Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

Résumé

Nous décrivons un essai pour signaler sur la fusion VIH-1 par l’expression de la protéine fluorescente verte détectable par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence cellulaire. Il peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule.

Résumé

Ce test est conçu pour rapport spécifiquement sur le VIH-1 fusion via l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) détectable par microscopie à écoulement cytometry ou de fluorescence. Un virus VIH-1 de la journaliste (VIH-1 Gag-iCre) est généré en insérant une recombinase Cre dans le génome du VIH-1 entre la matrice et les protéines de la capside de la polyprotéine Gag. Il en résulte dans un emballage de recombinase Cre en particules de virus, qui est ensuite libéré dans une cellule cible ligne exprimant de manière stable une Cre activés par recombinase rouge protéine fluorescente (DP) à cassette de commutateur GFP. À l’état basal, cette cassette exprime DP uniquement. Suite à la livraison de la recombinase Cre dans la cellule cible, la DP, flanquée de sites loxP, accises, aboutissant à l’expression de la GFP. Ce test peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule et a été utilisé pour identifier une classe des antagonistes des récepteurs purinergiques comme nouveaux inhibiteurs de la fusion de la membrane virale VIH-1.

Introduction

La nécessité de nouveaux antirétroviraux a incité le développement d’écrans de haut débit pour les inhibiteurs d’entrée du VIH-1. Le dosage de journaliste Gag-iCre est élaboré pour identifier les inhibiteurs d’entrée virale à l’étape de fusion dans un système de cellule à cellule infection en mesurant précisément fusion membrane virale avec la membrane de la cellule hôte¹. Un essai a été développé pour dépister les nouveaux inhibiteurs qui ont agi spécifiquement aux premiers stades de l’infection à VIH-1 jusqu’au point de fusion membranaire virale. Un défi à l’infection de cellule-cellule de mesure est que l’inoculum initial contienne des cellules du donneur contaminé et cible ininfected, mesure nouvelle infection est donc difficile de distinguer des cellules d’entrée. Le système idéal impliquerait un gène hétérologue marqueur qui peut être induit par l’ouverture d’une infection de cellule cible et n’est pas présent dans la cellule du donneur. Un contenu viral populaire mêlant analyse basée sur un mélange de protéines-enzyme virale, BlaM-Vpr, peut s’avérer efficace, mais a ses limites pour un débit élevé, cellules de dépistage². Ce test implique un gène rapporteur de bêta-lactamase (BlaM) qui est fusionné à Vpr du VIH-1, empaqueté dans des virions et livré dans les cellules cibles sur la fusion membranaire virale. Le substrat CCF2-AM est chargé dans le cytoplasme des cellules cibles et subit un changement de fluorescence par clivage. Le substrat CCF2-AM est coûteux et peut être prohibitif pour les écrans de haut débit. Afin de distinguer les cellules de donneur et la cible, il est nécessaire de colorant-étiquette les populations ciblées. Enfin, le protocole nécessite plusieurs étapes de lavage et d’incubation qui peuvent être fastidieux et coûteux lorsque vous testez un grand nombre de composés.

Le dosage de Gag-iCre a été développé comme une solution à ces problèmes, à développer un dépistage des inhibiteurs de la fusion de cellule à cellule transmission haut débit. Ce système ne nécessite pas de substrat doit être chargé dans les cellules. Le test peut également être utilisé pour les études acellulaire et est adaptable à d’autres études de fusion virale utilisant des particules de virus VIH-1 Gag-iCre Pseudo-aléatoire typés. Fusion des essais VIH Env médiée par cellules peuvent de mesurer le fusion virus Env induite par la protéine cellulaire, mais ceux-ci n’utilisent pas de particules virales réelles comme le test de VIH-1 Gag-iCre^3,4,5. Ce dosage peut être lu avec la microscopie écoulement cytometry ou de fluorescence. Il a été utilisé avec succès à l’écran de la bibliothèque de la FDA, mais aussi une petite bibliothèque de purinergiques inhibiteurs^1,6. Autres chercheurs ont également identifié purinergiques inhibiteurs de fusion du VIH-1 à l’aide d’un test de fusion haut débit adaptée et optimisée qui signale le transfert de bêta-lactamase virus encapsulé dans le cytoplasme^7,8 .

