Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Resumen

Este protocolo describe calorespirometry, la medición directa y simultánea de disipación de calor y la respiración, lo que proporciona un enfoque no invasivo para evaluar el metabolismo energético. Esta técnica se utiliza para evaluar la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas para utilización de la energía mediante el control del flujo total de energía celular.

Resumen

Muchas líneas celulares utilizadas en la investigación biológica y biomédica básica mantienen la homeostasis de la energía a través de una combinación de respiración aerobia y anaerobia. Sin embargo, la medida en que ambas vías contribuyan al paisaje de la producción de energía celular es constantemente pasado por alto. Las células transformadas se cultivan en los niveles de glucosa se satura a menudo muestran una dependencia disminuida en la fosforilación oxidativa para la producción de ATP, que es compensada por un aumento en la fosforilación a nivel de sustrato. Este cambio en el equilibrio metabólico permite a las células de proliferar a pesar de la presencia de las toxinas mitocondriales. En descuidar el equilibrio metabólico alterado de las células transformadas, los resultados de una investigación farmacéutica puedan ser mal interpretados desde el potencialmente efectos mitotoxic no pueden ser detectadas utilizando modelo de líneas de celulares cultivado en presencia de glucosa alta concentraciones. Este protocolo describe el apareamiento de dos poderosas técnicas, respirometría y calorimetría, que permite la evaluación cuantitativa y no invasiva de contribuciones aeróbicas y anaeróbicas a la producción de ATP celular. Respiración aerobia y anaerobia genera calor, que puede ser monitoreados mediante calorimetría. Mientras tanto, medir la tasa de consumo de oxígeno puede evaluar el grado de respiración aeróbica. Disipación de calor y consumo de oxígeno se miden al mismo tiempo, se puede determinar la relación calorespirometric. Puede entonces compararse con el valor experimentalmente obtenido el oxycaloric teórico equivalente y la amplitud de la respiración anaerobia puede ser juzgada. Así, calorespirometry ofrece un método único para analizar una amplia gama de cuestiones biológicas, incluyendo el desarrollo de medicamentos, crecimiento microbiano y bioenergéticas fundamentales bajo condiciones hipóxicas y normoxic.

Introducción

En los sistemas biológicos, el cambio de la liberación de calor o entalpia durante el metabolismo suele ser supervisado ya sea directamente (vía directa calorimetría) o indirectamente por el consumo de O₂ y CO₂ producción (mediante respirometría). Desafortunadamente, cuando estas técnicas se utilizan en el aislamiento, información crítica se pierde, como la contribución de las vías anaerobias al metabolismo celular. Calorespirometry es una técnica poderosa que se basa en la medición simultánea de la disipación de calor y respiración. Calorespirometric labor pionera investigó el metabolismo anaerobio en células de mamífero totalmente oxigenadas y demostrado aportes simultáneos de las vías aeróbicas y anaeróbicas a la homeostasis de la energía a pesar de las células transformadas en un ambiente completamente oxigenada¹. Calorespirometry desde entonces se ha aplicado a una amplia variedad de cuestiones biológicas. Algunos ejemplos incluyen el estudio de la energía animal en niveles bajos de oxígeno, los efectos del herbicida y estrógeno en las branquias de bivalvos, el metabolismo de organismos terrestres y la descomposición microbiana del suelo orgánico materia^{2, 3 , 4 , 5 , 6}. Además, calorespirometry ha reveló cómo metabólica preacondicionamiento antes de congelación mejora la crioconservación de mamíferos las células⁷. Cada enfoque, calorimetría y respirometría, independientemente se ha incrementado nuestro conocimiento de la bioenergía celular y organismo. Sin embargo, cuestiones biológicas fundamentales que pueden ser contestadas mediante el uso de calorespirometry permanecen relativamente inexploradas.

