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摘要

我们评价了颈椎交感神经节阻滞对人工神经导管修复神经的影响。雄性猎狗分别在左下牙槽神经的10毫米缝隙上植入人工神经;左颈椎交感神经节通过侧开手术注射99.5% 乙醇, 阻断了颈椎交感神经节。

摘要

聚甘酸胶原蛋白 (pga-c) 管是一种生物吸收神经管, 充满了多室结构的胶原蛋白, 由薄胶原蛋白膜组成。使用这些试管治疗受损的下牙槽神经 (ian) 时, 取得了良好的临床效果。使用 pga-c 管成功神经再生的一个关键因素是周围组织的血液供应。颈椎交感神经节阻滞 (csgb) 在头部和颈部造成交感神经阻滞, 从而增加该地区的血液流动。为确保充分发挥作用, 必须连续几周使用局部麻醉剂每天1至 2次;这在创建用于研究这一技术的动物模型时带来了挑战。为了解决这一限制, 我们在口腔面部区域长期增加血液流动的犬类模型中开发了乙醇诱导的 csgb。我们研究了通过 pga-c 管植入物进行的 ian 再生是否可以通过该模型得到提高。14个比格尔斯分别在左 ian 的10毫米缝隙上植入了一个 pga-c 管。ian 位于下颌骨管内, 周围是骨头, 因此我们选择了压电手术, 包括超声波, 进行骨处理, 以尽量减少神经和血管损伤的风险。这种方法获得了良好的手术效果。手术一周后, 其中7只狗通过注射乙醇离开了 csgb。乙醇诱导的 csgb 改善了神经再生, 提示血流的增加有效地促进了 ian 缺陷中的神经再生。这种犬类模型可以为进一步研究 csgb 的长期效果做出贡献。

引言

在许多情况下, 下牙槽神经 (ian) 的创伤是医源性的, 经常是由拔除第三磨牙或放置牙种植体 1,2,3引起的。ian 的损伤会导致热和触觉的缺陷, 以及感觉异常、麻醉、麻醉和异位。神经损伤不仅通过保守治疗治疗, 还通过其他方法治疗, 包括缝合和自体移植。然而, 这些方法有缺点, 其中往往包括缺乏症状改善和神经缺陷的捐献者部位 4,5,6。

人工神经-多糖酸胶原蛋白 (pga-c) 管最初是在日本发展起来的。它是一个生物吸收管, 其内腔充满海绵状胶原蛋白7。在动物实验中, 该管用于增强有腹膜神经缺损的猎狗的神经再生, 并被证明比自体神经移植促进了更高水平的恢复 8.pga-c 管在周围神经损伤患者中的临床应用始于2002年。此外, 在治疗三叉神经病变 (ian 和舌神经)9,10,11方面也取得了良好的临床效果。使用 pga-c 管成功神经再生的一个关键因素是周围组织的血液供应 8。颈椎交感神经节阻滞 (csgb) 在头部和颈部区域造成交感神经阻滞, 并增加血液流向各自神经支配区域12;因此, 它已被用于治疗复杂的区域疼痛综合征和循环系统功能不全 13,14,15。然而, 只有少数实验研究 csgb 在增加血液流动方面的有效性为16,17。为了确保足够的 csgb 效率, 封锁必须与局部麻醉剂一起应用, 每天一次或两次, 为期数周, 从而在生成动物模型以研究这一技术时构成挑战。为了解决这一限制, 在之前的一项研究中, 我们开发了一个犬类模型, 长期增加了口腔面部区域的血液流动。该模型是通过注入99.5% 乙醇来执行 csgb 生成的。我们用激光多普勒血流测量和红外热像仪每周评估口腔黏膜血流和鼻皮肤温度, 为期12周。我们发现, 在这个模型中, 口腔面部区域的血液流动增加了7-10周。

在本研究中, 我们评估了乙醇诱导的 csgb 对神经再生的影响。
pga-c 管被植入左边的 ian 有10毫米缝隙的猎狗体内。一周后, csgb 通过注射乙醇进行。手术三个月后, 我们进行了各种电生理、组织学和形态学研究, 以评估 csgb 对神经再生的影响。我们提供了一个详细的协议, 用于利用 pga-c 管和乙醇诱导的 csgb 重建。