Le virus de Gag-iCre a été conçu avec une approche similaire au virus Gag-iGFP, insérant une recombinase Cre entre la matrice et de la capside, flanqué de HIV-1 protéase sites⁹. L’enzyme de la Cre est fait comme un précurseur inséré au sein de la polyprotéine Gag qui mûrit en activant la protéase du VIH-1 dans la particule virale naissante. La livraison de la Cre est donc tributaire de la livraison du contenu d’une particule de HIV-1 protéase activée dans une cible cellulaire via un processus de fusion des membranes virales. Deux versions du protocole sont fournies ici. Le premier utilise une population infectés par le VIH-1 pour infecter les cellules cibles, afin d’étudier la transmission directe de cellule à cellule du VIH. La deuxième version utilise un virus acellulaire pour étudier une virose acellulaire. Le test de cellule à cellule transmission prend 7 jours au complet de la journée, que les cellules sont décongelés, ou 5 jours si les cellules sont déjà décongelés et repiquées. Le test d’infection acellulaire peut être réalisé en 5 jours si les cellules doivent être décongelés et 3 jours si les cellules sont décongelés et repiquées. Instructions sont également fournies pour produire une lignée de cellules de cible (rouge-à-vert) RG dans le type de cellule désiré (si une lignée de cellules de cible RG préexistante n’est pas utilisée) à l’aide d’un plasmide, créé par le laboratoire Clevers¹⁰. Il est recommandé que mesures de biosécurité appropriées sont prises avec le virus et les cellules exprimant le virus dans ce test. Nous effectuons la partie infectieuse de ce test dans une installation de culture de tissus BSL2 +. Après que les cellules sont fixées, elles peuvent être analysées dans les installations de microscopie et cytométrie en flux standard.

Nous décrivons ici l’application de ce test à l’écran pour roman composés qui inhibent la fusion de la membrane virale du VIH-1 (Figure 1). Récepteurs purinergiques sont des médiateurs pro-inflammatoires. Notre laboratoire a démontré que les inhibiteurs non sélectifs des récepteurs purinergiques agissent comme inhibiteurs du VIH-1 membrane virale fusion⁶. Les auteurs rapportent que l’utilisation de ce test à un débit élevé peut identifier de nouveaux inhibiteurs de fusion membrane virale du VIH-1. Nous démontrons qu’un inhibiteur de classe des récepteurs purinergiques représente une nouvelle classe d’inhibiteurs de fusion membrane virale du VIH-1.

Protocole

1. génération de lignées de cellules de cible

Remarque : Cette étape est facultative ; Si vous utilisez une ligne de cellule cible RG existante, commencez à l’étape 2.

1. Cotransfect une plaque de confluentes 10 cm 70 % 293 t et cellules¹¹ [dans 10 mL de milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF)] avec pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ et pCL-10 a 1¹² (plasmide emballage) dans un ratio 1:1 (total 20 µg) à l’aide de transfection calcium-base¹³.
2. Récolte 10 mL de transfection post virale surnageant 48 h en pipettant également, les médias de la plaque dans un tube conique de 15 mL et centrifugation du tube à 3 000 x g pendant 5 min à 23 ° C pour granuler les débris cellulaires.
3. Fixer un filtre de 0,45 µm à une seringue de 10 mL. Après centrifugation, prenez tout le surnageant et charger la seringue. Traversent l’échantillon dans un tube propre de 15 mL.
4. Aliquote le surnageant viral filtré dans des formats appropriés (habituellement, de 0,5 – 1 aliquotes mL). Ceux-ci peuvent être utilisés immédiatement à l’étape suivante ou peut être congelés à-80 ° C et stockés.
5. 50-100 µL de liquide surnageant viral permet d’infecter une lignée cellulaire de choix dans une plaque à 96 puits. La culture des cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO₂. Le signal de la DP doit apparaître dans cet article dès le 24 h sous un microscope à fluorescence (40 X grossissement, une excitation de 532 nm, émission à 588 nm), mais peut prendre jusqu'à 72 h.
   Remarque : Dans ces expériences, les cellules Jurkat ont été utilisés, mais d’autres types peuvent être utilisés aussi bien.
6. Sélectionnez cellules transduits puromycine de mettre en place une série de 10 puits et la puromycine ajoutant à chacun, laissant au moins 1 bien n’est pas traité comme un contrôle (utilisation toute une gamme de concentrations de 0,5 µg/mL à 5 µg/mL, ce qui peut varier selon le type de cellule). Moniteur de la viabilité cellulaire (lyse cellulaire se produit dans les cellules sans résistance de la puromycine) au cours de plusieurs jours par rapport au témoin non traité et utiliser une concentration de puromycine où seules les cellules exprimant le DP survivent.
   NOTE : Sélectionnez la concentration où celllulaire cellules sont tués alors que les cellules transfectées de survivre.
7. En utilisant unicellulaires écoulement cytometry tri ou une dilution limite (voir étapes 1,8 – 1,10), poussent les cultures dérivées de cellules individuelles¹ à développer une lignée de cellules clonales (cela peut prendre plusieurs semaines à se développer).
8. Si vous utilisez la méthode de dilution, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer l’échantillon à environ 500 cellules/mL.
9. Dans une plaque à 96 puits, distribuer 50 µL de la dilution de la cellule dans 50 µL de médias [milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec 10 % FBS et 2 % la pénicilline-streptomycine, si à l’aide de cellules Jurkat] et effectuer des dilutions en série 1:1 dans 11 puits contenant 50 µL de médias. Pour de meilleurs résultats, effectuez au moins 10 répétitions.
10. Surveiller la croissance cellulaire par l’intermédiaire de la microscopie (40 X) de la plaque dans un incubateur de culture tissulaire (37 ° C avec 5 % de CO₂) ou environ 4 semaines. Cultures, choisissez la plus faible concentration de puromycine avec la croissance (comme vu par microscope, 40 X) pour les cultures clonales.
11. Geler les aliquotes de centrifugation 20 mL de la culture (500 000 cellules/mL, a compté avec un hémocytomètre) à 800 x g pendant 5 min à 23 ° C et il resuspendant dans 500 µL de FBS avec 10 % DMSO. Placez-la à-80 ° C à l’aide d’un conteneur de la cellule au point de congélation et ensuite le stocker dans l’azote liquide.