Ley de Hess establece que el cambio total de entalpía de una reacción es independiente de la vía entre los Estados iniciales y finales. Por ejemplo, el cambio de entalpía total de un camino bioquímico es la suma del cambio en entalpías de todas las reacciones dentro de la vía. Calorimetría ofrece un enfoque en tiempo real para medir la producción de calor celular, que detecta indiscriminadamente las vías aeróbicas y anaeróbicas. Esto se basa en la Fundación que ninguna energía se intercambia en el sistema excepto a través de las paredes de la ampolla experimental⁸. Un cambio en la disipación de calor es igual al cambio en entalpía liberada de todas las reacciones metabólicas en la ampolla. Así, una entalpía negativa se corresponde con una pérdida de calor del sistema. Investigación exhaustiva sobre las últimas cuatro décadas ha caracterizado el paisaje termodinámico de catabolismo y anabolismo. Esto está representado por un aumento sostenido en los artículos de investigación en los términos de búsqueda "biológicos" y "calorimetría" como indexadas por los Estados Unidos Biblioteca Nacional de medicina (NLM) en los institutos nacionales de salud (PubMed). La búsqueda revela antes de 1970, un total de 27 publicaciones referencia calorimetría biológica; mientras tanto, en el 2016 solo, 546 publicaciones utilizan la técnica.

Calorimétricas métodos están bien establecidos para determinar la producción de calor. Sin embargo, se otorga mayor flexibilidad para resolver el valor respirométricos. La medición respirométricos puede consistir en O₂, CO₂, o ambos O₂ y CO₂. Además, la medición de O₂ o CO₂ puede lograrse mediante varias técnicas, incluyendo optrodes, electrodos tipo Clark y absorción de láser de diodo sintonizable espectroscopia de^9,de^{7,10 ,11}. Mientras que la producción de CO₂ es una medida valiosa en muchos estudios respirométricos, el medio para las células cultivadas a menudo utiliza un sistema bicarbonic para control de pH^12,13. Para evitar las complicaciones de la medición de CO₂ en el sistema del bicarbonato, el siguiente protocolo para la calorespirometry de las células en cultivo utiliza O₂ como único parámetro respirométricos.

Concurrente con la medición de flujo de oxígeno, ciertos respirometers (véase Tabla de materiales) están diseñados para evaluaciones detalladas de la función mitocondrial. Protocolos (traje) de sustrato-uncoupler-inhibidor-titulaciones están bien establecidos y son compatibles con experimentos diseñados para medir la membrana potencial o reactivas de oxígeno (ROS) las especies formación¹⁴. El protocolo presentado para calorespirometry de las células intactas es compatible con la introducción de uncouplers químicos como cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) y el F₀F₁-ATP sintasa inhibidor oligomycin. Mediante la adición de FCCP, consumo de oxígeno puede ser desacoplado de la producción de ATP, que es útil para evaluar el impacto de la terapéutica potencial en el funcionamiento mitocondrial¹⁵. Además, la adición de oligomycin ilumina el grado de respiración de escape. Así, las mediciones respirométricos realizadas durante calorespirometry son compatibles con protocolos extenso diseñados para aclarar más lejos la fisiología mitocondrial.

La medida simultánea de la disipación de calor y flujo de oxígeno permite el cálculo de la relación calorespirometric (CR). Este cociente se compara constante de Thornton o la oxycaloric teórica equivalente, que oscila entre-430 a-480 kJ mol^-1 dependiendo de la línea de células o tejidos de interés y el carbón suplido sustratos^{1, 16}. por lo tanto, una relación más negativa de CR revela aumento de las contribuciones de vías anaeróbicas a la actividad metabólica general. Por ejemplo, la proporción de CR para la respiración de los tejidos musculares rutina sin el desempeño activo de trabajo oscila entre-448 y-468 kJ mol-1, que es dentro de la gama del oxycaloric teórico equivalente^17,18. Mientras tanto, las células del cáncer mamíferos cultivadas en medio alto en glucosa Mostrar mayor ácido láctico fermentación después de glicolisis y relativamente baja participación mitocondrial¹⁹. Este resultados de fenotipo en las tasas de CR en la gama de-490 a-800 kJ mol^-1, demostrando una mayor implicación de las vías anaerobias en el metabolismo celular como indica más negativas CR ratios^{1,7, 16,20}.