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研究方案

这项研究是根据《动物护理和使用指导原则》进行的, 并得到京都大学动物研究委员会的批准 (日本京都; 授权号: r-16-16)。为尽量减少动物痛苦, 我们尽了一切努力, 本报告的所有章节都遵守《动物研究:活体实验报告》的准则。

1. pga-c 管的制造

  1. 要通过可吸收的聚乙酸 (pga) 管制造人工神经导管, 请使用装有48个主轴和 5个 pga 纤维的管状编织机, 该编织机由26个细丝束组成 (图 1)18。
  2. 要使 pga 管表面亲水, 请将其暴露在等离子体放电中。
  3. 在盐酸溶液 7中使用1% 的胶原蛋白。
    注: 通过酶治疗从猪皮肤中提取维洛氏菌, 并接受病毒检查。它主要由 i 型 (70-80%) 和 iii 型胶原蛋白组成, 其比例在其他地方有详细说明 7.在100毫升盐酸溶液 (ph = 3.0) 中溶解1克胶原蛋白, 制备胶原蛋白溶液。由于盐酸溶液的密度约为 1.0, 胶原蛋白浓度接近1%。
  4. 将其反复浸入1% 的盐酸胶原蛋白溶液中, 每次 5秒, 将其涂上胶原蛋白层, 将其涂上胶原蛋白层。
    1. 浸渍后, 在室温下在干净的长凳上擦干管子。确保管完全干燥后进行下一次浸渍 (空气干燥约 6小时)。
    2. 重复涂装工艺10次。
  5. 将 pga-c 管置于 140°c, 真空 (脱氢处理) 下 24小时, 以控制胶原蛋白分子的生物吸收和交联。在无菌条件下执行整个过程。
    注: 此过程生成一个直径为14毫米、内径为3毫米、壁厚为50μm 的管。

2. 手术程序设置

  1. 使用体重9.0 至13.0 公斤的成年雄性猎狗。
    1. 将动物关在单独的笼子里, 在可控的狗窝条件下 (12小时的光和暗周期)。
    2. 提供固体食物和水.
  2. 称重猎狗。
  3. 高压灭菌器所有手术器械。
  4. 使用80% 的乙醇溶液对操作环境的所有表面进行消毒和消毒。丢弃使用过的手套。
  5. 进行手术洗手。
  6. 戴上新的面罩、长袍和无菌手套。

3. 麻醉和皮肤准备

  1. 用肌内注射将狗与 5 mg/kg kg 盐酸氯胺酮和 1 mg/kg xylazine 混合麻醉。
  2. 插管由直径7.5 毫米、长25厘米的气管管。
  3. 将狗放在右侧的侧向位置。用3.2% 的氧 (1.0 lmmin) 维持全身麻醉。
  4. 使用加热垫将体温保持在37°c。
  5. 在眼睛的前表面涂上眼胶, 以避免角膜擦伤。
  6. 使用手术剪子小心地剃须手术领域 (左侧胸部区域)。在手术部位喷洒大量的酒精溶液。等待至少 15秒. 重复应用程序3次。
  7. 记录手术过程中的心率和氧饱和度。

4. pga-c 管下肺泡神经重建: 仅重建模型的发展

  1. 使用 27 g 针向左下颌骨牙龈注射3% 的1% 利多卡因, 作为局部麻醉和镇痛。
  2. 在左下颌骨牙龈处使用15刀刀片进行5厘米的横向切口, 以暴露动物的下颌骨。
  3. 使用压电超声振动研磨下颌骨的近端方面到一个3厘米 x8 毫米矩形通过后部的心理孔。
    注: 振动频率为 28\ u2012 32 khz。
  4. 取下下颌骨骨板的正面部分 (尺寸, 3 厘米 x8 mm), 露出左 ian (图 2a)18。
    注: 重建点对应于第一磨牙的根尖
  5. 用手术刀将 ian 分割, 以去除10毫米段。
  6. 将被切断神经的近端和远端树桩插入神经管的深度为2毫米。
  7. 使用8-0 尼龙缝合线和手术显微镜在8x 放大倍率缝合管的近端和远端神经端 (图 2b)18。
  8. 将骨板返回到下颌骨的原始部位。
  9. 用4-0 尼龙缝线缝合伤口。
  10. 手术后的一天, 确认下颌骨骨板处于适当位置。
    1. 4.10.1 在麻醉下对面部骨进行计算机断层扫描 (ct) 成像。设置 ct 参数如下: 120 kvp, 200 ma, 0.5 mm s, 0.5 毫米切片厚度。
      1. 使用 5 mg/kg 盐酸氯胺酮和 1 mg/kg xylazine 的混合物进行麻醉 (图 3)。
  11. 在手术后一周内使用氨基青霉素 (100 mg4天) 作为抗生素和对乙酰氨基酚 (100 mg") 作为镇痛药。

5. 乙醇诱导的 csgb: 重建 + csgb 模型的发展

  1. 按照第4节所述进行 ian 重建, 并允许一周的恢复时间。
  2. 用1.5% 七氟醚在氧气 (4 lmmin) 和空气 (6 lp min) 中对动物进行麻醉。沙口和清洁预期的手术领域, 如第3节所述。
  3. 用手术皮肤标记标记切口线, 在左侧胸部区域画一条线 (图 4, 切口线的长度为20厘米)。
  4. 使用 21 g 针将1% 利多卡因注入5毫升, 作为局部麻醉和镇痛。
  5. 用10号手术刀刀片切开左侧胸部皮肤。
  6. 用电动手术刀切开脂肪层, 以暴露肌肉筋膜。
  7. 暴露腹侧肌肉和鳞片肌。
  8. 将腹侧肌肉和鳞片肌从腹侧抬起到背侧, 露出第二和第三肋骨 (图 5)。
  9. 在第二和第三肋间空间进行左侧开胸手术, 以暴露左颈椎交感神经节 (图 6)。
  10. 在直接显化的情况下, 用 30 g 针将99.5% 乙醇注入宫颈交感神经节0.2 毫升 (图 7)。
  11. 用中断的1-0 可吸收缝线关闭肋间空间。
  12. 用中断的3-0 尼龙缝线缝合皮肤。
  13. 在手术后一周内使用氨基青霉素 (100 mg4天) 作为抗生素和对乙酰氨基酚 (100 mg") 作为镇痛药。
  14. 在 csgb 后 1周, 用红外热像仪测量面部皮肤温度, 以确认 csgb。

6. 电生理记录

  1. 为了测量重建三个月后的感觉神经动作电位 (snap) 和感觉神经传导速度 (scv), 如第3节所述, 麻醉动物。
    注: 应在两个治疗组的每只狗的实验和正常控制侧测量 snap 和 scv。
  2. 用10号手术刀刀片在左下颌骨牙龈处做一个切口。
  3. 小心切除下颌骨骨板, 避免对再生神经造成身体伤害。
  4. 使用一对针电极刺激 ian, 以记录 snap 和 scv。
    1. 插入神经导管附近的电极。
    2. 应用10-kHz 电刺激20次。
  5. 分析结果。
    1. 通过计算电刺激的平均响应振幅来确定 snap。
    2. 测量图表录制的峰值延迟和峰值振幅。
    3. 用以下公式计算恢复指数: 仅重建的左 ian 的峰值振幅或重建 + 正常控制的 csgb 组/峰值振幅 (仅重建组中右 ian 的中心段)19 ,20。

