높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

요약

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

초록

이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 구체적으로 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 (GFP) 감지의 표현 하도록 설계 되었습니다. 에이즈-1 기자 바이러스 (에이즈-1 개 그-iCre)는 Cre recombinase 매트릭스와 개 그 polyprotein의 capsid 단백질 V-1 게놈으로 삽입 하 여 생성 됩니다. 다음 대상 셀에 발표 바이러스 입자로 Cre recombinase의 포장에서이 결과 라인 Cre recombinase 활성화 빨간 형광 성 단백질 (RFP) GFP 스위치 카세트를 안정적으로 표현. 기저 상태에서이 카세트만 RFP를 표현합니다. 목표 셀에 Cre recombinase의 배달, 다음 loxP 사이트에 의해 형벌 RFP, GFP 식 결과 excises. 이 분석 결과 어떤 억제제 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 셀 및 셀 감염 시스템에서 테스트를 사용할 수 있는 그리고 HIV-1 바이러스 막 융합의 비 발한 억제제로 purinergic 수용 체 길 항 근의 클래스를 식별 하는 데 사용 되었습니다.

서문

소설 항 레트로 바이러스 치료를 위한 필요 에이즈-1의 억제제에 대 한 높은 처리량 스크린의 개발을 자극 했다. 개 그-iCre 기자 분석 결과 특히 호스트 세포 막¹바이러스 막 융합을 측정 하 여 셀 감염 시스템에서 융해 단계에서 바이러스 항목의 억제제를 식별 하기 위해 개발 된다. 분석 결과 개발 되었다 바이러스 막 융합의 지점까지 에이즈-1 감염의 초기 단계에서 구체적으로 행동 하는 비 발한 억제제에 대 한 화면으로. 한 도전-셀 감염 측정은 새로운 감염을 측정 하는 것은 입력된 셀에서 차별 어렵다 그래서 초기 inoculum 감염된 기증자 세포와 ininfected 대상 셀 포함. 이상적인 시스템 분리 유전자 마커를 대상 세포 감염의 개시에 의해 유도 될 수 있다 포함 하 고 기증자 세포에 존재 하지 않습니다. 인기 있는 바이러스 내용을 바이러스 성 단백질 효소 퓨전, 연기-Vpr에 따라 분석 결과 혼합 효과적일 수 있다, 그러나 높은 처리량, 셀 심사²에 대 한 제한이 있다. 이 분석 결과 베타-lactamase (연기) 리포터 유전자를 에이즈-1 Vpr을 융합, virions로 포장 이며, 바이러스 성 막 퓨전 시 대상 세포에 전달이 포함 됩니다. 기판 CCF2 오전 대상 세포의 세포질에 로드 하 고 분열 시 형광 변화를 겪 습. CCF2 오전 기판 비싼 이며, 높은 처리 화면에 대 한 금지 될 수 있습니다. 기증자 및 대상 셀을 구별 하기 위하여 그것은 염료 레이블에 필요한 대상 인구. 마지막으로, 프로토콜 화합물의 큰 숫자를 테스트 하는 경우 부담 하 고 비용이 많이 드는 될 수 있는 몇 가지 세척 및 인큐베이션 단계를 요구 한다.

개 그-iCre 분석 결과 높은 처리량 셀 전송에서 퓨전의 억제제에 대 한 검사를 개발 하는 것이 문제에 해결책으로 개발 되었다. 이 시스템은 기판 셀으로 로드할 수 필요 하지 않습니다. 분석 결과 셀 무료 연구에도 사용할 수 있습니다 그리고 의사 형식화 된 HIV-1 개 그-iCre 바이러스 입자를 사용 하 여 다른 바이러스 성 융합 연구에. 그러나 에이즈-1 개 그-iCre 분석 결과^3,,45마찬가지로 이러한 실제 바이러스 입자를 사용 하지 않는 HIV 환경을 중재-셀 퓨전 분석 바이러스 환경을 단백질 중재 세포 융합, 측정할 수 있습니다. 이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경으로 읽을 수 있습니다. 그것은 FDA 라이브러리 뿐만 아니라 purinergic 억제제^1,6의 작은 도서관을 화면으로 성공적으로 사용 되었습니다. 다른 수 사관 들도 보고 바이러스 캡슐화 beta lactamase 세포질^7,8 로 전송 하는 적응 하 고 최적화 된 높은 처리량 퓨전 분석 결과 사용 하 여 HIV-1 융합 저 해제 purinergic 식별 .