Distribuidores de células y tejidos tanto comerciales como sin fines de lucro actualmente oferta de líneas de celulares de más de 150 especies, con casi 4.000 líneas celulares derivan de los seres humanos. Líneas celulares inmortalizadas son herramientas convenientes para la evaluación rápida de la toxicidad de la terapéutica potencial, muchos de los cuales pueden interferir directa o indirectamente con las funciones mitocondriales. Usando las células transformadas durante la detección de drogas puede ser un valor predictivo limitado en parte debido al efecto de Warburg, un rasgo distintivo de muchos cánceres. A menudo, los cánceres generan ATP fosforilación a nivel de sustrato y equilibrio redox a través de la producción de lactato sin comprometer completamente la mitocondria bajo condiciones aerobias¹⁹. Desarrollo farmacéutico es muy costoso e ineficiente, con 8 de los 9 compuestos probados en ensayos clínicos en humanos no lograr la aprobación de mercado²¹. Mientras que la terapéutica potencial puede pasar revisión inicial debido a la baja citotoxicidad en líneas celulares, es posible que algunos de estos compuestos son mitotoxic. Sin un método adecuado para detectar cómo estas toxinas pueden afectar el balance de energía en las células primarias que no muestran el efecto de Warburg, información crítica suele ser alto, cuellos de botella desarrollo terapéutico en fases tempranas.

Calorespirometry es un enfoque práctico, no invasivo para analizar la actividad metabólica en una variedad de muestras biológicas, incluidas las células y los tejidos. El núcleo del protocolo presentado es compatible con una gama de aplicaciones. Una complicación, sin embargo, ha sido identificada. Las células inmortalizadas a menudo se cultivan en un medio libre de glucosa con la galactosa para aumentar la contribución de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) para la producción de energía, con el fin de sensibilizar las células a potenciales mitotoxins^{22, 23}. Esta reprogramación metabólica parece oscurecer el análisis cuando las muestras se colocan en las ampollas de acero inoxidable utilizados por el calorímetro¹⁵. Las células cultivadas en un medio de glucosa seguirán en alta actividad metabólica durante varias horas. Mientras tanto, las células cultivadas en medio de galactosa disminuyen la producción de calor dentro de 30 minutos de su colocación en la ampolla, de realizar medidas de restringido a puntos del tiempo experimental temprana. Este comportamiento, desafortunadamente, impide la oportunidad de evaluar su proliferación celular. A pesar de esta limitación específica, mayoría de las aplicaciones es compatible con el análisis de calorespirometric y toda la información metabólica puede obtenerse a través de este enfoque.

Protocolo

1. cultivo celular

1. Mantener las células del carcinoma (HepG2) hepatocelular humano en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y sustratos adicionales (10 mM de glucosa, glutamina 2 mM y 1 mM piruvato) a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular (5% CO₂ , 95% aire, 100% de humedad).
   Nota: Utilice la anterior formulación de DMEM al DMEM se hace referencia en pasos posteriores para la respirometría y calorimetría.
2. La placa de las celdas de 1 x 10⁶ células por placa de 100 mm cultura y subcultura cada 7 días o antes de llegar a 90% de confluencia y renovar el medio cada 3-4 días.
3. Realizar los experimentos cuando las células son confluentes de 60-80%.

2. preparación del respirómetro y calorímetro

1. Pipeta, 2,2 mL de DMEM en la cámara del respirómetro, inserte el tapón y ajustar con la herramienta de espaciador tapón para permitir la difusión óptima del oxígeno del aire al medio.
2. Revolver continuamente a 37 ° C hasta que la concentración de oxígeno (trazo azul) y el flujo de oxígeno (trazo rojo) son estables. Asegúrese de que software del respirómetro está programado para tener en cuenta la solubilidad de oxígeno de los medios utilizados en el experimento.
   Nota: Los diferentes medios de comunicación tienen coeficientes de solubilidad de oxígeno diferentes (por ejemplo, DMEM = 0,92).
3. Después de la estabilización de la concentración de oxígeno en DMEM con la cámara abierta, seleccionar una parte estable de la traza de la concentración de oxígeno y calibre para la saturación del aire del 100%.
4. Calibrar el 0% de oxígeno seleccionando una porción estable de la traza de la concentración de oxígeno cuando no hay oxígeno presente en la cámara. Realizar este paso después de 20 valoración de μl de Ditionito de sodio 230 mM o después de que todo el oxígeno es consumido por la muestra biológica al final de un experimento.
5. Después de la calibración de aire del 100% del respirómetro, cerrar el tapón y asegúrese de que no hay burbujas están presentes en la cámara.
   Nota: un ligero aumento en el flujo de oxígeno será detectado en la cámara cerrada como el sensor de oxígeno polarográfico (POS) consume oxígeno para medir la presión parcial de oxígeno.
6. Después de ~ 10 minutos del obturador se cierra, confirman que el respirómetro está listo para las células HepG2 mediante la observación de un flujo de oxígeno estable.
   Nota: El calorímetro utilizado aquí utiliza ampollas de acero inoxidable y requiere una ampolla que se utilizará como referencia.
7. Añadir 2,5 mL de H₂O (dH₂O) [volumen igual que las muestras (paso 4)] a la ampolla de la referencia del calorímetro y apriete la tapa, usando alicates de ser necesario. Limpiar la ampolla sellada con flujo de aire y baje lentamente la ampolla hasta la posición 1 en el canal de referencia del calorímetro. Permanecen en la posición 1 hasta que se prepara la muestra biológica.

