Un High-throughput Cre-Lox attivato membrana virale Fusion test per identificare gli inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1

Riepilogo

Descriviamo un'analisi basata sulle celle per segnalare il HIV-1 fusione tramite l'espressione della proteina fluorescente verde rilevabile da microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Può essere utilizzato per testare gli inibitori dell'entrata virale (in particolare presso il passo di fusione) in sistemi di infezione senza cellula e cellula--cellula.

Abstract

Questo test è progettato per segnalare in particolare il HIV-1 fusione tramite l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) rilevabile da microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Un virus di reporter di HIV-1 (HIV-1 Gag-iCre) viene generato inserendo il genoma di HIV-1 tra la matrice e le proteine del capside della poliproteina Gag Cre ricombinasi. Ciò si traduce in un packaging di Cre ricombinasi in particelle di virus, che viene poi rilasciato in una cella di destinazione linea che esprimono stabilmente un Cre ricombinasi-rosso fluorescente proteica attivata (RFP) Cassetta di interruttore GFP. Nello stato basale, questa cassetta esprime solo RFP. Dopo la consegna di Cre ricombinasi nella cella di destinazione, la RFP, affiancata da siti loxP, accise, con conseguente espressione di GFP. Questo test può essere utilizzato per verificare eventuali inibitori dell'entrata virale (in particolare presso il passo di fusione) in sistemi di infezione senza cellula e cellula--cellula ed è stato utilizzato per identificare una classe degli antagonisti del recettore purinergico come nuovi inibitori della fusione della membrana virale di HIV-1.

Introduzione

La necessità di terapie antiretrovirali romanzo ha richiesto lo sviluppo di schermi ad alta produttività per gli inibitori di HIV-1 entrata. L'analisi del reporter di Gag-iCre è stato sviluppato per identificare inibitori dell'entrata virale nella fase di fusione in un sistema di infezione della cellula--cellula misurando in particolare fusione della membrana virale con la membrana cellulare di host¹. Un'analisi è stata sviluppata alla schermata per nuovi inibitori che ha agito in particolare nelle fasi iniziali dell'infezione da HIV-1 fino al punto di fusione della membrana virale. Una sfida per l'infezione della cellula-cellula di misurazione è che l'inoculo iniziale contiene le cellule erogarici infetti e cellule bersaglio ininfected, quindi nuova infezione di misura è difficile discriminare dalle celle di input. Il sistema ideale comporterebbe un gene eterologo marcatore che può essere indotta dall'avvio di un'infezione di cella di destinazione e non è presente nella cellula donatrice. Un contenuto virale popolare saggio basato su una fusione di proteina-enzima virale, BlaM-Vpr, di miscelazione può essere efficace, ma ha limitazioni per throughput elevato, cella selezione². Questo test comporta un gene del reporter beta-lattamasi (BlaM) che è fusa a HIV-1 Vpr, confezionato in virioni e consegnato nelle celle di destinazione al momento della fusione della membrana virale. Il substrato CCF2-AM viene caricato nel citoplasma delle cellule bersaglio e subisce un cambiamento di fluorescenza su fenditura. Il substrato di CCF2-AM è costoso e può essere proibitivo per gli schermi ad alta velocità. Al fine di distinguere le cellule del donatore e di destinazione, è necessario tintura ecologica delle popolazioni. Infine, il protocollo richiede diversi passaggi di lavaggio e incubazione che possono essere gravoso e costoso quando si verifica un numero elevato di composti.

Il dosaggio di Gag-iCre è stato sviluppato come una soluzione a questi problemi, per sviluppare un high throughput screening per gli inibitori della fusione nella trasmissione della cellula--cellula. Questo sistema non richiede il substrato deve essere caricato nelle celle. Il metodo può essere utilizzato anche per gli studi senza cellula ed è adattabile ad altri studi di fusione virale usando le particelle del virus HIV-1 Gag-iCre pseudo-tipizzate. Saggi di fusione HIV Env mediata cellula-cellula possono misurare la fusione di virus Env proteina-mediata delle cellule, tuttavia questi non usano particelle di virus reale come il test di HIV-1 Gag-iCre^3,4,5. Questo test può essere letto con microscopia di flusso cytometry o fluorescenza. Esso è stato utilizzato con successo a schermo la libreria di FDA, nonché una piccola biblioteca di purinergic inibitori^1,6. Altri ricercatori hanno anche identificato purinergic inibitori in HIV-1 fusione usando un'analisi di fusione di alto-rendimento adattato e ottimizzato che segnala il trasferimento di virus-incapsulato beta-lactamase nel citoplasma^7,8 .