7. 组织学分析

  1. 节准备
    1. 重建三个月后, 收获左 ian, 包括重建地点两侧1厘米的神经。
    2. 收获的权利 ian 在与收获地点相对于左侧的水平。
    3. 将收获的神经浸泡在0.1m 的仙人掌缓冲液 (ph 7.4、48°c、24h) 中, 将其浸泡在2.5% 的戊二醛中, 对收获的神经进行前缀。
    4. 在 0.1 m 磷酸盐缓冲液 (ph 7.4, 2小时) 中使用2% 的四氧化铬溶液 (48°c, 4小时) 和氰化铁钾的后置。
    5. 用一系列分级乙醇溶液使神经脱水。
    6. 嵌入环氧树脂 (石蜡)。
    7. 以 0.5\ u2012 1.0 微米的厚度对试样进行分割。
  2. 甲苯胺蓝染色及形态分析
    1. 用甲苯胺蓝色溶液染色切片。
    2. 使用光学显微镜获取显微镜图像, 在样品沿以下区域的400X 放大倍率: 左 ian, 再生段的中心和2毫米的远端树桩;右 ian, 与左侧收获地点相对应的 ian 段的中心。
    3. 选择具有再生神经纤维的所有区域的图像。
      1. 随机选择 8\ u2012 10个包含再生神经纤维的100μmx100μm 区域。
      2. 使用适当的软件进行形态分析, 以测量以下参数: 髓鞘神经纤维直径 (μm) 和密度 (计数面积)、神经组织百分比和 g 比 (髓鞘轴突髓神经纤维直径).
  3. 免疫染色
    1. 遵循石蜡切片染色的标准协议。
    2. 在25°c 条件下使用原代抗体孵化30分钟。
    3. 在25°c 时用磷酸盐缓冲盐水清洗3次。
    4. 在25°c 时, 用标记为角质过氧化物酶的二级抗体进行2013年度的培养。
    5. 使用光学显微镜获取图像。
  4. 透射电子显微镜 (tem)
    1. 按照步骤7.1 中的说明准备神经。
    2. 使用超微体, 在 70\ u2012 90μm 的厚度下的截面神经。
    3. 污渍部分与雷诺尔德的铅柠檬酸和尿。
    4. 透射电子显微镜检查和成像。

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结果

我们观察到, 在左 csgb 后 1周, 被阻塞一侧的面部皮肤温度增加 (图 8)。

重建后 3个月, 重建区的 pga-c 管被吸收, 下肺泡神经再生在重建和重建 + csgb 群 (图 9a, b)18中观察到。

snap 在重建 + csgb 和仅重建组的重?...

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讨论

我们提出了一种有效的方法, 以共同作用, 生物可吸收的神经管结合乙醇诱导的 csgb, 进行 ian 再生。在这项研究中, 我们使用了狗, 因为其他动物模型, 如老鼠、老鼠和兔子, 预期寿命短, 身体体积小, 因此不能用来进行精确的外科手术。由于 ian 位于下颌骨周围的下颌骨管内, 因此在进行神经重建时, 需要一种手术技术来避免神经和血管损伤。这个程序的一个重要的技术提示是小心地取出下颌骨骨板, ?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了京都大学前沿医学研究所生物人工器官系的支持。我们要感谢前沿医学研究所的兽医工作人员。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
NMP Collagen PSNippon Meatpackers301-84621Atelocollagen extracted from young porcine skin by enzyme treatment
Surgical clippersRoboz Surgical Instrument CompanyRC-5903
Disposable scalpel (No.15)Kai medical219ABBZX00073000
VarioSurg3NakanishiVS3-LED-HPSC, E1133Piezoelectric surgery for bone processing
4-0 nylon suturesEthicon8881H
8-0 nylon suturesEthicon2775G
Isepamicin sulfateNichi-Iko620005641
Disposable scalpel (No.10)Kai medical219ABBZX00073000
30-gauge needleNipro1134
1-0 absorbable stitchesEthiconJ347H
3-0 Nylon stitchesEthicon8872H
Neo ThermoNEC AvioTVS-700Infrared thermography 
Neuropack ΣNIHON KOHDENMEB-5504Orthodromic recorder for electrophysiological recording
Toluidine BlueSigma-AldrichT3260-5G
Light microscopeKeyenceBZ-9000
Mouse anti-human neurofilament protein monoclonal antibodyDAKON1591
Polyclonal rabbit anti-S100 antibodyDAKOZ0311
Transmission electron microscopyHitachi High TechnologiesHitachi H-7000
Dynamic cell countKeyenceBZ-H1CSoftware for morphological evaluation

参考文献

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