高通量的高效液氧活化病毒膜融合检测 HIV-1 病毒膜融合抑制剂的研究

摘要

通过流式细胞术或荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达, 我们描述了以细胞为基础的 HIV-1 融合报告。它可以用来测试病毒进入的抑制剂 (特别是在融合步骤) 在无细胞和细胞对细胞感染系统。

摘要

本试验旨在通过流式细胞术或荧光显微镜检测绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达, 具体报告 HIV-1 融合。一个 HIV-1 报告病毒 (HIV-1 地球复兴社区) 是通过插入 recombinase 到 HIV-1 基因组之间的母体和外壳蛋白的 polyprotein。这导致了 recombinase 的包装成病毒微粒, 然后被释放入目标细胞线稳定地表达 recombinase 激活的红色荧光蛋白 (RFP) 到 GFP 交换盒。在基本状态下, 此卡带只表示 RFP。在 recombinase 进入目标细胞后, RFP 由 loxP 站点两侧切除, 导致 GFP 表达。该方法可用于检测无细胞和细胞对细胞感染系统中的任何病毒进入抑制剂 (特别是融合步骤), 并被用来鉴定一类嘌呤受体拮抗剂作为新的 HIV-1 病毒膜融合抑制剂。

引言

新的抗逆转录病毒疗法的需要, 促使开发高通量的屏幕抑制剂的 HIV-1 进入。地球复兴社区报告的研究是为了识别细胞-细胞感染系统融合步骤中病毒进入的抑制剂, 具体测量与宿主细胞膜¹的病毒膜融合。研究了一种新的抑制剂的筛选, 具体表现在 HIV-1 感染的早期阶段, 直至病毒膜融合点。测量细胞感染的一个挑战是最初的接种含有受感染的供体细胞和 ininfected 靶细胞, 因此测量新的感染很难从输入细胞中辨别出来。理想的系统将涉及一个外源基因标记, 可诱导的目标细胞感染的启动, 并没有出现在捐献细胞。一种流行的病毒含量混合检测基于病毒蛋白-酶融合, 砰-Vpr, 可以有效, 但有限制高通量, 细胞筛选²。这种检测包括一个β-酶 (砰) 报告基因, 融合到 HIV-1 Vpr, 包装成病毒, 并交付到靶细胞后, 病毒膜融合。基质 CCF2-AM 被装入靶细胞的细胞质中, 在卵裂时进行荧光转移。CCF2-AM 基板成本高昂, 可用于高吞吐量屏幕。为了区分供体和靶细胞, 有必要对目标种群进行染色标记。最后, 该协议需要几个洗涤和孵化步骤, 这可能是繁重和昂贵的测试大量的化合物。

以地球复兴社区为解决这些问题的方法, 开发了高通量的细胞间融合抑制剂筛选。此系统不需要将基板加载到单元格中。该检测也可用于无细胞研究, 并适用于其他病毒融合研究使用伪类型 HIV-1 地球复兴社区病毒粒子。艾滋病病毒的细胞融合检测可以测量病毒的 HIV-1 蛋白介导的细胞融合, 然而这些不使用实际的病毒粒子作为地球复兴社区的实验^3,4,5。这种检测可以用流式细胞术或荧光显微镜阅读。它已成功地用于筛选 FDA 图书馆以及一个小图书馆的嘌呤抑制剂^1,6。其他调查人员还通过一种经过改进和优化的高通量融合检测发现了 HIV-1 融合中的嘌呤抑制剂, 报告将病毒封装的β-酶转移到细胞质^7、8.

地球复兴社区病毒的设计与 iGFP 病毒类似的方法, 插入 recombinase 之间的基质和衣壳, 两侧由 HIV-1 蛋白酶网站⁹。当 HIV-1 蛋白酶在新生的病毒微粒中激活时, 该酶是作为插入在 polyprotein 中的前驱体而制成的。因此,通过病毒膜融合过程将蛋白酶活化的 HIV-1 粒子的含量传递到目标细胞中, 该方法的交付是依赖的。这里提供了两个版本的协议。首先使用 HIV-1 感染的人群感染靶细胞, 研究 HIV 的直接细胞间传播。第二个版本使用无细胞病毒来研究无细胞病毒感染。细胞对细胞的透射检测需要7天的时间完成从细胞解冻的当天, 或5天, 如果细胞已经解冻和传代。如果细胞需要解冻, 如果细胞解冻和传代, 可以在5天内进行无细胞感染检测。还可以使用 Clevers 实验室¹⁰创建的质粒, 在所需的单元格类型中生成一个 rg (红到绿) 目标单元格线 (如果未使用现有的 rg 目标单元格线)。建议在本试验中采用病毒和病毒表达细胞进行适当的生物安全防护。我们在 BSL2+ 组织培养设施中进行这种检测的传染性部分。细胞固定后, 可在标准流式细胞仪和显微术中进行分析。