3. preparación de células HepG2 de respirometría y calorimetría

1. Confirmar que el respirómetro calorímetro preparado y calibrado. DMEM y tripsina a 37 ° C en un baño de agua.
2. Agregar DMEM fresca placa de 100 mm y de lugar en la incubadora para permitir el equilibrio del medio de CO₂ y temperatura.
   Nota: Este medio se usará para el experimento de calorimetría, así que el volumen adecuado depende de la cantidad de ampollas que se utilizará.
3. Confirmar con un microscopio invertido de luz que las células en el confluente de 60-80%, luego lavar el 100 mm placa de 2 x con 10 mL de temperatura ambiente con tampón fosfato salino (PBS).
4. Añadir 3 mL de la tripsina de 37 ° C en la placa de 100 mm de las células y les incube durante 7-10 min a 37 ° C en la incubadora de la cultura de célula. Neutralizar la tripsina con 3 mL de DMEM de 37 ° C y suspender por suavemente pipeteo ~ 20 veces con una pipeta de 5 mL.
5. Transferir los 6 mL de células resuspendidos en DMEM y tripsina en un tubo cónico de 15 mL estéril y centrifugar por 5 min a 175 x g. quitar el líquido sin perturbar el sedimento celulares.
6. Resuspender el precipitado de células en ~ 5 mL de DMEM y pipetee cuidadosamente para asegurar las células son suficientemente disociados uno del otro.
7. Quitar el ~ 100 μl de la muestra bien mezclada y realizar un conteo minucioso utilizando todos los campos de 8 en un hemocitómetro para determinar el número total de células. Luego calcular el volumen de resuspensión de las células para generar ~ 2 x 10⁶ células por μl 50.
   Nota: Esto asegurará que el 2 x 10⁶ células se añaden a cada cámara del respirómetro con mínimo desplazamiento medio.
8. Centrifugar las células durante 5 min a 175 x g. Resuspender el pellet en el volumen calculado de DMEM de paso 3.7.
9. Realizar un conteo para determinar el volumen requerido para inyectar 2 x 10⁶ células por cámara en el respirómetro (esto debe ser ~ 50 μL). Almacenar las células para la medición respirométricos en hielo hasta que esté listo.
10. Mientras que la muestra concentrada de células es en el hielo, determinar la dilución requerida para producir una concentración de 1 x 10⁵ células/mL para la calorimetría.
11. Mezclar bien la muestra y preparar 3 mL de las células 1 x 10⁵ células/ml de DMEM cada ampolla.
    Nota: El DMEM utilizado para la dilución de la muestra debe ser el medio equilibrado preparado en el paso 3.3.

4. calorimetría

1. Asegúrese de que calorímetro está conectado a la computadora y la señal calorimétrica en μW es observable y estable.
2. Añadir 2,5 mL de células 1 x 10⁵ células/ml (~2.5 x 10⁵ células) para cada ampolla, asegurando suficiente aire entre la tapa de la ampolla y el medio para permitir la difusión del gas.
3. Inmediatamente apriete el tapón, usando alicates de ser necesario. Limpiar la ampolla sellada, con flujo de aire para remover cualquier suciedad externa y baje lentamente la ampolla hasta la posición 1 del calorímetro. Registrar el tiempo de que la ampolla se baja hasta la posición 1.
4. Permiten la ampolla a sentarse en la posición 1 durante 15 minutos.
   Nota: Durante este período de 15 minutos, las células son para ser inyectada en el respirómetro (paso 5). Esto asegura que el mismo intervalo de tiempo se utiliza para la producción de calor y consumo de oxígeno cuando se determina la proporción de CR.
5. Después de 15 minutos en posición 1, baje lentamente la referencia y la muestra ampollas en la posición 2. Registrar el tiempo que las ampollas fueron bajados y medida para por lo menos 30 minutos.