개 그-iCre 바이러스는 매트릭스와 에이즈-1 효소 사이트⁹에 의해 형벌 capsid Cre recombinase 삽입 개 그-iGFP 바이러스에 유사한 방식으로 설계 되었습니다. Cre 효소 성숙 hiv-1 프로 테아 제 초기 바이러스 입자 내에서 활성화 되 면 개 그 polyprotein 내에서 삽입 하는 전조로 이루어집니다. 따라서, Cre 납품은를 대상 셀 을 통해 바이러스 성 막 융해 과정에 효소 활성화 HIV-1 입자의 내용 전달에 의존 합니다. 프로토콜의 두 가지 버전은 여기에 제공 됩니다. 첫 번째는 에이즈-1 감염 인구를 사용 하 여 직접 셀 전송의 HIV 연구 대상 세포를 감염. 두 번째 버전 셀 무료 바이러스를 사용 하 여 셀 무료 바이러스 감염 연구. 셀 전송 분석 결과 셀은 이미 해 동 하 고 passaged 세포를 해 동 하는 날 로부터 7 일 또는 5 일 걸립니다. 경우에 세포를 해 동 하 여 passaged 셀 무료 감염 분석 결과 5 일 셀 해 동 될 필요가 있는 경우 및 3 일에서 수행할 수 있습니다. 지침은 또한 Clevers 랩¹⁰에 의해 만들어진 플라스 미드를 사용 하 여 원하는 셀 형식 (해당 되는 경우 기존의 RG 대상 셀 라인은 사용 하지 않는)에 RG (빨강-녹색) 대상 셀 라인을 생성 하 주어진 다. 적절 한 biosafety 주의 바이러스와 바이러스 표현 셀이 분석이 결과에 찍힌다는 것이 좋습니다. 우리는 BSL2 + 조직 문화 시설에서이 분석 결과의 감염 부분을 수행합니다. 셀 고정 후 표준 흐름 cytometry 및 현미경 시설에서 분석할 수 있습니다.

소설 화합물에 대 한이 분석 결과의 응용 프로그램 화면을 설명 하는 여기 HIV-1 바이러스 막 융합 (그림 1)을 억제. Purinergic 수용 체는 프로-염증 성 중재자. 우리 연구소는 비 선택적 억제제 purinergic 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 퓨전⁶의 행위로 설명 했다. 우리는 높은 처리량이 분석 결과의 활용 소설 HIV-1 바이러스 막 융합 억제제를 식별할 수 있는 것을 보고 합니다. Purinergic 클래스의 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 융합 억제제의 새로운 클래스를 나타냅니다 보여 줍니다.

프로토콜

1입니다. 대상 셀 라인의 세대

참고:이 단계는 선택 사항; 기존의 RG 대상 셀 라인을 사용 하 여, 2 단계에서 시작.