在这里, 我们描述了这种检测的应用, 以筛选新的化合物, 抑制 HIV-1 病毒膜融合 (图 1)。嘌呤受体是亲炎症介质。我们的实验室已经证明, 非选择性的嘌呤受体抑制剂作为 HIV-1 病毒膜融合的抑制剂⁶。我们报告说, 这种检测在高通量的利用可以识别新的 HIV-1 病毒膜融合抑制剂。我们证明, 嘌呤类受体抑制剂是一种新型的 HIV-1 病毒膜融合抑制剂。

研究方案

1. 目标细胞线的生成

注意: 此步骤是可选的;如果使用现有的 RG 目标单元格行, 请从步骤2开始。

1. Cotransfect 70% 汇合 10 cm 板293T 细胞¹¹ [在10毫升 Dulbecco 的被改进的老鹰的媒介 (DMEM) 与10% 胎牛血清 (血清)] 与 pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-普洛 WPRE¹⁰和 pCL-10A1¹² (包装质粒) 在一个1:1 比例 (20 µg 总) 使用钙基转染¹³。
2. 收获10毫升的病毒上清 48 h 后转染通过吹打介质从板块成15毫升圆锥管和离心管在 3000 x g 5 摄氏度, 以颗粒任何细胞碎片。
3. 将0.45 µm 过滤器连接到10毫升注射器上。离心后, 取整个上清液并装入注射器。把样品通过进入一个干净的15毫升管。
4. 整除过滤的病毒上清到适当的大小 (通常, 0.5–1毫升整除数)。这些可以立即在下一步使用, 或可以冻结在-80 摄氏度和存储。
5. 使用50–100µL 的病毒上清液感染细胞线的选择, 在一个96井板。文化细胞在37°c 与 5% CO₂。RFP 信号应在24小时内出现在荧光显微镜下 (40X 放大, 532 nm 激发, 588 nm 发射), 但可能需要多达 72 h。
   注意: 在这些实验中, Jurkat 细胞被使用, 但其他类型也可以使用。
6. 通过设置一系列10口井并将嘌呤霉素添加到每个嘌呤霉素, 选择转基因细胞, 将至少1的未处理好的控制 (使用从0.5 µg/毫升到5µg/毫升的浓度范围); 这可能会因每个单元格类型而异)。监测细胞的生存能力 (细胞裂解将发生在没有嘌呤霉素抵抗的细胞中) 在数天的过程中与未经治疗的控制相比, 并使用嘌呤霉素集中, 只有 RFP 表达细胞生存。
   注: 选择在转染细胞存活时 untransfected 细胞被杀死的浓度。
7. 使用单细胞流式细胞仪排序或限制稀释 (见步骤 1.8–1.10), 培养从单细胞¹发展成克隆细胞线 (这可能需要几个星期的成长)。
8. 如果使用稀释方法, 用 hemocytometer 计数细胞, 并将样品稀释到大约500细胞/毫升。
9. 在一个96井板, 吸管50µL 细胞稀释成50µL 媒体 [罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基与10% 血清和2% 青霉素-链霉素, 如果使用 Jurkat 细胞], 并执行1:1 串行稀释到11井, 包含50µL 的媒体。为达到最佳效果, 请至少执行10个复制操作。
10. 通过显微镜 (40X) 在组织培养孵化器 (37 °c 与 5% CO₂) 或大约4周, 监测细胞生长。选择从最低的嘌呤霉素浓度与生长 (如显微镜, 40X) 的克隆文化的文化。
11. 冷冻整除数由离心20毫升的文化 (50万细胞/毫升, 计数与 hemocytometer) 在 800 x g 5 分钟在23°c 和 resuspending 它在500µL 的血清与10% 亚砜。把它放在-80 摄氏度使用一个细胞冻结容器, 然后储存在液氮。

