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要約

人工神経管を用いた神経修復に及ぼす頸部交感神経節ブロックを行った。雄性ビーグル成犬それぞれ移植された人工神経と左の下歯槽神経; で 10 mm のギャップの間で左頸部交感神経節を注入することによりブロックされた側方開胸で 99.5% エタノール。

要約

ポリグ リコール酸コラーゲン (PGA C) 管は、薄いコラーゲンの膜で構成される複室構造のコラーゲン生体吸収性神経管です。破損した下歯槽神経 (IAN) の治療のためのこれらの管を使用する場合は、良好な臨床結果を実現しています。PGA C チューブを使用して成功した神経の再生の重要な要因は、周囲の組織への血液供給です。頸部交感神経節ブロック (CSGB) は、エリア内の血流が増えて頭頸部領域の交感神経ブロックを作成します。十分な効果を確保するため、封鎖する必要があります、管理局所麻酔薬 1 ~ 2 回いくつかの連続した週間日この手法を調査するための動物モデルを作成する場合、問題が生じます。この制限に対処するため、長期的な口腔顔面領域の血流増加の犬モデルにおけるエタノール誘発性 CSGB を開発しました。このモデルによって PGA C 管打込みによりイアン ・再生を高めることができるかどうかを検討しました。14 ビーグル犬それぞれが左のイアンの 10 mm ギャップ間で PGA C 管と移植されました。イアンは骨に囲まれた下顎管内にある、したがって我々 は神経や血管の損傷のリスクを最小限にするために超音波骨処理から成る圧電手術を選んだ。この方法良い手術結果が得られました。手術後、1 週間これらの犬の 7 つを受けた左 CSGB エタノールの注入による。エタノール誘発 CSGB 結果改善された神経再生、血流量の増加が効果的にイアン ・欠陥で神経再生を促進することを示唆しています。この犬のモデルは、CSGB の長期効果の更なる研究に貢献できます。

概要

下歯槽神経 (IAN) の外傷は、多くの場合、医原性、頻繁に第 3 大臼歯の抽出または歯科インプラント1,2,3の配置によって引き起こされています。イアンの傷害は熱で赤字につながるし、感覚知覚、感覚、感覚鈍麻、アロディニアをタッチできます。神経損傷は、保存的治療のみならず他のメソッド、縫合を含む自家配置によっても扱われます。ただし、これらのメソッドには、しばしば症状の改善とドナー サイト4,5,6時神経学的欠陥の欠如が含まれての欠点があります。

人工神経-ポリグ リコール酸コラーゲン (PGA C) 管はもともと日本で開発されました。生体吸収性海綿状コラーゲン7でいっぱいの内部ルーメン チューブです。動物実験で、このチューブは腓骨神経欠陥、ビーグル犬における神経再生を高めるために使用された、自家神経移植8よりも回復の高いレベルを促進するために示されていた。C PGA チューブの臨床応用は、患者末梢神経損傷で 2002 年に始まった。さらに、三叉神経障害 (イアンおよび舌神経)9,10,11の治療に良好な臨床結果を実現しています。正常な神経再生 PGA C チューブを使用しての重要な要因は周囲組織8への血液供給です。頸部交感神経節ブロック (CSGB) 頭頸部領域の交感神経ブロックを作成し、それぞれの支配領域12; への血流が増加したがって、それは、複合性局所疼痛症候群と循環不全13,14,15の治療に使用されています。しかし、増加血液の流れ16,17CSGB の効果にのみ、いくつか実験的調査があった。適切な CSGB の効率を確保するため封鎖する必要がありますと共に適用する局所麻酔薬を一度か二度毎日数週間、この手法を調査する動物モデルを生成するとき従って挑戦を提起します。以前の研究では、この制限に対処するため長期的な口腔顔面領域18増加血流の犬モデルを開発しました。モデルは注入することにより、CSGB を実行することによって生成された 99.5% エタノール。口腔粘膜血流とレーザードップラーと 12 週間週 1 回赤外線サーモグラフィによる鼻部皮膚温度を評価しています。このモデルでは 7-10 週間の口腔顔面領域の血流が増加したことがわかった。

本研究では神経再生に及ぼすエタノールによる CSGB を評価しました。
PGA C 管は左のイアンの 10 mm のギャップの間でビーグル犬に注入されました。一週間後、エタノールを注入することにより CSGB を行った。術後後 3 か月さまざまな CSGB の神経再生に及ぼす影響を評価するための電気生理学的、組織学的、形態学的研究を行った。イアン ・復興 PGA C チューブと CSGB のエタノールを使用して詳細なプロトコルを提供します。