1. 70% confluent 10 cm 접시 pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ 와 pCL 10A1¹² (포장 플라스 미드) [10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10 mL]에 293T 세포¹¹ 의 cotransfect는 1:1 비율 (총 20 µ g)에 칼슘에 기초를 둔 transfection¹³사용 하 여.
2. 15 mL 원뿔 튜브로 접시에서 미디어를 pipetting와 펠 렛의 모든 세포 파편을 23 ° C에서 5 분 동안 3000 x g 에서 튜브 centrifuging 바이러스 표면에 뜨는 48 h 후 transfection의 10 mL를 수확.
3. 10 mL 주사기를 0.45 μ m 필터를 연결 합니다. 원심, 후 전체 표면에 뜨는 고 주사기를 로드. 깨끗 한 15 mL 튜브로 통해 샘플을 실행 합니다.
4. 적절 한 크기에 필터링 된 바이러스 상쾌한 약 수 (일반적으로 0.5-1 mL aliquots). 이러한 다음 단계에서 즉시 사용할 수 또는 수 있습니다-80 ° C에서 냉동 고 저장.
5. 바이러스 성 상쾌한의 50-100 µ L를 사용 하 여 96 잘 접시에는 선택의 셀 라인을 감염. 5% CO₂와 37 ° C에서 세포 문화. RFP 신호 대로 24 h (40 X 확대, 532 nm 여기, 588 nm 방출) 형광 현미경에 나타납니다 하지만 최대 72 시간 소요 될 수 있습니다.
   참고:이 실험에서 Jurkat 세포 사용 되었다, 그러나 다른 유형 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.
6. 10 우물의 시리즈를 설정 하 여 puromycin와 적어도 1을 잘 떠나, 각각 추가 puromycin 선택 불리고 셀 컨트롤 (5 µ g/ml에서 0.5 µ g/mL 농도의 범위 사용;이 5 월 셀 형식에 따라 다릅니다)로 치료. 세포 생존 능력 (셀 세포 puromycin 저항 없이 셀에 발생 합니다) 몇 일 동안에 비해 치료 제어 및 puromycin RFP 표현 셀만 생존의 농도 사용 하 여 모니터.
   참고: transfected 세포 생존 하는 동안 untransfected 셀을 살해 하는 농도 선택 합니다.
7. 단일 셀 흐름 cytometry 정렬 또는 제한 희석 사용 하 여 (참조 단계 1.8-1.10), 단일 셀¹ 클론 셀 라인 (성장에 몇 주 걸릴 수 있습니다)를 개발 하는 것에서 파생 된 문화를 성장.
8. 희석 메서드를 사용 하는 경우는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 그리고 약 500 세포/ml 샘플을 희석.
9. 96 잘 접시에서 [10 %FBS 2% 페니실린 스, Jurkat 세포를 사용 하는 경우와 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체] 미디어의 50 µ L로 셀 희석의 50 µ L 플라스틱 하 고 11 웰 스를 포함 하는 미디어의 50 µ L로 1:1 직렬 희석을 수행 합니다. 최상의 결과 얻으려면 적어도 10 복제를 수행 합니다.
10. 조직 문화 인큐베이터 (5% CO₂와 37 ° C) 또는 약 4 주 판의 현미경 검사 법 (40 X)을 통해 세포 성장을 모니터링 합니다. 클론 문화에 대 한 (볼 통해 현미경, 40 X)로 성장 최저 puromycin 농도에서 문화를 선택 하십시오.
11. 23 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 문화 (500, 000 셀/mL는 hemocytometer로 계산)의 20 mL centrifuging와 10 %DMSO FBS의 500 µ L에서 resuspending는 aliquots를 고정 합니다. 셀-냉동 컨테이너를 사용 하 여-80 ° C에서 그것을 배치 하 고 액체 질소에 저장 합니다.

2. 세포-세포 바이러스 전송

1. 대상 셀의 준비
   1. 37 ° C 물 욕조에 그것을 두어서 Jurkat RG 기자 세포의 해 동 한 500 µ L 유리병. RPMI 완전 한 매체의 10 mL로 세포 유리병에서 플라스틱 및 다음 800 x g 23 ° c.에서 5 분 동안에 혼합물을 원심 20 ml RPMI T-75 플라스 크에 완전 한 매체의 펠 릿을 resuspend. 플라스 크 하룻밤 (37 ° C, 5% CO₂)를 품 어.
      참고: RPMI 완전 한 매체 RPMI 1640, 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 mg/mL 스 포함 되어 있습니다.
   2. 다음 날, puromycin (미디어의 8 mL 당 2mg/mL 주식의 1 µ L)의 0.5 µ g/mL를 추가 합니다. 200000-800000 셀/mL ( 통해 hemocytometer 계산)의 밀도 유지 하는 세포 문화.
   3. 전송 분석 결과를 설정 하기 전에 하루 puromycin의 0.5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 RPMI 매체에 200000-400000 셀/mL까지 셀을 분할 합니다.
2. 기증자 세포의 준비
   1. 해 동 untransduced Jurkat 세포와 RPMI의 20 mL와 T-75 플라스 크에 그들 완료 중간 (단계 2.1에서에서와 같이), 200000-800000 셀/mL의 조밀도 유지 하는 문화.
   2. 원심 7,500,000 셀 (800 x g 5 분) 및 그들의 보충과 nucleofection 솔루션 V 120 µ L에서 resuspend ( 재료의 표참조). Electroporation 베트 셀 전송 하 고 개 그 iCre¹ DNA의 4.5 µ g을 추가 합니다. Transfect 세포 (electroporation 기반 접근을 통해 테이블의 자료를 참조 하십시오)를 적절 한 프로그램 (예:S-18)를 사용 하 여 및 다음 즉시 RPMI 매체의 3 mL에 그들을 전송 (10 %FBS).
   3. 셀 5% CO₂와 37 ° C에서 그들을 하룻밤 배양 하 여 복구할 수 있습니다.
   4. 다음날 아침, 23 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 세포를 원심 고 RPMI 완전 한 매체, 2 h 37 ° C (5% CO₂)에서 시험 설치를 진행 하기 전에 복구할 수 있도록 3 mL에 그들을 resuspend.
3. 공동 문화
   1. (기증자 및 대상 셀)의 분석을 잘 당 50, 000 셀 (800 x g 23 ° C에서 5 분) 내려 hemocytometer 다음 스핀을 사용 하 여 셀을 계산. 1 x 10⁶ 셀/mL RPMI puromycin 없이 완전 한에 resuspending.
   2. 한 접시에 추가할 기증자 세포 현 탁 액의 25 µ L 각 잘; 또 다른 접시에 대상 셀의 25 µ L를 추가 합니다.
   3. 각 잘 복합 테스트의 25 µ L 희석 RPMI 적절 한 농도에서 완전 한 매체에 추가 합니다. 30 분 동안 화합물과 기증자 및 대상 셀을 품 어.
      참고: 농도 약물 마다 달라 집니다. 알려진된 IC₅₀경우에, 위와 아래에 넣는 출발점으로 서 이것을 사용 합니다. IC₅₀ 를 알 수 없는 경우 최종 농도 10 µ M의 200 µ M 재고 준비.
   4. 전처리, 후 다른 한 접시의 내용을 pipetting으로 대상 세포 기증자 세포를 결합 하 고 조직 문화 인큐베이터 5% CO₂와 37 ° c에 40 h에 대 한 셀을 품 어.
4. Cytometry
   1. 2%의 최종 농도에 각 음에 paraformaldehyde (PFA)를 추가 합니다.
      참고: 16% 재고 솔루션에 대 한이 100 µ L 당 14 µ L 잘.
   2. 주의: PFA 노출 된 피부와 눈에 유해한입니다. 실험실 외 투, 장갑, 그리고 안전 고글을 착용 하 고 안전 후드에서 재고 솔루션을 처리.
   3. MCherry와 FITC 채널 교류 cytometer 셀 읽기.
      참고: 그것은 감염 된 세포 vs배경 위에 GFP를 표현 하는 세포의 5-20%를 볼 수 있습니다. 감염 되지 않은 세포.
   4. GFP 특정 채널에 형광 현미경 검사 법 (40 X) 통해 GFP 신호를 시각화 (여기 필터 400 nm와 508의 방출 필터 nm).