Il virus di Gag-iCre è stato progettato con un approccio simile al virus Gag-iGFP, inserimento di Cre ricombinasi tra matrice e capside, affiancato da HIV-1 proteasi siti⁹. L'enzima Cre è fatto come un precursore inserito all'interno della poliproteina Gag che matura quando proteasi HIV-1 sono attivato entro la particella virale nascente. La consegna di Cre dipende, quindi, la consegna del contenuto di una particella di HIV-1 proteasi-attivati in un bersaglio cellulare tramite un processo di fusione della membrana virale. Qui sono disponibili due versioni del protocollo. Il primo utilizza una popolazione di infezione da HIV-1 per infettare le cellule bersaglio, per studiare la trasmissione diretta di cellula--cellula dell'HIV. La seconda versione utilizza un virus senza cellula per studiare un'infezione virale senza cellula. Analisi della cellula--cellula trasmissione prende 7 giorni per essere completato dal giorno che le cellule vengono scongelate, o 5 giorni se le cellule sono già scongelate e attraversate. Il dosaggio di infezione senza cellula può essere effettuato in 5 giorni se le cellule devono essere scongelati e 3 giorni, se le cellule sono scongelate e attraversate. Vengono inoltre fornite istruzioni per generare una linea cellulare di destinazione (da rosso a verde) RG nel tipo di cella desiderata (se non viene utilizzata una preesistente linea cellulare di destinazione RG) utilizzando un plasmide creato dal Clevers Lab¹⁰. È consigliabile che biosicurezza adeguate precauzioni sono prese con il virus e le cellule che esprimono virus in questa analisi. Conduciamo la porzione infettiva di questo test in una struttura di coltura del tessuto BSL2 +. Dopo che le cellule sono fissi, essi possono essere analizzati in strutture di microscopia e citometria a flusso standard.

Qui descriviamo l'applicazione di questo test a schermo per romanzo composti che inibiscono la fusione della membrana virale di HIV-1 (Figura 1). Recettori purinergici sono mediatori pro-infiammatori. Il nostro laboratorio ha dimostrato che gli inibitori non selettivi dei recettori purinergici agiscono come inibitori di HIV-1 membrana virale vmware fusion⁶. Segnaliamo che l'utilizzo di questo test in alta velocità effettiva può identificare romanzo inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1. Dimostriamo che un inibitore della classe di recettori purinergici rappresenta una nuova classe di inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1.

Protocollo

1. generazione di linee di cellule bersaglio

Nota: Questo passaggio è facoltativo; Se si utilizza una linea di cella di destinazione RG esistente, iniziare dal passaggio 2.

1. Cotransfect un piatto di confluenti 10 cm 70% di 293T cellule¹¹ [in 10 mL di medium dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS)] con pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ e pCL-10A1¹² (plasmide imballaggio) in un rapporto 1:1 (20 µ g totale) mediante transfezione Calcio-base¹³.
2. Raccogliere 10 mL di post-transfezione virale surnatante 48h di dispensazione dei media dalla piastra in una provetta conica da 15 mL e centrifugazione del tubo a 3.000 x g per 5 min a 23 ° C a pellet eventuali detriti cellulari.
3. Montare un filtro da 0,45 µm una siringa da 10 mL. Dopo la centrifugazione, prendere tutto il surnatante e caricare la siringa. Attraversano il campione in una provetta pulita 15 mL.
4. Aliquota del surnatante filtrato virale in dimensioni appropriate (solitamente, 0,5 – 1 aliquote da mL). Può essere utilizzati immediatamente nel passaggio successivo o possono essere congelati a-80 ° C e memorizzati.
5. 50 – 100 µ l del surnatante virale può essere utilizzato per infettare una linea cellulare di scelta in una piastra a 96 pozzetti. Coltura le cellule a 37 ° C con 5% CO₂. Il segnale RFP dovrebbe apparire appena 24 ore sotto un microscopio a fluorescenza (ingrandimento 40x, eccitazione di 532 nanometro, 588 nm emissione) ma può richiedere fino a 72 h.
   Nota: In questi esperimenti, le cellule Jurkat sono state usate, ma altri tipi possono essere utilizzati pure.
6. Selezionare cellule trasdotte con con puromicina istituendo una serie di 10 pozzi e con puromicina aggiungendo a ciascuno, lasciando almeno 1 bene non trattati come controllo (utilizzare un intervallo di concentrazioni da 0,5 µ g/mL a 5 µ g/mL; questo può variare in base al tipo di cellula). Monitor l'attuabilità delle cellule (lisi cellulare si verificano nelle cellule senza resistenza con puromicina) nel corso di diversi giorni rispetto al controllo non trattato e uso una concentrazione di con puromicina dove sopravvivono solo le cellule che esprimono RFP.
   Nota: Selezionare la concentrazione dove le cellule untransfected sono uccisi mentre transfected le cellule sopravvivono.
7. Utilizzando l'ordinamento cytometry di flusso cella singola o una diluizione limitante (vedere passaggi 1.8 – 1.10), coltivare colture derivate da cellule singole¹ a sviluppare una linea di cellule clonali (questo può richiedere diverse settimane a crescere).
8. Se si utilizza il metodo di diluizione, contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire il campione a circa 500 cellule/mL.
9. In una piastra a 96 pozzetti, pipettare 50 µ l della diluizione delle cellule in 50 µ l di media [medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% FBS e 2% penicillina-streptomicina, se usando le cellule Jurkat] ed eseguire diluizioni seriali 1:1 in 11 pozzetti contenenti 50 µ l di media. Per ottenere risultati ottimali, è necessario eseguire almeno 10 ripetizioni.
10. Monitorare la crescita delle cellule tramite microscopia (40 X) della piastra in un incubatore di coltura del tessuto (37 ° C con 5% CO₂) o circa 4 settimane. Scegliere culture dalla minima concentrazione con puromicina con crescita (come visto tramite microscopio, 40 X) per le culture clonale.
11. Congelare le aliquote da centrifugazione 20ml della cultura (500.000 cellule/mL, contato con un emocitometro) a 800 x g per 5 min a 23 ° C e risospendere esso in 500 µ l di FBS con 10% DMSO. Posizionarlo a-80 ° C utilizzando un contenitore di congelamento delle cellule e poi memorizzarlo in azoto liquido.

2. cellula--cellula Virus trasmissione

1. Preparazione delle cellule bersaglio
   1. Disgelo uno da 500 µ l vial delle cellule di Jurkat RG reporter inserendolo in bagnomaria a 37 ° C. Pipettare le cellule dal flaconcino in 10 mL di terreno completo RPMI e poi Centrifugare la miscela a 800 x g per 5 min a 23 ° C. Risospendere il pellet in 20 mL di terreno completo RPMI in un fiasco di T-75. Incubare la beuta durante la notte (37 ° C e 5% CO₂).
      Nota: Il terreno completo RPMI contiene RPMI 1640, 10% FBS, 2mm L-glutamina, 100 unità/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina.
   2. Il giorno successivo, aggiungere 0,5 µ g/mL di con puromicina (1 µ l di uno stock di 2 mg/mL per 8 mL di media). Coltura delle cellule, mantenendo una densità di 200.000 – 800.000 cellule/mL (contati tramite emocitometro).
   3. Il giorno prima di impostare il dosaggio di trasferimento, dividere le celle fino a 200.000-400.000 cellule/mL in medium RPMI fresco contenente 0,5 µ g/mL di con puromicina.
2. Preparazione delle cellule erogarici
   1. Scongelare il untransduced cellule Jurkat e cultura li in un fiasco di T-75 con 20 mL di RPMI completo medio (come descritto al punto 2.1), mantenendo una densità di 200.000 – 800.000 cellule/mL.
   2. Centrifugare le 7.500.000 cellule (800 x g per 5 min) e li risospendere in 120 µ l di soluzione di nucleofection V con supplemento (Vedi Tabella materiali). Trasferire le cellule una cuvetta di elettroporazione e aggiungere 4,5 µ g di Gag-iCre¹ DNA. Transfect le cellule (tramite un approccio basato su elettroporazione, vedere la Tabella materiali) utilizzando un programma appropriato (ad esempio, S-18) e poi trasferirli immediatamente 3 mL di terreno RPMI (con 10% FBS).
   3. Permettono alle cellule di recuperare incubando una notte a 37 ° C con 5% CO₂.
   4. La mattina successiva, centrifugare le cellule a 800 x g per 5 min a 23 ° C e risospendere li in 3 mL di terreno completo RPMI, permettendo loro di 2h a recuperare a 37 ° C (5% CO₂) prima di procedere con l'impostazione dell'analisi.
3. Co-cultura
   1. Contare le celle utilizzando un emocitometro poi spin giù 50.000 cellule (800 x g per 5 min a 23 ° C) per pozzetto deve essere analizzato (delle cellule del donatore e di destinazione). Risospendere 1 x 10⁶ cellule/mL in RPMI completo senza con puromicina.
   2. In un piatto, aggiungere 25 µ l di sospensione cellulare donatore ad ogni pozzetto; in un altro piatto, aggiungere 25 µ l di cellule bersaglio.
   3. In ciascun pozzetto, aggiungere 25 µ l di sostanza in esame diluito in terreno completo RPMI alla concentrazione. Incubare le cellule del donatore e di destinazione con il composto per 30 min.
      Nota: La concentrazione varia per droga. Se ha un noto IC₅₀, utilizzare questo come un punto di partenza, titolazione sopra e sotto. Se l'IC₅₀ è sconosciuto, è possibile preparare un brodo di µM 200 per una concentrazione finale di 10 µM.
   4. Dopo il pretrattamento, combinare le cellule del donatore con le cellule bersaglio pipettando il contenuto di una piastra in altra e incubare le cellule 40H in coltura tissutale incubatore a 37 ° C con 5% CO₂.
4. Citometria a flusso
   1. Aggiungere paraformaldeide (PFA) ad ogni pozzetto ad una concentrazione finale del 2%.
      Nota: Per una soluzione di riserva di 16%, questo è ben 14 µ l a 100 µ l.
   2. Attenzione: PFA è dannoso per gli occhi e la pelle esposta. Indossare un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza e gestire la soluzione di riserva in un cappuccio di sicurezza.
   3. Leggere le cellule su un citometro a flusso con mCherry e canali FITC.
      Nota: È possibile vedere 5 – 20% delle cellule che esprimono GFP sopra priorità bassa in cellule infettate vs. cellule non infette.
   4. Visualizzare il segnale GFP tramite microscopia a fluorescenza (40 X) su canali di GFP-specifico (con un filtro di eccitazione di 400 nm e un filtro di emissione di 508 nm).

3. protocollo alternativo per un'infezione di Virus Cell-free

1. Preparazione delle cellule bersaglio
   1. Disgelo uno da 500 µ l vial delle cellule reporter Jurkat RG inserendo in bagnomaria a 37 ° C. Pipettare le cellule dal flaconcino in 10 mL di terreno completo RPMI e poi Centrifugare il terreno completo RPMI a 800 x g per 5 min a 23 ° C. Risospendere il pellet in 20 mL di terreno completo RPMI in un fiasco di T-75. Incubare la beuta durante la notte (37 ° C e 5% CO₂).
   2. Il giorno successivo, aggiungere 0,5 µ g/mL di con puromicina (1 µ l di uno stock di 2 mg/mL per 8 mL di media). Coltura delle cellule, mantenendo una densità di 200.000 – 800.000 cellule/mL (contati tramite emocitometro).
   3. Il giorno prima di impostare il dosaggio di trasferimento, dividere le celle fino a 200.000-400.000 cellule/mL in medium RPMI fresco contenente 0,5 µ g/mL di con puromicina.
2. Produzione di un virus senza cellula
   1. Transfect un piatto di 10cm confluenti del 70% di 293T cellule¹¹ (in 10 mL di DMEM con 10% FBS) con 5 µ g di Gag-iCre¹ plasmide usando a base di calcio transfezione¹³.
      Nota: Questa scala si otterranno 10 mL di virus, che è sufficiente per circa due-quattro piastre da 96 pozzetti, a seconda l'efficienza di transfezione.
   2. Raccogliere il surnatante virale intero a 48 h di dispensazione dei media dalla piastra in una provetta conica da 15 mL e centrifugazione del tubo a 3.000 x g per 5 min a pellet tutti i detriti cellulari.
   3. Montare un filtro da 0,45 µm una siringa da 10 mL. Dopo la centrifugazione, prendere tutto il surnatante e caricare la siringa. Attraversano il campione in una provetta pulita 15 mL.
   4. Utilizzare il virus per infettare le cellule bersaglio immediatamente (punto 3.3) o congelare e conservare il virus a-80 ° C (disgelo l'esempio come necessario prima dell'uso).
3. Infezione
   1. Contare le celle di destinazione RG Jurkat (dal punto 3.1.3) utilizzando un emocitometro e spin giù 50.000 cellule bersaglio per pozzetto a 800 x g per 5 min, risospendere le cellule a 1 x 10⁶ cellule/mL in RPMI completare mezzo senza con puromicina.
   2. In un piatto, aggiungere 25 µ l di cellule bersaglio RG Jurkat ad ogni pozzetto; in un piatto a parte, aggiungere 25 µ l (2 ng) virus in ciascun pozzetto.
   3. In ciascun pozzetto, aggiungere 25 µ l del test composto, diluito in media alla concentrazione. Incubare le cellule e il virus con il composto per 30 min.
      Nota: La concentrazione di prova varia per droga. Se ha un noto IC₅₀, utilizzare questo come un punto di partenza, titolazione sopra e sotto. Se sconosciuto, preparare un mezzo stock di 200 µM per una concentrazione finale di 10 µM.
   4. Dopo il pretrattamento, aggiungere l'intero contenuto (50 µ l) del mix virus/composto dai pozzi alle cellule bersaglio e incubare tutto 40H in coltura tissutale incubatore a 37 ° C con 5% CO₂.
4. Citometria a flusso
   1. Aggiungere PFA in ciascun pozzetto ad una concentrazione finale del 2%.
      Nota: Per una soluzione di riserva di 16%, questo è ben 14 µ l a 100 µ l.
   2. Leggere le cellule su un citometro a flusso con mCherry e canali FITC. Il segnale GFP può anche essere visualizzati tramite microscopia a fluorescenza su canali GFP.
      Nota: Una volta possono aspettarsi di vedere 5 – 20% delle cellule che esprimono GFP sopra priorità bassa in cellule infettate vs. le cellule non infette.

Risultati

Le cellule di Jurkat RG non infetti presentano un basso livello di segnale di fondo GFP (0,3%) con un segnale molto forte di RFP (Figura 2A, colonna non infetto). L'infezione con Gag-iCre provoca un aumento nel segnale GFP (24,9%,) mentre la presenza di inibitore di fusione di HIV-1 AMD3100 (20 µM) inibisce lo sviluppo di questo segnale, portandola a livelli di sfondo non infetti (0,34%). Quando un inibitore di un evento post-fusione come l'inibitore di tras...

Discussione

Il dosaggio di Gag-iCre ha dimostrato di essere molto utile per lo screening di farmaci candidati che possono inibire il passaggio di fusione della replicazione virale. Quando si esegue questo test, i passi più importanti per ottenere un buon segnale sono simili a più virale infezione saggi. Il primo passaggio fondamentale è produrre alti titoli del virus di buona qualità. Questo passaggio richiede che le cellule 293T sono attraversate frequentemente (almeno 1 x ogni 48 h) così non diventano overconfluent e raggrupp...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).