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プロトコル

本研究はケアと動物の使用のための指針に従って実施され、京都大学動物研究委員会で承認 (京都, 日本; 承認番号: R-16-16)。動物の苦痛を最小限に抑えるために行われたすべての努力と、このレポートのすべてのセクションは、到着に準拠 (動物資源研究領域: in Vivo実験のレポート) のガイドライン。

1. PGA C チューブの作製

  1. 吸収性ポリグ リコール酸 (PGA) 管による人工神経管を作製、48 スピンドル、26 フィラメント (図 1)18の束から成る 5 つの PGA の繊維を搭載した管状の編組機を使用します。
  2. PGA チューブ表面を親水性にレンダリングするには、プラズマ放電を公開します。
  3. 塩酸ソリューション7で 1 %v/w アテロコラーゲンを使用します。
    注: アテロコラーゲンは酵素処理による豚の皮から抽出した、ウイルス チェックを受けます。それは主にから成っているタイプ (70-80%) 私とタイプ III のコラーゲン、比が他の場所で詳細に記載されている7。100 mL の塩酸溶液に 1 g のコラーゲンを溶解することによりコラーゲン溶液を準備 (pH 3.0 を =)。塩酸溶液の密度は、約 1.0 は、w/w コラーゲン濃度は約 1% です。
  4. 5 の 1% コラーゲン塩酸溶液に浸漬して繰り返しによってコラーゲン層チューブをコート s たびに。
    1. 浸漬後、室温でクリーン ベンチの管を乾燥します。チューブが (約 6 常温乾燥用 h) 完全に乾燥を確認した後次浸漬を実行します。
    2. 塗装工程を 10 回繰り返します。
  5. 140 ° C (dehydrothermal 治療)、真空下で 24 時間のバイオ吸収、コラーゲン分子の架橋反応を制御するために PGA C 管を対象します。無菌条件下で全体のプロセスを実行します。
    注: この手順は、肉厚 50 μ m、内径 3 mm、14 mm の最終的な長さのチューブを生成します。

2. 手術のセットアップ

  1. 大人の雄ビーグル犬に 13.0 9.0 kg を使用します。
    1. 家動物別のケージ、犬小屋制御条件 (12 h 明暗サイクル)。
    2. 固形食を提供し、広告自由水します。
  2. ビーグル犬の重量を量る。
  3. オートクレーブすべて手術器具。
  4. 滅菌手袋をドンし、80% エタノール溶液で動作の設定のすべての表面を消毒します。使用される手袋を破棄します。
  5. 手術手洗いを実行します。
  6. 新鮮なマスク、ガウン、滅菌手袋を置きます。

3. 麻酔と皮膚の消毒

  1. 塩酸ケタミン 5 mg/kg ・ 1 mg/kg キシラジンの混合物と犬の筋肉内注射で麻酔します。
  2. 直径 7.5 mm、長さ 25 cm の気管チューブ挿管します。
  3. 右側臥位に犬を配置します。酸素 (1.0 L/分) と 3.2% セボフルラン麻酔を維持します。
  4. 37 ° C の体温を維持するために加熱パッドを使用します。
  5. 角膜上皮剥離を避けるために目の前方の表面にゲル状の目薬を適用します。
  6. 慎重に手術野 (左側胸部領域) 手術のバリカンを使用してひげをそる。手術部位にかなりの量のアルコール溶液をスプレーします。待ち時間少なくとも 15 秒は、アプリケーションを 3 回繰り返します。
  7. 手術中に酸素飽和度と心拍数を記録します。

4. 劣った歯槽神経再建を使用して PGA-C チューブ: 復興専用モデルの開発

  1. 3 mL の 1% リドカイン局所麻酔薬と鎮痛薬として左の下顎の歯肉に 27 G の針を使用して注入します。
  2. 動物の無顎類を公開する、左の下顎歯肉 15 番メス刃で 5 cm の横切開を実行します。
  3. 後部のオトガイ孔を 3 cm × 8 mm 四角形に下顎骨の近位側面を挽く圧電超音波振動を使用します。
    注: 振動周波数は 28 \u2012 32 kHz。
  4. (寸法、3 cm × 8 mm) 左のイアン (図 2 a)18を公開する下顎骨プレートの正面部分を削除します。
    注: 復興サイトは、第一大臼歯の根尖に対応します。
  5. 10 mm のセグメントを削除するメスとイアンを縦断面します。
  6. 切断された神経の近位および遠位切り株を 2 mm の深さに神経管に挿入します。
  7. 8 倍の倍率で近位および遠位神経 (図 2 b) の端18にチューブを縫合を 8-0 ナイロン縫合糸と手術顕微鏡を使用します。
  8. 骨プレートを顎でその元のサイトに戻ります。
  9. 4-0 ナイロン縫合糸で傷口を閉じます。
  10. 手術後 1 日は、下顎骨骨プレートは、適切な位置を確認します。
    1. 4.10.1 麻酔下で顔の骨のコンピューター断層撮影 (CT) 画像を実行します。CT のパラメーターを次のように設定: 120 kVp、200 Ma、0.5 mm/s、0.5 mm スライス厚。
      1. 5 mg/kg ケタミン 1 mg/kg と塩酸キシラジン (図 3) の混合物を使用して麻酔を管理します。
  11. 手術後 1 週間の鎮痛剤としてアセトアミノフェン (100 mg/日) と抗生物質アンピシリン (100 mg/日) を管理します。

5. エタノール誘発 CSGB: 復興 + CSGB モデルの開発

  1. セクション 4 で説明されているようにイアン ・復興を実行し、回復の週をできるように。
  2. 1.5% セボフルラン (4 L/分) の酸素と空気 (6 L/分) で動物を麻酔します。剃るし、セクション 3 で説明するように目的の外科分野をきれい。
  3. 左側の胸の部分に線を描画して切開線外科皮膚マーカーで印をつける (図 4切開線は長さ 20 cm)。
  4. 5 mL の 1% リドカイン局所麻酔薬と鎮痛薬として左側胸部に 21 G の針を使用して注入します。
  5. 10 番のメス刃で左側胸部皮膚を切開します。
  6. 筋膜を公開する電気メスで脂肪層を切開します。
  7. 鋸側筋や斜角筋を公開します。
  8. 鋸側筋と 2 番目と 3 番目の肋骨 (図 5) を公開する背側に腹斜筋を上げます。
  9. 左頸部交感神経節 (図 6) を公開する 2 番目と 3 番目の肋間スペースで左の側方開胸を実行します。
  10. 99.5% エタノール 0.2 mL を直接可視化 (図 7) の下で 30 G の針を用いて子宮頸部交感神経節に注入します。
  11. 中断された 1-0 吸収ステッチで肋を閉じます。
  12. 中断された 3-0 ナイロン糸で皮膚を閉じます。
  13. 手術後 1 週間の鎮痛剤としてアセトアミノフェン (100 mg/日) と抗生物質アンピシリン (100 mg/日) を管理します。
  14. CSGB 後 1 週間で、CSGB を確認する赤外線サーモグラフィによる顔面皮膚温を測定します。

6. 電気生理学的記録

  1. 感覚神経活動電位 (スナップ) および感覚神経伝導速度 (SCV)、イアン ・再建術後後 3 カ月を測定、セクション 3 で説明した動物を麻酔します。
    注: スナップと SCV 両治療群で各犬のため両方の実験そして正常な制御の側面を測定ください。
  2. 数 10 メス刃を持つ左の下顎歯肉に切開を行います。
  3. 再生神経を物理的に損傷を防ぐため下顎骨プレートを慎重に取り外します。
  4. 針電極のペアを使用して、スナップと SCV を記録するイアンを刺激します。
    1. 近位の神経管に電極を挿入します。
    2. 20 倍 10 kHz の電気刺激を適用します。
  5. 結果を分析します。
    1. スナップを電気刺激する平均応答振幅を計算することによって決定します。
    2. ピーク潜時とグラフの録音からピークの振幅を測定します。
    3. 次の方程式で回復指数を計算する: 復興専用の左のイアンのピーク振幅または再構成 + CSGB (復興専用のグループの右のイアンの中心セグメント) の通常のコントロールのグループ/ピーク振幅19 ,20。

7. 組織学的解析

  1. セクションの準備
    1. 再構築後、3 カ月の左のイアンは、再建されたサイトのいずれかの側には神経の 1 cm を含む収穫します。
    2. 左側にある収穫サイトに対応するレベルで右のイアンを収穫します。
    3. 0.1 M cacodylate 緩衝液 (pH 7.4、48 ° C、24 h) 2.5% グルタルアルデヒド浸漬によって収穫された神経をプレフィックスします。
    4. 2% 四酸化オスミウム液 (48 ° C, 4 h) とフェロシアン化カリウム 0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.4, 2 h) 後置します。
    5. 傾斜のエタノール溶液の一連の神経を脱水します。
    6. エポキシ樹脂 (パラフィン) に埋め込みます。
    7. 0.5 \u2012 1.0 μ m の厚さで標本をセクションします。
  2. トルイジン ブルー染色と形態学的解析
    1. トルイジン ブルー溶液でのセクションを染色します。
    2. サンプルに沿って次の地域で 400 倍の倍率で、光学顕微鏡を用いた顕微鏡画像を得る: イアンは、再生成されたセグメントと遠位切り株; に 2 mm の中心を左右のイアンは、左側にある収穫サイトに対応するイアン ・ セグメントの中心。
    3. 神経線維の再生とすべての地域の画像を選択します。
      1. 100 μ m × 100 μ m を含むをランダムに選択 8 \u2012 10 分野には、神経線維が再生成されます。
      2. 以下のパラメーターを測定するための適切なソフトウェアを使用して形態素解析を実行: 有髄神経線維の径 (μ m)、密度 (カウント ・地域)、神経組織の割合と G 比 (有髄軸索直径/有髄神経線維の直径).
  3. 免疫染色
    1. パラフィン セクションを汚すための標準的なプロトコルに従います。
    2. 25 ° C で 30 分間一次抗体とインキュベートします。
    3. 25 ° C で 3 回をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。
    4. 25 ° C で 30 分間西洋ワサビペルオキシダーゼと分類される二次抗体とインキュベートします。
    5. 光学顕微鏡を使用して画像を取得します。
  4. 透過型電子顕微鏡 (TEM)
    1. 手順 7.1 で説明されているように、神経を準備します。
    2. セクション神経をウルトラミクロトームを使用して 70 \u2012 90 μ m の厚さで。
    3. レイノルドの鉛クエン酸とウラニルのセクションを染色します。
    4. 調べるし、透過型電子顕微鏡画像します。

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結果

左の CSGB (図 8) 後 1 週間ブロックされた側の顔の皮膚温度の上昇を見ました。

3 ヵ月後の復興再建領域で PGA C 管がおこった下歯槽神経の再生は、再建だけで観察された、復興 + CSGB グループ (図 9 a, B)18。

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ディスカッション

エタノールによる CSGB との組み合わせで吸収性神経管を用いたイアン ・再生のための効率的な方法を提案する.この研究のため、マウス、ラットおよびウサギ、寿命は短いと小さなボディサイズがあるし、それゆえ、正確な手術を実行する使用ことはできませんように他の動物モデル以来犬を使用しました。イアンは骨に囲まれた下顎管の中に位置し、手術手技は神経再建術を実行するとき?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は京都の人工臓器部によってサポートされていた大学フロンティア医科学研究所。再生医科学研究所の獣医のスタッフに感謝したいと思います。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
NMP Collagen PSNippon Meatpackers301-84621Atelocollagen extracted from young porcine skin by enzyme treatment
Surgical clippersRoboz Surgical Instrument CompanyRC-5903
Disposable scalpel (No.15)Kai medical219ABBZX00073000
VarioSurg3NakanishiVS3-LED-HPSC, E1133Piezoelectric surgery for bone processing
4-0 nylon suturesEthicon8881H
8-0 nylon suturesEthicon2775G
Isepamicin sulfateNichi-Iko620005641
Disposable scalpel (No.10)Kai medical219ABBZX00073000
30-gauge needleNipro1134
1-0 absorbable stitchesEthiconJ347H
3-0 Nylon stitchesEthicon8872H
Neo ThermoNEC AvioTVS-700Infrared thermography 
Neuropack ΣNIHON KOHDENMEB-5504Orthodromic recorder for electrophysiological recording
Toluidine BlueSigma-AldrichT3260-5G
Light microscopeKeyenceBZ-9000
Mouse anti-human neurofilament protein monoclonal antibodyDAKON1591
Polyclonal rabbit anti-S100 antibodyDAKOZ0311
Transmission electron microscopyHitachi High TechnologiesHitachi H-7000
Dynamic cell countKeyenceBZ-H1CSoftware for morphological evaluation

参考文献

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