3. 대체 프로토콜 셀 무료 바이러스 감염에 대 한

1. 대상 셀의 준비
   1. 37 ° C 물 목욕으로 배치 하 여 Jurkat RG 기자 세포의 해 동 한 500 µ L 유리병. RPMI 완전 한 매체의 10 mL로 세포 유리병에서 플라스틱 및 다음 원심 RPMI 완전 한 중간 800 x g 23 ° c.에 5 분에서 20 ml RPMI T-75 플라스 크에 완전 한 매체의 펠 릿을 resuspend. 플라스 크 하룻밤 (37 ° C, 5% CO₂)를 품 어.
   2. 다음 날, puromycin (미디어의 8 mL 당 2mg/mL 주식의 1 µ L)의 0.5 µ g/mL를 추가 합니다. 200000-800000 셀/mL ( 통해 hemocytometer 계산)의 밀도 유지 하는 세포 문화.
   3. 전송 분석 결과를 설정 하기 전에 하루 puromycin의 0.5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 RPMI 매체에 200000-400000 셀/mL까지 셀을 분할 합니다.
2. 셀-무료 바이러스의 생산
   1. Transfect 293T 세포¹¹ 의 70% confluent 10 cm 접시 (10 %DMEM 10 ml에서 FBS) 칼슘에 기초를 둔 transfection¹³를 사용 하 여 개 그 iCre¹ 플라스 미드의 5 µ g를.
      참고:이 규모는 약 2 ~ 4 96 잘 접시, 여 transfection 효율에 따라 충분 하다 바이러스의 10 mL을 생산할 예정 이다.
   2. 15 mL 원뿔 튜브로 접시에서 미디어를 pipetting와 펠 렛의 모든 세포 파편을 5 분 동안 3000 x g 에서 튜브 centrifuging 48 h에 전체 바이러스 상쾌한 수확.
   3. 10 mL 주사기를 0.45 μ m 필터를 연결 합니다. 원심, 후 전체 표면에 뜨는 고 주사기를 로드. 깨끗 한 15 mL 튜브로 통해 샘플을 실행 합니다.
   4. 바이러스를 사용 하 여 대상 셀 즉시 (단계 3.3) 감염 또는 동결 하 고-80 ° C (사용 전에 필요에 따라 샘플 thaw)에 바이러스를 저장.
3. 감염
   1. (에서 단계 3.1.3) RG Jurkat 대상 셀의 개수를 사용 하 여 hemocytometer를 스핀 800 x g 에 잘 당 50000 대상 셀 5 분, puromycin 없이 매체 완료 resuspending 1 x 10⁶ 셀/mL RPMI에 셀.
   2. 한 접시에 추가할 RG Jurkat 대상 셀의 25 µ L 각 잘; 별도 접시에 25 µ L 추가 (2 기) 각 우물에 바이러스.
   3. 각 잘 추가 25 µ L 복합, 테스트의 적절 한 농도에서 미디어에 희석 합니다. 셀과 30 분에 대 한 화합물과 바이러스를 품 어.
      참고: 테스트 농도 약물 마다 달라 집니다. 알려진된 IC₅₀경우에, 위와 아래에 넣는 출발점으로 서 이것을 사용 합니다. 알 수 없는, 경우 최종 농도 10 µ M의 200 µ M 재고 매체 준비.
   4. 전처리, 후 대상 셀에 우물에서 바이러스/화합물 혼합의 전체 콘텐츠 (50 µ L)를 추가 하 고 조직 문화 인큐베이터 5% CO₂와 37 ° c에 40 h에 대 한 모든 것을 품 어.
4. Cytometry
   1. 2%의 최종 농도에 각 잘 PFA 추가.
      참고: 16% 재고 솔루션에 대 한이 100 µ L 당 14 µ L 잘.
   2. MCherry와 FITC 채널 교류 cytometer 셀 읽기. GFP 신호는 GFP 채널에 형광 현미경 시각 을 통해 수 있습니다.
      참고: 한 번 감염 된 세포 vs배경 위에 GFP를 표현 하는 세포의 5-20%를 볼 기대할 수 있습니다. 감염 되지 않은 세포.

결과

감염 되지 않은 RG Jurkat 세포 (그림 2A, 감염 되지 않은 열) 매우 강한 RFP 신호 배경 GFP 신호 (0.3%)의 낮은 수준 전시. 개 그-iCre 감염 에이즈-1 융합 억제제 AMD3100의 존재 동안 GFP 신호 (24.9%) 증가 하면 (20 µ M)이이 신호를 감염 되지 않은 배경 수준 (0.34%)으로 데 려의 개발을 억제. 때 반전 녹음 방송 억제 물 어 같은 후 퓨전 이벤트의 억제제 (2 µ M) 사용, 신...

토론

개 그-iCre 분석 결과 바이러스 성 복제의 융해 단계를 억제 수 있습니다 약물 후보 심사에 대 한 매우 도움이 될 입증 되었습니다. 이 분석 결과 수행할 때 좋은 신호를 얻을 가장 중요 한 단계는 대부분의 바이러스 감염 분석 유사. 첫 번째 중요 한 단계는 좋은-품질 바이러스의 높은 titers 생산 하 고 있다. 이 단계에서는 293T 세포 passaged 자주 (적어도 모든 48 h x 1) 그래서 그들은 될 overconfluent와 함께...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).