Calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ

要約

このプロトコルでは、calorespirometry、放熱の呼吸、エネルギー代謝を評価するために非侵襲的アプローチを提供する直接・同時測定をについて説明します。この手法は、総細胞エネルギーの流れを監視することによって好気性と嫌気性経路エネルギー利用への貢献を評価するために使用されます。

要約

基本的な生物学的および生物医学研究で使用される多くの細胞は、好気性と嫌気性の呼吸の組み合わせによりエネルギー恒常性を維持します。ただし、両方の経路が細胞のエネルギー生産の景観に貢献する範囲は一貫して見落とさ。変換で培養された細胞のブドウ糖のレベルをしばしば飽和は、酸化的リン酸化基質レベルのリン酸化の増加によって償われる ATP の生産のために減少の依存関係を表示します。代謝の身のこなし、このシフトでは、細胞はミトコンドリア毒素の存在にもかかわらず増殖することができます。以来トランス ホーム細胞の変えられた代謝身のこなしを無視して、医薬品のスクリーニングの結果が誤って、潜在的 mitotoxic の効果が検出されないモデル高グルコースの存在下で培養のセルラインを使用して濃度。このプロトコルでは、呼吸と熱量測定、細胞 ATP を生産する好気性と嫌気性の貢献の量的で、非侵襲的評価を可能にする 2 つの強力な手法の組み合わせについて説明します。好気性と嫌気性の呼吸熱監視を介して熱量測定をすることができますを生成します。一方、酸素消費率を測定は、好気呼吸の程度を評価できます。放熱と酸素消費量の両方を同時に測定、calorespirometric 比が決定できます。理論 oxycaloric 相当に得られた実測値を比較し、ことができ、嫌気性の呼吸の程度を判断できます。したがって、calorespirometry は、医薬品開発、微生物の増殖、平地と低酸素の条件の下で基本的な生体エネルギーなど生物の質問の広い範囲を分析するユニークな方法を提供します。

概要

生物学的システム、代謝時に熱リリースまたはエンタルピーの変更は通常直接どちらかを監視 (を介して直接熱量測定) または間接的 O₂消費量や CO₂の生産 (呼吸) を経由。残念ながら、単独でこれらのテクニックを使用すると、重要な情報が失われます、嫌気性細胞の代謝経路の貢献など。Calorespirometry は、放熱と呼吸の両方の同時測定に依存する強力な手法です。完全に酸素の哺乳類細胞の嫌気性代謝を検討した calorespirometric 仕事を開拓し、にもかかわらず中トランス ホーム細胞のエネルギー恒常性する好気性と嫌気性経路の同時の貢献を実証します。完全に酸素環境¹。Calorespirometry は、さまざまな生物学的質問にから適用されています。いくつかの例は、低酸素レベルで動物のエネルギー論の研究、二枚貝、地上の生物の代謝と有機質土壌物質^2,の微生物分解のえらに及ぼす除草剤とエストロゲンの両方^3,4,5,6。 さらに、calorespirometry は⁷細胞の哺乳類の凍結凍結する前に明らかにしたどのように代謝前処理向上。それぞれのアプローチは、熱量測定および呼吸、細胞と個体の生体エネルギーの私達の知識は個別に増加しました。ただし、calorespirometry を使用して答えることができる基本的な生物学的質問比較的未踏のままです。

ヘスの法則の反作用の合計エンタルピー変化は初期と最終状態の間の経路に依存しません。たとえば、生化学的経路の合計エンタルピー変更は、経路内のすべての反作用のエンタルピーの変更の合計です。熱量測定は、無差別に好気性と嫌気性の両方の経路を検出する細胞熱生産を測定するためのリアルタイムのアプローチを提供しています。これは実験アンプル⁸の壁を通ってを除く、システムでエネルギーは交換されません基盤に基づいています。放熱の変更は、アンプルのすべての代謝反応からリリース エンタルピーの変更と同じです。したがって、負のエンタルピーは、システムからの熱の損失に関連します。過去 4 年間の徹底的な研究は、異化と同化の熱力学的景観を特徴としています。これは、検索用語「生物」と「熱量」インデックスによってアメリカ合衆国国立図書館の医学 (NLM) 健康の国民の協会 (PubMed) で研究の記事の安定した上昇によって表されます。検索は合計 27 の文書参照の生物学的熱量測定; 1970 年前にことを明らかに一方、単独で 2016 年 546 出版物利用技術です。