5. respirometría

1. Durante el intervalo de 15 minutos en el que la ampolla está en la posición 1 en el calorímetro, comienzan los estudios respirométricos.
2. Mezclar bien la muestra de células mediante pipeteo para asegurar una solución homogénea e inyectar < 50 μl de la muestra de células en cada compartimiento del respirómetro para una concentración final de 2 x 10⁶ células/cámara. Registrar el tiempo que las células se inyectan en el respirómetro.
3. Después de la inyección, las células HepG2 se revuelven continuamente a 37 ° C. Espere por lo menos 20-30 min para ambos una estabilización del flujo de oxígeno y una constante disminución en la concentración de oxígeno.
4. Seleccione la ficha de flujo de O₂ por la V a la derecha de la pantalla, resalte una parte estable del flujo de oxígeno. Seleccione marcas, entonces las estadísticas y datos de registro para el flujo de O₂ por V. Esta grabación se utilizará en el cálculo de la proporción de CR.
   Nota: Los pasos 5.5 y 5.6 son opcionales. Respiración de fuga y máxima respiración desacoplada se revelará por titulaciones de oligomycin y FCCP.
5. Inyectar 1 μl de oligomycin 4mg/mL en cada cámara y permiten ~ 10 minutos para la estabilización del flujo de oxígeno. Tasa de respiración de fuga estable registro siguiendo los pasos realizados en 5.4 poniendo una porción estable de la traza de flujo de oxígeno después de la adición de oligomycin.
6. Valorar las inyecciones de 2 μl de 0,2 mM FCCP en cada cámara, permitiendo para la estabilización del flujo de oxígeno después de cada inyección. Continuar con las valoraciones hasta que se alcanza el flujo máximo, según lo indicado por un ligero descenso en la valoración posterior del FCCP. Registrar la frecuencia de respiración estable durante el flujo máximo.

6. cálculo del coeficiente de Calorespirometric de

1. Realizar un conteo final de las muestras preparadas en ~ 1 x 10⁵ células/mL, utilizando todos los campos de un hemocitómetro para determinar el número total de células a la ampolla (2,5 mL) 8.
2. Determinar un tiempo récords medidas del calorímetro y respirómetro que estable las señales están presentes en momentos idénticos. Referencia el tiempo registrado cuando la ampolla fue bajada a la posición 2 y el tiempo de la inyección de células en el respirómetro.
3. Grabar la producción de calor colocando el cursor sobre la traza muestra salida de calor para la ampolla respetada en el momento determinado en el paso y expresa como μW/millón de células. Recoger datos de consumo de oxígeno y garantizar que se expresa como pmol O₂ x s^-1 x millones de células.
4. Para calcular la proporción de CR, primero convertir MW a kJ/s y luego dividir kJ/s sobre mol de O₂/s para obtener la relación CR expresada en kJ/mol O₂. Nota: La proporción de CR se presenta en kJ/mol O₂.
   (véase la archivo adicional 1)

Resultados

La reproducibilidad de las mediciones de calorespirometric depende de una preparación adecuada y constante. Muestras preparadas a partir de cultivos celulares deben no utilizarse si las placas son muy crecidas, como recuentos de células pueden ser inexactos debido a la aglutinación. Además, flujos de calor reducida debido a la difusión limitada de sustrato en las células agrupadas pueden ocurrir. Por lo tanto, al utilizar células adherentes, es fundamental seleccionar una placa con la confluencia entre 60-80% y ca...

Discusión

El objetivo de calorespirometry es evaluar cuantitativamente la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas a actividad metabólica y obtener una vista compuesta de flujo de la energía celular. Esto se logra mediante una medición simultánea de la disipación de calor y flujo de oxígeno, seguido por una comparación de la proporción de CR calculada con la oxycaloric teórica equivalente. Deben considerarse varios pasos críticos para datos reproducibles y confiables. El mantenimiento de un cultivo celular es...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium