 mL를 피펫으로와 ~ 20 번 pipetting으로 일시 중단.
5. DMEM trypsin resuspended 셀 6 mL 균 15 mL 원뿔 튜브로 전송 하 고 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 액체를 제거 하는 175 x g.에서 5 분 동안 원심.
6. DMEM 피펫으로 철저 하 게 셀 수 있도록 그것은 충분히 다른 해리의 ~ 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
7. 잘 혼합된 샘플의 ~ 100 µ L을 제거 하 고 모든 8 필드 셀의 총 수를 결정 하려면 hemocytometer 이용 하 여 철저 한 세포 수를 수행 합니다. 다음 ~ 50 µ L 당 10⁶ 세포 x 2를 생성 하기 위해서는 물의 resuspension의 셀에 대 한 볼륨을 계산 합니다.
   참고: 이렇게 하면 2 x 10⁶ 세포 최소한의 중간 변위와 respirometer의 각 챔버에 추가 됩니다.
8. 원심 175 x g. Resuspend에서 5 분에 대 한 셀에 계산 된 DMEM 단계 3.7에서에서 펠 릿.
9. 상공 회의소 (이 ~ 50 µ L를 해야) respirometer에서 당 2 × 10⁶ 셀을 삽입 하는 데 필요한 볼륨을 결정 하는 세포 수를 수행 합니다. 준비까지 얼음에 respirometric 측정에 대 한 셀을 저장 합니다.
10. 얼음에 집중된 셀 예제를 실행 하는 동안은 주사에 대 한 1 x 10⁵ 셀/mL의 농도 생산 하는 데 필요한 희석을 결정 합니다.
11. 샘플을 잘 혼합 하 고 각 용액에 대 한 1 x 10⁵ 셀/mL DMEM에에서 세포의 3 mL를 준비.
    참고: 샘플 희석 사용 DMEM equilibrated 중간 단계 3.3에서에서 준비 해야 합니다.

4입니다. 열 량

1. µW에서 열 신호는 관찰 가능 하 고 안정적인 열 량 계는 컴퓨터에 연결 되어 확인 하십시오.
2. 1 x 10⁵ 셀/mL (~2.5 x 10⁵ 셀)에 각 용액을 추가 하는 셀의 2.5 mL, 충분 한 공기를 보장은 용액의 뚜껑과 가스 보급 수 있도록 매체 사이.
3. 즉시 뚜껑, 펜을 사용 하 여 필요한 경우 조입니다. 어떤 외부 이물질 제거를 공기를 사용 하 여 봉인된 용액, 깨끗 하 고 천천히 낮은 열 량 계 1를 용액. 용액은 1 위치를 하향 조정 하는 시간을 기록 합니다.
4. 허용 15 분 동안 1 위치에 앉아 용액.
   참고:이 분 동안 respirometer (5 단계)에 주입 하는 세포입니다. 이렇게 하면 CR 비율을 결정 하는 때 동일한 시간 간격 열 생산 및 산소 소비에 대 한 사용.
5. 위치 1에서 15 분 후 천천히 2 위치로 참조 및 샘플 ampules 낮은. ampules 인하 했다 시간 그리고 30 분 이상 측정 기록.

5입니다. respirometry

1. 용액은 열 량 계에서 위치 1에 15 분 간격 동안 respirometric 연구를 시작 합니다.
2. 철저 하 게 균질 성 해결책을 확인 하 고 주사를 pipetting 셀 샘플 혼합 < 50 µ L ~ 2 x 10⁶ 셀/챔버의 최종 농도 대 한 respirometer의 각 챔버에 세포 샘플의. 세포는 respirometer에 주입 하는 시간을 기록 합니다.
3. 주입 후 HepG2 세포는 지속적으로 내면서 37 ° c. 산소 유량과 산소 농도 있는 꾸준한 감소의 두 안정화를 위해 적어도 20-30 분을 기다립니다.
4. 화면 오른쪽에 V 당 O₂ 플럭스 탭을 선택 하 고 산소 유량의 안정적인 부분을 강조. 상표, 다음 통계 및 O₂ 플럭스 V 당에 대 한 기록 데이터를 선택 합니다. 이 녹음은 CR 비율의 계산에 사용 됩니다.
   참고: 5.5 및 5.6 단계는 선택적 이다. 누출 호흡과 최대한 uncoupled 호흡 oligomycin FCCP의 titrations에 의해 계시 될 것 이다.
5. 각 챔버에 4 mg/mL oligomycin의 1 µ L를 주사 하 고 허용 ~ 산소 유량 안정화를 위한 10 분. 다음 단계에 의해 기록 안정적인 누설 호흡 률 5.4 oligomycin 추가 후 산소 유량 추적의 안정적인 부분을 강조 표시 하 여 수행.
6. 2 µ L 주사 0.2 m m FCCP 각 챔버에 각 주입 후 산소 유량 안정화에 대 한 수의 적정 후속 FCCP 적정에 약간의 감소에 의해 표시 된 최대 유량에 도달할 때까지 titrations 계속. 최대 유량 중 안정 된 호흡 속도 기록 합니다.

6입니다. Calorespirometric 비율의 계산

1. 샘플에서 최종 셀 수 수행 ~ 1 x 10⁵ 셀/mL 용액 (2.5 mL)에 추가 하는 셀의 총 수를 결정 하려면 hemocytometer의 모든 8 분야 활용.
2. 열 량 계 및 respirometer는 안정적인 신호는 동일한 시간에 모두에서 기록 측정 시간을 결정 합니다. 참조에 용액은 위치 2와는 respirometer로 세포의 주사의 시간으로 낮 췄 다 때 기록입니다.
3. µW/백만 셀으로 표현 단계에서 결정 하는 시간에 존경 받는 용액에 대 한 열 출력을 표시 하는 추적 위에 커서를 배치 하 여 열 생산을 기록 합니다. 산소 소비 데이터를 수집 하 고 그것 pmol O_2의 ^-1 백만 셀 x x로 표시 됩니다 확인 합니다.
4. CR 비율을 계산 하려면 먼저 kJ/s, µW를 변환 하 고 kJ/mol O₂로 CR 비율을 O₂/s의 mol에 kJ/s를 나눕니다. 참고: CR 비율 kJ/mol O₂에 표시 됩니다.
   ( 보충 파일 1참조)

결과

Calorespirometric 측정의 재현성은 적절 하 고 일관 된 샘플 준비에 따라 달라 집니다. 샘플에서 세포 배양 준비 해야 사용할 수 없습니다 경우 접시는 자란 셀 카운트 응집으로 인해 정확 하지 않은 될 수 있습니다. 또한, 감소 된 열 흐름 이멀전의 셀에 제한 된 기판 확산으로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서, 부착 셀을 사용 하 여, 60-80% 사이 confluency와 접시를 선택 하 고 매체 실험 전에 24 h 변경 긴?...

토론

Calorespirometry의 목적은 양적 호 기성 및 혐 기성 경로 신진 대사 활동에의 기여를 평가 하 고 세포 에너지 플럭스의 복합 보기를 얻을 것입니다. 이것은 방열 및 산소 유량 상응 이론 oxycaloric와 계산 된 CR 비율의 비교에서 뒤의 동시 측정에 의해 수행 됩니다. 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 데이터에 대 한 몇 가지 중요 한 단계를 고려해 야 합니다. 살 균, 건강 한 세포 배양의 정비는 중요 한 이다. ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium