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Resumo

Avaliamos o efeito do bloqueio do gânglio simpático cervical na reparação do nervo usando conduítes de nervo artificial. Cães beagle macho cada implantaram um nervo artificial através de uma abertura de 10 mm no nervo alveolar inferior esquerdo; gânglio simpático cervical esquerdo foi bloqueado pela injeção de etanol 99,5% através de toracotomia lateral.

Resumo

Poliglicólico tubos de colágeno ácido (PGA-C) são tubos de bio-absorvíveis nervo repleto de colágeno de estrutura multi-câmara, que consistem de películas finas de colágeno. Foram alcançados resultados clínicos favoráveis ao usar estes tubos para o tratamento do nervo alveolar inferior danificado (IAN). Um fator crítico para a regeneração do nervo sucesso utilizando tubos de PGA-C é o fornecimento de sangue para o tecido circundante. Bloqueio do gânglio simpático cervical (CSGB) cria um bloqueio simpático na região da cabeça e pescoço, aumentando assim o fluxo sanguíneo na área. Para garantir um efeito adequado, o bloqueio deve ser administrado com anestésicos locais uma a duas vezes por dia durante várias semanas consecutivas; Isso coloca um desafio ao criar modelos animais para investigar esta técnica. Para resolver essa limitação, desenvolvemos um CSGB induzida por etanol em um modelo canino de longo prazo aumento do fluxo sanguíneo na região orofacial. Nós examinamos se regeneração IAN através de implantação de tubo de PGA-C pode ser reforçada por este modelo. Catorze Beagles cada um foram implantados com um tubo de PGA-C através de uma abertura de 10 mm em IAN a esquerda. O IAN está localizado dentro do canal mandibular, cercado por osso, portanto optamos por cirurgia piezoeléctrica, consistindo de ondas ultra-sônicas, para processamento de osso, a fim de minimizar o risco de lesão do nervo e dos vasos. Com esta abordagem, obteve-se um bom resultado cirúrgico. Uma semana após a cirurgia, sete destes cães foram submetidas à esquerda CSGB por injeção de etanol. Induzida por etanol CSGB resultou na regeneração nervosa melhorada, sugerindo que o aumento do fluxo sanguíneo efetivamente promove a regeneração do nervo em defeitos do IAN. Este modelo canino pode contribuir para futuras pesquisas sobre os efeitos a longo prazo da CSGB.

Introdução

Em muitos casos, lesão traumática do nervo alveolar inferior (IAN) é iatrogênica, sendo frequentemente causada pela extração do terceiro molar ou a colocação de implantes dentários1,2,3. Lesão de IAN pode levar a déficits em térmica e toque sensações bem como parestesia, disestesia, hipoestesia e alodinia. Lesão do nervo é tratada não só pela terapia conservadora, mas também por outros métodos, incluindo a sutura e colocação de auto-enxerto. No entanto, esses métodos têm desvantagens, que muitas vezes incluem a falta de melhoria do sintoma e defeitos neurológicos no doador local4,5,6.

O nervo artificial — polyglycolic tubo de ácido-colágeno (PGA-C) foi originalmente desenvolvido no Japão. É um tubo bio-absorvíveis com seu lúmen interno preenchido com um espongiforme colágeno7. Em experimentos com animais, este tubo foi usado para melhorar a regeneração nervosa em cães beagle com defeito do nervo fibular e foi mostrado para promover maior nível de recuperação que o transplante de nervo autólogo8. A aplicação clínica do PGA-C tubo começou em 2002, em pacientes com lesões de nervo periférico. Além disso, os resultados clínicos favoráveis foram obtidos no tratamento da neuropatia trigeminal (IAN e nervo lingual)9,10,11. Um fator crítico para a regeneração do nervo bem sucedida utilizando tubos de PGA-C é o fornecimento de sangue para o tecido circundante8. Bloqueio do gânglio simpático cervical (CSGB) cria um bloqueio simpático na região da cabeça e pescoço e aumenta o fluxo de sangue para a respectiva área inervado12; assim, ela tem sido usada no tratamento da síndrome da dor regional complexa e insuficiência circulatória13,14,15. No entanto, houve apenas algumas investigações experimentais sobre a eficácia de CSGB no sangue crescente fluxo de16,17. Para assegurar a adequada eficiência CSGB, o bloqueio deve ser aplicado em conjunto com anestésicos locais, uma vez ou duas vezes diariamente por várias semanas, posando, portanto, um desafio ao gerar modelos animais para investigar esta técnica. Para resolver essa limitação, em um estudo anterior, desenvolvemos um modelo canino de longo prazo aumento do fluxo sanguíneo na região orofacial18. O modelo foi gerado através da realização de um CSGB pela injeção de etanol 99,5%. Avaliamos o fluxo sanguíneo da mucosa oral e a temperatura da pele nasal pelo laser Doppler flowmetry e termografia infravermelha uma vez por semana durante 12 semanas. Nós achamos que o fluxo de sangue da região orofacial foi aumentado para 7-10 semanas neste modelo.

No presente estudo, foram avaliados os efeitos da CSGB induzida pelo etanol na regeneração do nervo.
O tubo de PGA-C foi implantado em cães beagle através de uma abertura de 10 mm em IAN a esquerda. Uma semana depois, CSGB foi realizada através da injeção de etanol. Três meses após a cirurgia, realizamos uma variedade de Estudos eletrofisiológicos, histológicas e morfológicas para avaliar os efeitos da CSGB na regeneração do nervo. Nós fornecemos um protocolo detalhado para reconstrução de IAN usando um tubo de PGA-C e CSGB induzida pelo etanol.

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Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios orientadores para o cuidado e o uso de animais e aprovado pelo Comitê de pesquisa Animal da Universidade de Kyoto (Kyoto, Japão: número de autorização: R-16-16). Foram envidados todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais, e todas as seções deste relatório aderirem ao chegarem (pesquisa Animal: relato de experimentos in Vivo ) orientações.

1. a fabricação do tubo PGA-C

  1. Para fabricar o conduíte de nervo artificial por meio de um tubo de (PGA) ácido poliglicólico absorvível, use uma máquina de trança tubular equipada com 48 fusos e cinco fibras de PGA, compostas por feixes de 26 filamentos (Figura 1)18.
  2. Para renderizar a superfície do tubo de PGA hidrofílico, expô-lo a uma descarga de plasma.
  3. Use 1% v/w clareando em cloridrato solução7.
    Nota: Clareando é extraído da pele de suínos através do tratamento de enzima e submetido a uma verificação de vírus. Ele principalmente consiste de tipo I (70 a 80%) e tipo colágeno III, a relação do que é descrita em detalhes em outro lugar7. Preparar a solução de colágeno, dissolvendo o colágeno 1 g em 100 mL de solução de cloridrato (pH = 3,0). Desde que a densidade da solução de cloridrato é aproximadamente 1.0, a concentração de colágeno w/w é quase 1%.
  4. Revestir o tubo com as camadas de colágeno pelo repetidamente, mergulhando-o na solução de cloridrato de colágeno de 1% para 5 s de cada vez.
    1. Após a imersão, seque o tubo sobre uma bancada limpa, à temperatura ambiente. Execute mergulhando próximo depois de se assegurar que o tubo está completamente seco (cerca de 6 h para secagem ao ar).
    2. Repita o processo de revestimento de 10 vezes.
  5. Submeta o tubo PGA-C a 140 ° C por 24 h sob vácuo (tratamento dehydrothermal), a fim de controlar a bio-absorção e reticulação das moléculas de colágeno. Execute todo o processo sob condições assépticas.
    Nota: Este procedimento gera um tubo de comprimento final 14-mm, 3 mm diâmetro interno e 50 μm espessura de parede.

2. ato cirúrgico set-up

  1. Uso adultos masculinos beagles pesando 9.0 para 13,0 kg.
    1. Animais de casa em gaiolas separadas, sob condições controladas de canil (ciclo de 12 h claro e escuro).
    2. Fornecer alimento sólido e água ad libitum.
  2. Pese os beagles.
  3. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos.
  4. Use luvas esterilizadas e desinfetar todas as superfícies do cenário operacional com uma solução de etanol 80%. Descarte as luvas usadas.
  5. Realize a lavagem das mãos cirúrgica.
  6. Põe uma máscara fresca, vestido e luvas estéreis.

3. anestesia e preparação da pele

  1. Anestesia o cão com uma mistura de cloridrato de cetamina 5 mg/kg e 1 mg/kg de xilazina por uma injeção intramuscular.
  2. Entubá-la por um tubo endotraqueal de 7,5 mm de diâmetro e 25 cm de comprimento.
  3. Coloque o cão na posição de lateral direito. Manter a anestesia geral com sevoflurano 3,2% com oxigênio (1,0 L/min).
  4. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo em 37 ° C.
  5. Aplique um gel oftálmico sobre a superfície anterior dos olhos para evitar abrasão corneal.
  6. Cuidadosamente raspe o campo cirúrgico (área do peito do lado esquerdo), usando a tesoura cirúrgica. Pulverize uma quantidade substancial de solução alcoólica sobre local da operação. Espere pelo menos 15 SEC. Repita a aplicação 3 vezes.
  7. Registre a frequência cardíaca e saturação de oxigênio durante a cirurgia.

4. inferior Alveolar nervo reconstrução usando PGA-C tubo: desenvolvimento do modelo somente reconstrução

  1. Injete 3 mL de lidocaína a 1% usando uma agulha 27G para a gengiva mandibular esquerda como um anestésico local e analgésico.
  2. Realize uma incisão transversal de 5cm com uma lâmina de bisturi número 15 na gengiva mandibular esquerda, para expor as mandíbulas do animal.
  3. Use piezoelétricas vibrações ultra-sônicas para moer o aspecto proximal da mandíbula em um retângulo de 8 mm × 3cm através do forame mental posterior.
    Nota: A frequência de vibração foi 28 \u2012 32 kHz.
  4. Remova a parte frontal da placa óssea mandibular (dimensões, 3 cm × 8 mm) para expor o esquerdo de IAN (Figura 2A)18.
    Nota: O site de reconstrução corresponde ao ápice radicular do primeiro molar
  5. Transecto o IAN com um bisturi para remover um segmento de 10 mm.
  6. Insira os cotos proximais e distais do nervo cortado o nervo a uma profundidade de 2 mm.
  7. Usar suturas de nylon de 8-0 e termina de um microscópio cirúrgico na ampliação de X 8 para suturar o tubo ao nervo proximal e distal (Figura 2B)18.
  8. Retorne a placa óssea para seu local original, na mandíbula.
  9. Feche a ferida com pontos de nylon 4-0.
  10. Um dia após a cirurgia, confirme se a placa óssea mandibular está na posição adequada.
    1. 4.10.1 Execute imagem computadorizada (TC) do osso facial sob anestesia. Definir parâmetros de CT da seguinte forma: 120 kVp, 200 mAs, 0.5 mm/s, fatia de 0,5 mm de espessura.
      1. Administre anestesia usando uma mistura de 5 mg/kg quetamina cloridrato e 1 mg/kg xilazina (Figura 3).
  11. Administre ampicilina (100 mg/dia) como um antibiótico e paracetamol (100 mg/dia) como um analgésico durante uma semana após a cirurgia.

5. induzida pelo etanol CSGB: desenvolvimento da reconstrução + modelo CSGB

  1. Realizar a reconstrução de IAN, conforme descrito na seção 4 e permitir que uma semana para recuperação.
  2. Anestesia o animal com 1,5% de sevoflurano em oxigênio (4 L/min) e ar (6 L/min). Raspar e limpar o campo cirúrgico pretendido, conforme descrito na seção 3.
  3. Marcar a linha de incisão com um marcador de pele cirúrgico desenhando uma linha na área do peito do lado esquerdo (Figura 4, a incisão é de 20 cm de comprimento).
  4. Injete 5 mL de lidocaína a 1% usando uma agulha 21G à área lado esquerdo do peito como um anestésico local e analgésico.
  5. Faça uma incisão na pele do peito lado esquerdo com uma lâmina de bisturi n º 10.
  6. Incise a camada de gordura com um bisturi elétrico para expor a fáscia muscular.
  7. Expor o serratus ventralis muscular e músculo escaleno.
  8. Levante o serratus ventralis muscular e músculo escaleno de ventral para dorsal para expor as segunda e terceiros costelas (Figura 5).
  9. Realize uma toracotomia lateral esquerda no segundo e terceiro espaço intercostal para expor o gânglio simpático cervical esquerdo (Figura 6).
  10. 0,2 mL de etanol 99,5% injete o gânglio simpático cervical, usando uma agulha 30G sob visualização directa (Figura 7).
  11. Feche o espaço intercostal com pontos absorvíveis interrompido 1-0.
  12. Feche a pele com pontos de nylon 3-0 interrompido.
  13. Administre ampicilina (100 mg/dia) como um antibiótico e paracetamol (100 mg/dia) como um analgésico durante uma semana após a cirurgia.
  14. Em 1 semana após CSGB, medir a temperatura de pele facial com termografia infravermelha para confirmar o CSGB.

6. eletrofisiológicas gravações

  1. Para medir o potencial de ação do nervo sensorial (SNAP) e velocidade de condução do nervo sensorial (SCV) do IAN três meses após a reconstrução, anestesia animais conforme descrito na seção 3.
    Nota: O SNAP e SCV devem ser medida em ambos os lados do controle experimental e normal para cada cão em ambos os grupos de tratamento.
  2. Fazer uma incisão na gengiva mandibular esquerda com uma lâmina de bisturi n º 10.
  3. Remova cuidadosamente a placa óssea mandibular para evitar danificar fisicamente o nervo regenerado.
  4. Estimule o IAN usando um par de eletrodos de agulha, para registrar o SNAP e SCV.
    1. Inserir os eletrodos proximalmente para a canalização de nervo.
    2. Aplica o estímulo eléctrico de 10-kHz 20 vezes.
  5. Analise os resultados.
    1. Determine o SNAP calculando a amplitude média de resposta à estimulação elétrica.
    2. Medir a latência de pico e a amplitude de pico das gravações gráfico.
    3. Calcular o índice de recuperação com a seguinte equação: amplitude de pico de IAN esquerdo da reconstrução somente ou reconstrução + CSGB group / pico de amplitude do controle normal (segmento central de certo IAN no grupo somente reconstrução)19 ,20.

7. histológica análise

  1. Seção de preparação
    1. Três meses após a reconstrução, colha o IAN esquerdo, incluindo a 1 cm do nervo em ambos os lados do site reconstruído.
    2. O IAN certo no nível correspondente ao site colheita no lado esquerdo da colheita.
    3. Prefixar os nervos colhidos por imersão em glutaraldeído 2,5% em uma solução 0,1 M de tampão cacodylate (pH 7,4, 48 ° C, 24h).
    4. O postfix com 2% de solução de tetróxido de ósmio (48 ° C, 4 h) e ferrocianeto de potássio em solução de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4, h 2).
    5. Desidrate os nervos com uma série de soluções de etanol classificados.
    6. Incorpore em resina epóxi (parafina).
    7. Seção dos espécimes em uma espessura de 0.5 \u2012 1,0 μm.
  2. Azul de toluidina análise morfológica e coloração
    1. Mancha de seções com solução de azul de toluidina.
    2. Obter imagens de microscopia, usando um microscópio óptico, ampliação de 400 X nas seguintes regiões ao longo das amostras: deixou o IAN, o centro do segmento regenerado e 2mm distalmente ao tronco; Certo, IAN, o centro do segmento de IAN correspondente para o local de colheita no lado esquerdo.
    3. Selecione imagens de todas as regiões com regenerada fibras nervosas.
      1. Selecionar aleatoriamente 8 \u2012 10 áreas de 100 μm × 100 μm contendo regenerado fibras nervosas.
      2. Executar análise morfológica, usando um software apropriado para medir os seguintes parâmetros: diâmetro fibras mielinizadas do nervo (μm) e densidade (contagem/área), nervo porcentagem de tecido e G-ratio (dendritos axônio mielinizadas/diâmetro da fibra do nervo diâmetro ).
  3. Immunostaining
    1. Segui protocolos padrão para coloração de seção de parafina.
    2. Incube com anticorpos primários por 30 min a 25 ° C.
    3. Lavar com tampão fosfato salino 3 vezes a 25 ° C.
    4. Incube com anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano por 30 min a 25 ° C.
    5. Obter imagens usando um microscópio de luz.
  4. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
    1. Prepare os nervos, conforme descrito no passo 7.1.
    2. Nervos de seção em uma espessura de 70 μm 90 \u2012 usando um ultramicrotome.
    3. Mancha de seções com citrato de chumbo de Reynold e uranilo.
    4. Examinar e imagem por microscopia eletrônica de transmissão.

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Resultados

Observamos um aumento da temperatura da pele facial do lado bloqueado 1 semana após o CSGB esquerdo (Figura 8).

Na pós-reconstrução 3 meses, foi absorvido no tubo de PGA-C na área de reconstrução e regeneração do nervo alveolar inferior foi observada na reconstrução somente e reconstrução + CSGB grupos (Figura 9A, B)18

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Discussão

Apresentamos um método eficiente para regeneração de IAN usando um tubo de nervo bioabsorvível em combinação com CSGB induzida pelo etanol. Para este estudo foi utilizado os cães, desde outros modelos animais, como ratos, ratos e coelhos, têm uma esperança de vida curta e tamanho de corpo pequeno e portanto, não podem ser usados para executar os procedimentos cirúrgicos precisos. Como o IAN está localizado dentro do canal mandibular, cercado por osso, uma técnica cirúrgica é necessária para evitar dano do...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo departamento de órgãos Bioartificial em Kyoto University Institute para a ciência médica de fronteira. Gostaríamos de agradecer ao pessoal veterinário do Instituto de ciência médica de fronteira.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
NMP Collagen PSNippon Meatpackers301-84621Atelocollagen extracted from young porcine skin by enzyme treatment
Surgical clippersRoboz Surgical Instrument CompanyRC-5903
Disposable scalpel (No.15)Kai medical219ABBZX00073000
VarioSurg3NakanishiVS3-LED-HPSC, E1133Piezoelectric surgery for bone processing
4-0 nylon suturesEthicon8881H
8-0 nylon suturesEthicon2775G
Isepamicin sulfateNichi-Iko620005641
Disposable scalpel (No.10)Kai medical219ABBZX00073000
30-gauge needleNipro1134
1-0 absorbable stitchesEthiconJ347H
3-0 Nylon stitchesEthicon8872H
Neo ThermoNEC AvioTVS-700Infrared thermography 
Neuropack ΣNIHON KOHDENMEB-5504Orthodromic recorder for electrophysiological recording
Toluidine BlueSigma-AldrichT3260-5G
Light microscopeKeyenceBZ-9000
Mouse anti-human neurofilament protein monoclonal antibodyDAKON1591
Polyclonal rabbit anti-S100 antibodyDAKOZ0311
Transmission electron microscopyHitachi High TechnologiesHitachi H-7000
Dynamic cell countKeyenceBZ-H1CSoftware for morphological evaluation

Referências

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