熱量測定法は、熱生産を決定する確立されています。ただし、進入します。 値を解決するためより多くの柔軟性が与えられます。進入します。 測定は、O₂CO₂、または O₂と CO₂の両方で構成できます。さらに、O₂ ・ CO₂測定は optrodes、クラーク型電極、波長可変半導体レーザー吸収分光法^{7,9,10 など、様々 な手法で行うことができます。、11}。CO₂の生産は多くの進入します研究に貴重な指標が、培養細胞用培地はしばしば pH コントロール^12,13炭酸水バッファー システムを利用しています。重炭酸塩システムの CO₂測定の合併症を避けるためには、培養細胞の calorespirometry の次のプロトコルは、唯一の進入しますパラメーターとして O₂を利用しています。

酸素のフラックスの測定と並行して、特定の respirometers (材料の表を参照してください) は、ミトコンドリア機能の詳細な評価のため設計されています。基板-ランプ-阻害剤-滴定 (スーツ) プロトコルは、よく確立されるおよび膜の潜在的な反応酸素種 (ROS) の形成¹⁴を測定するために設計された実験と互換性が。そのままなセルの calorespirometry の提案するプロトコルは、化学的脱共役カルボニル シアン化物-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) と F₀F₁-ATP 合成酵素阻害剤オリゴマイシンなどの導入と互換性が。FCCP 添加して酸素消費量が、ミトコンドリアの性能¹⁵の潜在的な治療の影響を評価するために有用である ATP を生産から結合することができます。さらに、オリゴマイシン添加漏れ呼吸の程度が点灯します。したがって、calorespirometry の中に実行される進入します。 測定がさらにミトコンドリアの生理機能を解明するために広範なプロトコルと互換性があります。

放熱の酸素流量同時測定 calorespirometric (CR) 比の計算が可能です。この比率は、ソーントンの定数または細胞または興味の組織によって-480 kJ mol^-1 -430 と補われた炭素基板^1,間の範囲と同等理論 oxycaloric と比較して¹⁶. したがってより否定的な CR の比率は、全体的な代謝活動に嫌気代謝経路から増加した貢献を明らかにします。たとえば、仕事の積極的なパフォーマンスなしルーチン筋肉組織呼吸の CR 率は-448 から-468 の理論 oxycaloric 等価^17,18の範囲内にある kJ mol-1 範囲します。一方、哺乳類の癌細胞は高いブドウ糖の培地で培養した解糖系に続く強化の乳酸発酵を表示、ミトコンドリア婚約¹⁹が比較的低い。-800 kJ mol^-1、嫌気性より否定的な CR 比^{1,7、によって示されると細胞の代謝経路の高まりの関与を示す-490 の CR 率の範囲内でこの表現型の結果 16,20}。

両方の商業および非営利の細胞・組織の代理店現在ほぼ 4,000 細胞 150 種以上提供細胞は、人間から派生しました。不死化細胞株は、すぐに多くの直接または間接的を妨げるミトコンドリア機能の潜在的な治療の毒性を評価するための便利なツールです。薬剤のスクリーニング中に変換されたセルを使用して可能性があります限られた予測値の一部に Warburg 効果、多くの癌の特徴のため。多くの場合、癌は基質レベルのリン酸化から ATP を生成し、完全好気性条件¹⁹の下でミトコンドリアを雇わないで乳酸の産生を介して酸化還元バランスを維持します。医薬品開発は、悪名高い高価、非能率的で 9 化合物市場承認²¹を達成するために失敗した人間の臨床試験で検証中約 8 です。潜在的な治療は、細胞株の低毒性のための最初のスクリーニングを渡すことも、これらの化合物のいくつかが mitotoxic であることは可能です。これらの毒素が Warburg 効果を表示しない一次電池のエネルギー ・ バランスを損なうことができる方法を検出するための適切なメソッドがない重要な情報は過剰に見て、初期の段階で治療開発のボトルネックします。

