Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine zellbasierte Assays auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck von grün fluoreszierendes Protein nachweisbar durch Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie melden. Es kann verwendet werden, Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen.

Zusammenfassung

Dieser Test soll speziell auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) nachweisbar Berichten von Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie. Eine HIV-1-Reporter-Virus (HIV-1-Gag-iCre) entsteht durch das HIV-1-Genom zwischen der Matrix und die Kapsid-Proteine der Gag funkionalen Cre-Rekombinase einfügen. Dies führt zu einer Verpackung der Cre-Rekombinase in Viruspartikel, die dann in einer Zielzelle freigesetzt wird Linie stabil ein Cre Rekombinase aktiviert rot fluoreszierenden Proteins (RFP) zur GFP-Schalter-Kassette zum Ausdruck zu bringen. In den basalen Zustand drückt diese Kassette nur RFP. Im Anschluss an die Übergabe der Cre-Rekombinase in die Zielzelle oder beschneidet RFP, flankiert von LoxP-Websites, wodurch GFP Ausdruck. Dieser Test kann verwendet werden, um Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen und wurde verwendet, um eine Klasse von Purinergic-Rezeptor-Antagonisten als neuartige virale Membranfusion HIV-1-Hemmer zu identifizieren.

Einleitung

Die Notwendigkeit einer neuen antiretroviralen Therapien veranlasste die Entwicklung von Hochdurchsatz-Bildschirme für Inhibitoren der HIV-1 Eintrag. Die Gag-iCre Reporter Assay wurde entwickelt, um Inhibitoren der viralen Eintrag bei der Fusion Schritt in einem System von Zelle zu Zelle Infektion zu identifizieren, durch speziell virale Membranfusion mit dem Host Zellmembran¹messen. Ein Test wurde entwickelt, um Bildschirm für neuartige Hemmstoffe, die speziell auf den frühen Stadien der HIV-1-Infektion bis zu dem Punkt der viralen Membranfusion gehandelt. Eine Herausforderung für die Messung der Zell-Zell-Infektion ist, dass das anfängliche Inokulum enthält infizierten Spenderzellen und ininfected Zielzellen, so Neuinfektionen zu messen schwierig ist, von der Eingabezellen unterscheiden. Das ideale System würde bedeuten, eine Heterologe gen-Markierung, die durch die Einleitung einer Ziel-Zelle-Infektion verursacht werden kann und in der Spender Zelle ist nicht vorhanden. Eine beliebte virale Inhalte mischen Assay basiert auf einer viralen Protein-Enzym-Fusion, BlaM-Vpr, wirksam sein können, aber hat seine Grenzen für hohen Durchsatz, Zell-Zell-Screening-². Dieser Test beinhaltet eine Beta-Lactamase (BlaM) Reporter-gen, die mit HIV-1 Vpr verschmolzen, in Virionen verpackt und geliefert in Zielzellen auf virale Membranfusion. Das Substrat CCF2-AM wird in das Zytoplasma der Zielzellen geladen und eine Fluoreszenz Veränderung bei der Spaltung. Das CCF2-AM Substrat ist teuer und unerschwinglich für Hochdurchsatz-Bildschirme werden kann. Um Spender und Ziel-Zellen zu unterscheiden, ist es notwendig, Farbstoff-Label der Zielgruppen. Schließlich erfordert das Protokoll mehrere Wasch- und Inkubation Schritte, die aufwändig und kostspielig sein können, wenn große Anzahl von Verbindungen zu testen.

Die Gag-iCre Assay entwickelte sich als eine Lösung für diese Probleme eine Hochdurchsatz-screening für Inhibitoren der Fusion in Zell-Zell-Übertragung zu entwickeln. Dieses System erfordert keine Substrat in Zellen geladen werden. Der Test eignet sich auch für zellfreie Studien und ist anpassungsfähig an andere virale Fusion Studien mit Pseudo-typisierte HIV-1-Gag-iCre Viruspartikel. HIV Env vermittelte Zell-Zell-Fusion-Assays können Virus Env Protein-vermittelte Zellfusion, Messen, aber diese nicht tatsächliche Viruspartikel benutzen, ebenso wie die Gag-iCre HIV-1-Assay^3,4,5. Dieser Test kann mit Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie gelesen werden. Es wird erfolgreich eingesetzt, die FDA-Bibliothek sowie eine kleine Bibliothek von Purinergic Inhibitoren^1,6auf den Bildschirm. Andere Forscher identifizierten auch Purinergic Inhibitoren in HIV-1 Fusion mit eine angepasste und optimierte Hochdurchsatz-Fusion-Assay, der berichtet die Übertragung des Virus-gekapselte Beta-Lactamase in das Zytoplasma^7,8 .