2. 细胞对细胞病毒的传播

1. 靶细胞的制备
   1. 解冻一个500µL 瓶 Jurkat RG 记者细胞通过放置到一个37°c 水浴。将细胞从瓶子中注入10毫升的 RPMI 完全介质, 然后将混合物在 800 x g处离心, 在23摄氏度时为5分钟。并用重悬在一个 T-75 瓶中的20毫升 RPMI 完全培养基中的颗粒。隔夜孵化烧瓶 (37 °c 和 5% CO₂)。
      注: RPMI 完整培养基包含 RPMI 1640, 10% 血清, 2 毫米 l-谷氨酰胺, 100 单位/毫升青霉素, 100 毫克/毫升链霉素。
   2. 第二天, 添加0.5 µg/毫升的嘌呤霉素 (1 µL 2 毫克/毫升的股票每8毫升的媒体)。培养细胞, 保持200,000–800,000 细胞/毫升的密度 (通过hemocytometer 计数)。
   3. 在建立转移化验前的前一天, 将细胞分解为200,000–400,000 细胞/毫升, 在含有0.5 µg/毫升嘌呤霉素的新鲜 RPMI 培养基中。
2. 供体细胞的制备
   1. 解冻 untransduced Jurkat 细胞和培养他们在一个 T-75 瓶与20毫升 RPMI 完全培养基 (如步骤2.1 所述), 保持一个密度的200,000–800,000 细胞/毫升。
   2. 离心750万细胞 (800 x g为5分钟) 和并用重悬他们在120µL 的 nucleofection 溶液 V 与补充 (参见材料表)。将细胞转移到电穿孔试管, 加入4.5 µg 地球复兴社区¹的 DNA。染细胞 (通过以电穿孔为基础的方法, 看到材料表) 使用适当的程序 (如S-18), 然后立即转移到3毫升的 RPMI 培养基 (10% 血清)。
   3. 允许细胞恢复通过孵化他们隔夜在37°c 与 5% CO₂。
   4. 第二天早晨, 离心细胞在 800 x g 5 分钟在23°c 和并用重悬他们在3毫升的 RPMI 完全培养基, 允许他们 2 h 恢复在37°c (5% CO₂), 然后继续进行化验。
3. 共同文化
   1. 用 hemocytometer 计数细胞, 然后向下旋转5万个细胞 (800 x g 5 分钟, 23 °c), 每井 (包括捐献者和靶细胞) 进行测定。Resuspending 1 x 10⁶细胞/毫升在 RPMI 完成没有嘌呤霉素。
   2. 在一个板块, 增加25µL 的捐献细胞悬浮在每个井;在另一个板块中, 添加25µL 的目标细胞。
   3. 对每个井, 添加25µL 的测试化合物稀释在 RPMI 完全培养基在适当的浓度。用该化合物孵育供体和靶细胞30分钟。
      注意: 每一种药物的浓度都会有所不同。如果它有一个已知的 IC₅₀, 使用它作为一个起点, 滴定上面和下面。如果 IC₅₀是未知的, 准备一个200µM 库存的最后浓度为10µM。
   4. 预处理后, 将供体细胞与靶细胞结合, 将一个板块的内容吹打到另一个盘子中, 在37摄氏度的组织培养孵化器中孵化出40小时的细胞, 5% CO₂。
4. 流式细胞仪
   1. 将多聚甲醛 (粉煤灰) 添加到每个井中, 最终浓度为2%。
      注: 对于16% 库存解决方案, 这是14µL 每100µL 井。
   2. 注意: 粉煤灰对暴露的皮肤和眼睛有害。戴上实验室大衣、手套和安全护目镜, 并在安全罩中处理库存解决方案。
   3. 阅读 mCherry 和 FITC 通道的流式细胞仪上的单元格。
      注意: 有可能看到在感染细胞中表达 GFP 以上背景的细胞与5–20%。未感染的细胞。
   4. 通过荧光显微镜 (40X) 在 gfp 特定通道上可视化 gfp 信号 (带有 400 nm 的励磁过滤器和 508 nm 的发射过滤器)。

3. 无细胞病毒感染的替代议定书

1. 靶细胞的制备
   1. 通过放入37°c 水浴, 解冻一个500µL 瓶 Jurkat RG 记者细胞。将细胞从瓶子中注入10毫升的 RPMI 完全培养基, 然后离心 RPMI 完全培养基在 800 x g 5 分钟在23摄氏度。并用重悬在一个 T-75 瓶中的20毫升 RPMI 完全培养基中的颗粒。隔夜孵化烧瓶 (37 °c 和 5% CO₂)。
   2. 第二天, 添加0.5 µg/毫升的嘌呤霉素 (1 µL 2 毫克/毫升的股票每8毫升的媒体)。培养细胞, 保持200,000–800,000 细胞/毫升的密度 (通过hemocytometer 计数)。
   3. 在建立转移化验前的前一天, 将细胞分解为200,000–400,000 细胞/毫升, 在含有0.5 µg/毫升嘌呤霉素的新鲜 RPMI 培养基中。
2. 无细胞病毒的生产
   1. 染70% 汇合 10 cm 板293T 细胞¹¹ (在10毫升 DMEM 与10% 血清) 与5µg 地球复兴社区¹质粒使用钙基转染¹³。
      注: 这一比例将产生10毫升的病毒, 这是足够的约四96井板, 根据效率的转染。
   2. 通过将介质从盘子中吹打到15毫升圆锥管中, 并离心在 3000 x g处为5分钟, 将所有细胞碎片全部切片, 以48小时收割整个病毒上清液。
   3. 将0.45 µm 过滤器连接到10毫升注射器上。离心后, 取整个上清液并装入注射器。把样品通过进入一个干净的15毫升管。
   4. 使用病毒立即感染目标细胞 (步骤 3.3) 或冻结并将病毒存储在-80 摄氏度 (在使用前解冻样品)。
3. 感染
   1. 使用 hemocytometer 计算 RG Jurkat 目标单元格 (从步骤 3.1.3), 并在 800 x g处向下旋转5万个目标单元格5分钟, resuspending 1 x 10⁶细胞/mL 中的细胞, RPMI 完全培养基中没有嘌呤霉素。
   2. 在一个板块, 添加25µL 的 RG Jurkat 目标细胞的每一个井;在一个单独的板块, 添加25µL (2 ng) 病毒每一个井。
   3. 对每一个井, 添加25µL 的测试化合物, 稀释在介质中适当的浓度。用化合物孵育细胞和病毒30分钟。
      注: 测试浓度会因药物而异。如果它有一个已知的 IC₅₀, 使用它作为一个起点, 滴定上面和下面。如果未知, 准备一个200µM 的股票培养基, 最终浓度为10µM。
   4. 预处理后, 将病毒/复合物的全部内容 (50 µL) 从水井添加到目标细胞, 并在37摄氏度与 5% CO₂的组织培养孵化器中孵化一切40小时。
4. 流式细胞仪
   1. 将粉煤灰添加到每个井中, 最终浓度为2%。
      注: 对于16% 库存解决方案, 这是14µL 每100µL 井。
   2. 阅读 mCherry 和 FITC 通道的流式细胞仪上的单元格。gfp 信号也可以通过荧光显微镜在 gfp 通道上进行可视化。
      注: 一旦可以期望看到5–20% 的细胞表达 GFP 以上背景的感染细胞vs。未感染的细胞。

结果

未感染的 RG Jurkat 细胞展示了一个低级别的背景 GFP 信号 (0.3%) 与一个非常强的 RFP 信号 (图 2A, 未感染的专栏)。地球复兴社区的感染导致 GFP 信号 (24.9%) 的增加, 而 HIV-1 融合抑制剂 AMD3100 (20 µM) 的存在抑制了这一信号的发展, 使其下降到未感染的背景水平 (0.34%)。当使用反向转录抑制剂 AZT (2 µM) 的后融合事件抑制剂时, 信号不受显著影响 (23.5%), 表明该?...

讨论

地球复兴社区的实验证明对筛选可能抑制病毒复制融合步骤的药物候选者非常有用。在执行此检测时, 获得良好信号的最重要步骤类似于大多数病毒感染化验。第一个关键步骤是产生高质量的病毒的高滴度。这一步要求293T 细胞频繁传代 (至少每48小时 1x), 这样它们就不会变成 overconfluent 并聚集在一起。此外, 它可能值得尝试不同的转染方法, 因为一些研究人员发现, 磷酸钙转染提供了更好的结果, 而...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).