Calorespirometry は、さまざまな細胞や組織を含む生体試料などの代謝活動を分析する実用的な非侵襲的アプローチです。提案するプロトコルのコアは、アプリケーションの範囲との互換性です。ただし、1 つの合併症が確認されています。不死化細胞は、潜在的な mitotoxins^{22、細胞を感作するために酸化的リン酸化 (OXPHOS) エネルギー生産のための貢献度を高めてガラクトースと補われるブドウ糖自由の培地中で培養頻繁 23}。この代謝リプログラミングが熱量計¹⁵で使用されるステンレス製アンプルに配置するサンプル分析を不明瞭に表示されます。グルコース培地で培養された細胞は、いくつかの時間の高い代謝活性に従事し続けてください。一方、ガラクトース培地で培養された細胞は、測定実験早くポイントに制限を行う、アンプル内の配置の 30 分以内熱生産を減少させます。この現象は、残念ながら、彼らの細胞増殖を評価する機会を妨げています。この特定の制限にもかかわらず calorespirometric 解析と互換性のあるほとんどのアプリケーション、これにより代謝の詳細情報を取得できます。

プロトコル

1. 細胞培養

1. ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 10% 牛胎児血清 (FBS)、追加基板 (10 mM グルコース、グルタミン、2 mM と 1 mM ピルビン酸) を含む人間の肝細胞癌 (hepg2 細胞) 細胞を維持 (5 %co₂、95% の空気、湿度 100%)。
   注: は、DMEM が呼吸と熱量測定の後の手順で参照される上記 DMEM の定式化を使用します。
2. 1 x 10⁶細胞をプレートあたりセル 100 mm の板を文化とサブカルチャーそれらすべて 7 日または 90% の confluency に達する前に、媒体ごとに 3-4 日を更新します。
3. セルが 60-80% 合流実験を実行します。

2. 呼吸度計、熱量計の準備

1. 呼吸室に DMEM の 2.2 mL ピペットで移しなさい完全にストッパーを挿入、中に空気から最適な酸素の拡散を実現するストッパー スペーサー ツールで調整。
2. (ブルー トレース) の酸素濃度、酸素流量 (赤のトレース) が安定するまで、37 ° C で継続的にかき混ぜます。実験で使用中の酸素溶解度を考慮して呼吸のソフトウェアをプログラムを確認します。
   注: 別のメディアがある別の酸素溶解度係数 (例えば、DMEM 0.92 を =)。
3. 商工会議所を開き DMEM で酸素濃度の安定化は後、酸素濃度トレースの安定した部分を選択し、100% の空気飽和のためにそれを校正します。
4. 0% 酸素室で酸素がないとき酸素濃度トレースの安定した部分を選択するために校正します。20 μ L の滴定実験の終わりに生物学的サンプルですべての酸素が消費された後の 230 mM 亜ジチオン酸ナトリウムの後、この手順を実行します。
5. 100% の空気の呼吸度計のキャリブレーション後ストッパーを閉じ泡が商工会議所に存在しないことを確認します。
   注: 酸素流量のわずかな増加として検出される密閉チャンバーのポーラロ グラフ法による酸素センサー (POS) の酸素分圧を測定するために酸素を消費します。
6. 閉じられているストッパーの ~ 10 分後安定した酸素流量を観察することによって呼吸度計を HepG2 細胞の準備ができているを確認します。
   注: ここで使用される熱量計ステンレス アンプルを利用し、1 アンプルの参照として使用することが必要です。
7. カロリメータの参照アンプルに 2.5 mL H₂O (dH₂O) の [サンプル (ステップ 4) と等しいボリューム] を追加し、必要に応じて、ペンチを使用してキャップを締めます。気流のある密封されたアンプルをきれいにし、熱量計の参照チャネルの 1 の位置にアンプルをゆっくりと下ろします。位置 1 まで生物的サンプルを用意しています。