Die Gag-iCre-Virus wurde mit einem ähnlichen Ansatz für das Einfügen von Cre-Rekombinase zwischen Matrix und Kapsid, flankiert von HIV-1 Protease Seiten⁹Gag-iGFP-Virus entwickelt. Das Cre-Enzym erfolgt als Vorläufer innerhalb der Gag-funkionalen, die reift bei HIV-1 Protease innerhalb der im Entstehen begriffenen Viruspartikel aktivierter eingefügt. Die Cre-Lieferung ist somit abhängig von der Lieferung der Inhalte von HIV-1 Protease-aktivierten Teilchen in ein Ziel Zelle über eine virale Membran Fusionsprozess. Zwei Versionen des Protokolls stehen hier zur Verfügung. Die erste verwendet eine Bevölkerung von HIV-1 infizierten Zielzellen, zur Untersuchung der direkten Zell-Zell-Übertragung von HIV zu infizieren. Die zweite Version verwendet einen zellfreie Virus eine zellfreie Virusinfektion zu studieren. Der Zell-Zell-Übertragung-Test dauert 7 Tage ab dem Tag abgeschlossen, die die Zellen aufgetaut sind, oder 5 Tage, wenn die Zellen bereits aufgetaut und passagiert sind. Zellfreie Infektion Assay kann in 5 Tagen, wenn die Zellen müssen aufgetaut werden und 3 Tage durchgeführt werden, wenn die Zellen aufgetaut und passagiert sind. Anweisungen sind auch generieren eine RG (rot, grün) Ziel-Zelllinie in der gewünschten Zelltyp (wenn eine bereits vorhandene RG-Ziel-Zelllinie nicht verwendet wird) mit einem Plasmid von Clevers Lab¹⁰erstellt. Es wird empfohlen, entsprechende biologische Sicherheitsvorkehrungen, mit dem Virus und der Virus exprimierenden Zellen in diesem Test getroffen werden. Wir führen die infektiöse Teil des Assays in einer Gewebekultur Einrichtung BSL2 +. Nachdem die Zellen fixiert sind, können sie im standard Flow Cytometry und Mikroskopie Einrichtungen analysiert werden.

Hier beschreiben wir die Anwendung des Assays auf Bildschirm für Roman Verbindungen hemmen HIV-1 Virus Membranfusion (Abbildung 1). Purinergic Rezeptoren sind Pro-inflammatorischen Mediatoren. Unser Labor hat gezeigt, dass nicht-selektive Inhibitoren der Purinergic Rezeptoren als Inhibitoren von HIV-1 virale Membran Fusion⁶handeln. Wir berichten, dass die Nutzung des Assays in hohem Durchsatz Roman HIV-1 virale Membran Fusion Inhibitoren identifizieren kann. Wir zeigen, dass ein Inhibitor der Purinergic Klasse Rezeptoren eine neuartige Klasse von HIV-1 virale Membran Fusion Inhibitoren darstellt.

Protokoll

1. Generation der Ziel-Zell-Linien

Hinweis: Dieser Schritt ist optional; Wenn Sie eine bestehenden RG-Ziel-Zelllinie zu verwenden, beginnen Sie mit Schritt 2.

1. Cotransfect einen 70 % konfluierende 10 cm Teller mit 293T Zellen¹¹ [in 10 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS)] mit pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ und pCL-10A1¹² (Verpackung Plasmid) in einem Verhältnis 1:1 (insgesamt 20 µg) mittels Calcium-basierte Transfektion¹³.
2. 10 mL virale überstand 48 h nach Transfektion durch die Medien von der Platte in ein 15 mL konische Röhrchen pipettieren und Zentrifugieren der Röhre bei 3.000 X g für 5 min bei 23 ° C zu jeder zellenrückstand Pellets zu ernten.
3. Legen Sie einen 0,45 µm-Filter auf eine 10 mL Spritze. Nach Zentrifugation die gesamte überstand und laden Sie die Spritze. Führen Sie das Beispiel durch in eine saubere 15 mL-Tube.
4. Aliquot der gefilterten virale überstand in entsprechender Größe (in der Regel 0,5-1 mL-aliquoten). Diese können im nächsten Schritt sofort verwendet werden oder können bei-80 ° C eingefroren und gespeichert.
5. Verwenden Sie 50-100 µL virale überstand auf um eine Zelllinie der Wahl in eine 96-Well-Platte zu infizieren. Kultur der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO₂. Das RFP-Signal sollte so bald wie 24 h unter dem Fluoreszenzmikroskop (40 X Vergrößerung, 532 nm Anregung, 588 nm Emission) erscheinen aber kann bis zu 72 Stunden dauern.
   Hinweis: In diesen Experimenten Jurkat-Zellen wurden verwendet, aber auch andere Arten verwendet werden.
6. Wählen Sie ausgestrahlt Zellen mit Puromycin durch Einrichtung einer Reihe von 10 Bohrungen und Hinzufügen von Puromycin zu jedem, mindestens 1 gut verlassen unbehandelt als Steuerelement (Einsatz eine Vielzahl von Konzentrationen von 0,5 µg/mL bis 5 µg/mL; Dies kann je nach Zelltyp variieren). Monitor der Zellviabilität (Zelle Lysis tritt in Zellen ohne Puromycin Widerstand) im Laufe von mehreren Tagen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle und Nutzung einer Konzentration von Puromycin wo nur RFP exprimierenden Zellen überleben.
   Hinweis: Wählen Sie die Konzentration, wo untransfected Zellen abgetötet werden, während transfizierte Zellen überleben.
7. Mit einzelligen Flow Cytometry sortieren oder eine begrenzende Verdünnung (siehe Schritte 1,8 – 1.10), wachsen Kulturen abgeleitet von Einzelzellen¹ eine klonale Zelllinie zu entwickeln (Dies dauert mehrere Wochen, um zu wachsen).
8. Wenn die Verdünnungsmethode verwenden, zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer und verdünnen Sie die Probe bis ca. 500 Zellen/mL.
9. In einer 96-Well-Platte pipette 50 µL der Zelle Verdünnung in 50 µL der Medien [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10 % FBS und 2 % Penicillin-Streptomycin, wenn Jurkat Zellen verwenden], und führen Sie 1:1 serielle Verdünnungen in 11 Brunnen mit 50 µL der Medien. Die besten Ergebnisse zu erzielen führen Sie mindestens 10 Wiederholungen.
10. Überwachen Sie das Zellwachstum über Mikroskopie (40 X) der Platte in einer Gewebekultur Inkubator (37 ° C mit 5 % CO₂) oder ca. 4 Wochen. Wählen Sie die niedrigste Konzentration von Puromycin mit Wachstum (als gesehen per Mikroskop, 40 X) für die klonalen Kulturen Kulturen.
11. Frieren Sie die aliquoten durch Zentrifugieren 20 mL der Kultur (500.000 Zellen/mL, mit einem Hemocytometer gezählt) bei 800 X g für 5 min bei 23 ° C und in 500 µL der FBS mit 10 % DMSO resuspending. Legen sie bei-80 ° C mit einer Zelle-Einfrieren-Container und speichern Sie es dann in flüssigem Stickstoff.

(2) Zell-Zell-Virusübertragung

1. Vorbereitung der Zielzellen
   1. Tauwetter ein 500 µL Fläschchen Jurkat RG Reporter Zellen indem man sie in ein Wasserbad von 37 ° C. Die Zellen aus der Durchstechflasche in 10 mL RPMI komplette Medium Pipette und Zentrifugieren Sie die Mischung bei 800 X g für 5 min bei 23 ° C. Das Pellet in 20 mL RPMI komplette Medium in eine T-75 Flasche aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Flasche über Nacht (37 ° C und 5 % CO₂).
      Hinweis: Vollständige RPMI Medium enthält RPMI 1640, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin.
   2. Fügen Sie am nächsten Tag 0,5 µg/mL von Puromycin (1 µL einer 2 mg/mL-Aktie je 8 mL der Medien hinzu). Kulturzellen Sie die Aufrechterhaltung einer Dichte von 200.000 – 800.000 Zellen/mL ( über Hemocytometer gezählt).
   3. Am Tag vor dem Einrichten der Transfer-Assay, löste sich die Zellen bis zu 200.000 – 400.000 Zellen/mL frisches RPMI Medium mit 0,5 µg/mL von Puromycin.
2. Vorbereitung der Spenderzellen
   1. Tauen Sie untransduced Jurkat Zellen und Kultur, die sie in eine T-75 Flasche mit 20 mL RPMI Medium (wie in Schritt 2.1 beschrieben), halten eine Dichte von 200.000 – 800.000 Zellen/mL abzuschließen.
   2. Zentrifugieren 7.500.000 Zellen (800 X g für 5 min) und Aufschwemmen sie in 120 µL Nucleofection Lösung V mit Zuschlag (siehe Tabelle der Materialien). Übertragen Sie die Zellen auf eine Elektroporation Küvette und fügen Sie 4,5 µg Gag-iCre¹ DNA. Die Zellen zu transfizieren (über eine Elektroporation basierenden Ansatz, siehe die Tabelle der Materialien) mit einem geeigneten Programm (z.B.S-18) und dann sofort auf 3 mL RPMI Medium übertragen (mit 10 % FBS).
   3. Lassen Sie die Zellen wiederherstellen, indem sie über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO₂Inkubation.
   4. Am nächsten Morgen Zentrifugieren der Zellen bei 800 X g für 5 min bei 23 ° C und sie in 3 mL RPMI komplette Medium, so dass sie 2 h bei 37 ° C (5 % CO₂) wiederherstellen, bevor Sie fortfahren mit dem Assay-Setup erneut.
3. Kokultur
   1. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer dann Spin down 50.000 Zellen (800 X g für 5 min bei 23 ° C) pro Bohrloch zu (der Spender und Ziel-Zellen) untersucht werden. Resuspending 1 x 10⁶ Zellen/mL in RPMI komplett ohne Puromycin.
   2. Fügen Sie in einer Platte 25 µL Zellsuspension Spender in jede Vertiefung hinzu; Fügen Sie in einer anderen Platte 25 µL der Zielzellen.
   3. Fügen Sie in jede Vertiefung 25 µL der Testverbindung in RPMI komplette Medium bei der entsprechenden Konzentration verdünnt hinzu. Inkubieren Sie die Spender und Ziel Zellen mit der Verbindung für 30 min.
      Hinweis: Die Konzentration variiert pro Medikament. Wenn es eine bekannte IC₅₀verfügt, verwenden Sie diese als Ausgangspunkt, titrieren, oben und unten. Wenn IC₅₀ unbekannt ist, bereiten Sie eine 200 µM-Lager für eine Endkonzentration von 10 µM.
   4. Kombinieren Sie nach der Vorbehandlung die Spenderzellen mit den Zielzellen durch pipettieren der Inhalt einer Platte in den anderen und inkubieren Sie die Zellen für 40 h in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
4. Durchflusszytometrie
   1. Jede Vertiefung, eine Endkonzentration von 2 % Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen.
      Hinweis: Für eine Stammlösung 16 % ist dies 14 µL pro 100 µL.
   2. Achtung: PFA ist schädlich für Haut und Augen. Tragen Sie ein Kittel, Handschuhe und Schutzbrille zu und verarbeiten Sie der Stammlösung in eine Schutzhaube.
   3. Lesen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer mit mCherry und FITC-Kanäle.
      Hinweis: Es ist möglich, 5 – 20 % der Zellen GFP über Hintergrund in den infizierten Zellen VsAusdruck zu sehen. nicht infizierte Zellen.
   4. Visualisieren Sie das GFP-Signal per Fluoreszenz-Mikroskopie (40 X) auf GLP-spezifische Kanäle (mit Erregung Filter von 400 nm und eine Emission Filter von 508 nm).

3. alternative Protokoll für eine zellfreie Virus-Infektion

1. Vorbereitung der Zielzellen
   1. Tauwetter ein 500 µL Fläschchen Jurkat RG Reporter Zellen indem man in einem 37 ° C-Wasserbad. Die Zellen aus der Durchstechflasche in 10 mL RPMI komplette Medium Pipette und Zentrifugieren Sie komplette RPMI Medium bei 800 X g für 5 min bei 23 ° C. Das Pellet in 20 mL RPMI komplette Medium in eine T-75 Flasche aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Flasche über Nacht (37 ° C und 5 % CO₂).
   2. Fügen Sie am nächsten Tag 0,5 µg/mL von Puromycin (1 µL einer 2 mg/mL-Aktie je 8 mL der Medien hinzu). Kulturzellen Sie die Aufrechterhaltung einer Dichte von 200.000 – 800.000 Zellen/mL ( über Hemocytometer gezählt).
   3. Am Tag vor dem Einrichten der Transfer-Assay, löste sich die Zellen bis zu 200.000 – 400.000 Zellen/mL frisches RPMI Medium mit 0,5 µg/mL von Puromycin.
2. Produktion eines zellfreien Virus
   1. Transfizieren einen 70 % konfluierende 10 cm Teller mit 293T Zellen¹¹ (in 10 mL DMEM mit 10 % FBS) mit 5 µg Gag-iCre¹ Plasmids mit Calcium-basierte Transfektion¹³.
      Hinweis: Diese Skala erzeugt 10 mL des Virus, das reicht für ca. zwei bis vier 96-Well Platten, abhängig von der Effizienz der Transfektion.
   2. Ernten Sie die gesamte virale Überstand bei 48 h durch die Medien von der Platte in ein 15 mL konische Röhrchen pipettieren und Zentrifugieren der Röhre bei 3.000 X g für 5 min zu allen zellenrückstand Pellets.
   3. Legen Sie einen 0,45 µm-Filter auf eine 10 mL Spritze. Nach Zentrifugation die gesamte überstand und laden Sie die Spritze. Führen Sie das Beispiel durch in eine saubere 15 mL-Tube.
   4. Verwenden Sie das Virus infizieren Zielzellen sofort (Schritt 3.3) oder Einfrieren und speichern das Virus bei-80 ° C (Tauwetter der Probe bei Bedarf vor der Verwendung).
3. Infektion
   1. Zählen die RG Jurkat Zielzellen (aus Schritt 3.1.3) unter Verwendung eines Hemocytometer und Spin down 50.000 Zielzellen pro Bohrloch bei 800 X g für 5 min, resuspending der Zellen bei 1 x 10⁶ Zellen/mL in RPMI Medium ohne Puromycin abzuschließen.
   2. Fügen Sie in einer Platte 25 µL RG Jurkat Zielzellen in jede Vertiefung hinzu; in einer separaten Platte hinzufügen 25 µL (2 ng) Virus in jede Vertiefung.
   3. Fügen Sie in jede Vertiefung 25 µL der Testverbindung in Medien bei der entsprechenden Konzentration verdünnt hinzu. Inkubieren Sie die Zellen und das Virus mit der Verbindung für 30 min.
      Hinweis: Die Testkonzentration variiert pro Medikament. Wenn es eine bekannte IC₅₀verfügt, verwenden Sie diese als Ausgangspunkt, titrieren, oben und unten. Falls unbekannt, bereiten Sie ein 200 µM Lager Medium für eine Endkonzentration von 10 µM.
   4. Fügen Sie nach der Vorbehandlung den gesamten Inhalt (50 µL) des Virus/Verbund-Mix aus den Vertiefungen zu den Zielzellen und inkubieren Sie alles für 40 h in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
4. Durchflusszytometrie
   1. Fügen Sie PFA in jede Vertiefung, eine Endkonzentration von 2 %.
      Hinweis: Für eine Stammlösung 16 % ist dies 14 µL pro 100 µL.
   2. Lesen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer mit mCherry und FITC-Kanäle. Das GFP-Signal kann auch visualisiert über Fluoreszenz-Mikroskopie auf GLP-Kanälen.
      Hinweis: Einmal erwarten 5 – 20 % der Zellen GFP über Hintergrund in den infizierten Zellen Vszum Ausdruck zu bringen. die nicht infizierten Zellen.

Ergebnisse

Nicht infizierte RG Jurkat Zellen weisen ein niedriges Niveau der GFP Hintergrundsignal (0,3 %) mit einem sehr starken RFP-Signal (Abb. 2A, nicht infizierten Spalte). Die Infektion mit Knebel-iCre führt zu einer Erhöhung im GFP Signal (24,9 %), während das Vorhandensein von HIV-1-Fusion-Inhibitor AMD3100 (20 µM) hemmt die Entwicklung dieses Signals, bringt es auf nicht infizierten Hintergrundwerte (0,34 %). Wenn ein Inhibitor eines Post-fusion Events wie ...

Diskussion

Die Gag-iCre Assay erweist sich als sehr nützlich für das screening von Medikamenten-Kandidaten, die die Fusion Schritt der Virusreplikation hemmen können. Wenn Sie diesen Test durchführen, sind die wichtigsten Schritte, um ein gutes Signal ähnlich wie die meisten viralen Infektion Assays. Der erste wichtige Schritt ist hohe Titer von guter Qualität Virus produziert. Dieser Schritt erfordert, dass die 293T Zellen passagiert häufig (mindestens 1 x alle 48 Std.), so dass sie nicht Overconfluent zu werden und verklum...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).