3. HepG2 細胞の呼吸と熱量測定のための準備

1. 計、熱量計の準備し、校正を確認します。暖かい DMEM そして 37 の ° C の水浴中にトリプシン。
2. 新鮮な 100 mm プレートと CO₂と温度の両方のための媒体の平衡を許可するインキュベーターで場所に DMEM を追加します。
   注: 適切なボリュームに使用するアンプル数によって異なりますので、この媒体は熱量測定実験のため使用されます。
3. セルは、60-80% 合流、その後洗って 100 mm プレート室温リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を 2 倍を倒立顕微鏡で確認します。
4. 細胞の 100 mm プレートを 37 ° C トリプシンの 3 mL を加えるし、細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 7-10 分間インキュベートします。37 ° C DMEM の 3 mL のトリプシンを中和し、5 mL のピペットを使い、優しく 〜 20 回ピペッティング システムそれによって中断します。
5. 滅菌 15 mL の円錐管に DMEM およびトリプシンの再懸濁細胞の 6 mL を転送し、175 x g に 5 分は細胞ペレットを乱すことがなく液体を削除、それを遠心分離します。
6. 〜 5 mL DMEM とセルを万全にそれが十分に互いから分離したピペットで細胞ペレットを再懸濁します。
7. 十分に混合されたサンプルの ~ 100 μ L を削除し、セルの合計数を決定するための診断のすべての 8 のフィールドを利用した徹底的な細胞数を実行します。〜 50 μ L あたり 10 の⁶セル × 2 を生成するために、細胞の再懸濁のボリュームを計算します。
   注: これは 2 × 10⁶セルが最小限の中変位計の各商工会議所に追加されている保証されます。
8. 細胞を再懸濁します 175 x g. で 5 分間遠心分離機の DMEM ステップ 3.7 から計算される量のペレット。
9. (これは 〜 50 μ L をする必要があります) 呼吸の商工会議所あたり 2 × 10⁶細胞を注入するために必要なボリュームを決定するセル数を実行します。氷の準備ができるまで進入します。 測定用セルを格納します。
10. 濃縮細胞サンプルは、氷の上は、熱量測定の 1 x 10 の⁵セル/mL の濃度を生成するために必要な希釈を決定します。
11. サンプルをよく混ぜ、それぞれアンプルの DMEM で 1 x 10 の⁵セル/mL で細胞の 〜 3 mL を準備します。
    注: サンプル希釈用 DMEM は 3.3 の手順で調製した平衡の培地をする必要があります。

4. 熱量測定

1. 熱量計は、コンピューターに接続されている μ で熱量の信号が観察可能な安定したことを確認します。
2. 各アンプルに 1 x 10⁵セル/ml (~2.5 x 10⁵細胞) 細胞の 2.5 mL を追加、アンプルの蓋とガスの拡散を許可する媒体の間は十分な空気を確保します。
3. すぐに必要に応じて、ペンチを使用して、キャップを締めます。密封されたアンプルは、空気の流れを使用して任意の外部の破片を削除するをきれいにし、熱量計の 1 の位置にアンプルをゆっくりと下ろします。アンプルは 1 の位置に下がる時間を記録します。
4. 15 分の 1 の位置に座っているアンプルを許可します。
   注: この 15 分間は、細胞呼吸 (手順 5) に注入されるべきです。これにより、CR の比率が決定するときに、熱発生量と酸素消費量の時間の同じ間隔を使用します。
5. 位置 1 で 15 分後のリファレンスとサンプルの両方のアンプル 2 の位置までゆっくりと下ろします。時間、アンプルが引き下げられると、少なくとも 30 分のための測定を記録します。

5. 呼吸

1. アンプルがカロリメータの位置 1 は 15 分間隔、中に進入します研究を開始します。
2. 同種のソリューションを確認し注入ピペッティングにより細胞サンプルを徹底的にミックス < ~ 10⁶セル/室 × 2 の最終濃度計の各チャンバーに細胞サンプルを 50 μ l 添加します。呼吸度計に細胞を注入時間を記録します。
3. HepG2 細胞を継続的に 37 ° C で攪拌注入後酸素流量と酸素濃度の安定した減少の両方安定化のため、少なくとも 20 〜 30 分を待ちます。
4. 画面の右上あたり V O₂フラックスタブを選択し、酸素流量の安定した部分を強調表示。マーク、統計、および V 当たり O₂フラックスのレコード データを選択します。この記録は、CR 率の計算に使用されます。
   注: 5.5、5.6 の手順はオプションです。漏れの呼吸と最大の共役呼吸オリゴマイシンおよび FCCP の滴定によって明らかにされます。
5. 各チャンバーに 4 mg/mL オリゴマイシンの 1 μ L を注入でき 〜 酸素のフラックスの安定化のため 10 分。以下の手順でレコードの安定したリーク呼吸オリゴマイシン添加後酸素フラックス トレースの安定した部分を強調することによって 5.4 で実行されます。
6. 0.2 mM の FCCP 各商工会議所に各投与後酸素フラックス安定化を可能にする 2 μ L 注入を滴定しなさい。最大磁束に到達するまで、後続 FCCP 滴定のわずかな低下によって示されるように、滴定を続けます。最大磁束中安定した呼吸を記録します。

6. Calorespirometric 比の計算

1. 作製したサンプルの最後のセルの数を数えるため 〜 1 x 10 の⁵セル/mL アンプル (2.5 mL) に追加されるセルの合計数を決定するための診断のすべての 8 のフィールドを活用しました。
2. 熱量計法と安定した信号が同じ時間に存在する計から測定を記録する時間を決定します。アンプルは位置 2 と呼吸度計にセルの注入の時間に低下したときに記録された時間を参照します。
3. ステップと μ/100万セルとして急行を決められた時点で尊敬のアンプルの熱出力を表示するトレースの上にカーソルを置くと、熱生産を記録します。酸素消費量データを収集し、pmol O₂倍の 100万個 x s^-1として表現されることを確認します。
4. CR の比率を計算するために μ を kJ/秒に変換し、kJ/mol O₂として表される CR 比を取得する O₂/s の mol 以上 kJ/s を分割します。注: CR 率は kJ/mol O₂で提示されます。
   (補足のファイル 1を参照してください)

結果

Calorespirometric 測定値の再現性は、適切かつ一貫性のある試料に依存します。培養細胞から調製したサンプル使用しないでくださいプレートが大きくなり過ぎた場合細胞数は凝集のため不正確になることができます。さらに、限られた基板周辺固定支持の細胞の拡散による熱フローが発生する可能性があります。したがって、付着性のセルを使用する場合は、60-80% の confluency にプレートを選択...

ディスカッション

Calorespirometry の目的は、好気性と嫌気性代謝経路の貢献を定量的に評価し、細胞のエネルギー流束の複合ビューを取得することです。これは、熱放散と同等理論 oxycaloric の計算の CR 率の比較に続いて酸素流量の同時測定で。いくつかの重要なステップは、再現性のある信頼性の高いデータの考慮されなければなりません。滅菌、健康な細胞培養のメンテナンスが重要です。細菌や真菌による?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepG2 Cells	American Type Culture Collection	HB-8065	Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)	Thermometric AB		Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920	Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning Corporation	430167	Tissue culture dish
Glucose, powder	Thermofisher Scientific	15023021	Glucose for DMEM medium
Galactose, powder	Fischer Scientific	BP656500	Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose	Thermofisher Scientific	11966025	Cell culture medium