2. la Transmission du Virus cellule-cellule

1. Préparation des cellules cibles
   1. Flacon du dégel un 500 µL de cellules journaliste Jurkat RG en le plaçant dans un bain-marie à 37 ° C. Pipetter les cellules à partir du flacon dans 10 mL de milieu complet RPMI et puis centrifuger le mélange à 800 x g pendant 5 min à 23 ° C. Resuspendre le culot dans 20 mL de milieu complet RPMI dans une fiole de T-75. Incuber le ballon pendant la nuit (37 ° C et 5 % CO₂).
      Remarque : Le RPMI milieu complet contient le RPMI 1640, 10 % FBS, 2 mM de L-glutamine, 100 unités/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine.
   2. Le lendemain, ajouter 0,5 µg/mL de puromycine (1 µL d’un stock de 2 mg/mL par 8 mL de médias). La culture des cellules, maintien d’une densité de 200 000-800 000 cellules/mL (comptés par hémocytomètre).
   3. La veille de la mise en place de l’essai de transfert, fractionner les cellules jusqu'à 200 000 – 400 000 cellules/mL dans un milieu RPMI frais contenant 0,5 µg/mL de puromycine.
2. Préparation de cellules du donneur
   1. Décongeler les cellules Jurkat untransduced et la culture dans une fiole de T-75 avec 20 mL de milieu RPMI complète moyenne (tel que décrit à l’étape 2.1), gardant une densité de 200 000-800 000 cellules/mL.
   2. Centrifuger 7 500 000 cellules (800 x g pendant 5 min) et les remettre en suspension dans 120 µL de solution de nucleofection V avec supplément (voir Table des matières). Les cellules de transfert d’une cuve d’électroporation et ajouter 4,5 µg de Gag-iCre¹ ADN. Transfecter les cellules (via une approche axée sur l’électroporation, voir la Table des matières) à l’aide d’un programme approprié (par exemple, S-18) et puis les transférer immédiatement à 3 mL de milieu RPMI (avec 10 % FBS).
   3. Permettre à des cellules de récupération d’incuber une nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
   4. Le lendemain matin, centrifuger les cellules à 800 x g pendant 5 min à 23 ° C et leur resuspendre dans 3 mL de milieu complet de RPMI, leur permettant de 2 h à récupérer à 37 ° C (5 % CO₂) avant de procéder à l’installation de dosage.
3. Co-culture
   1. Compter les cellules utilisant un hémocytomètre puis rotation vers le bas de 50 000 cellules (800 x g pendant 5 min à 23 ° C) / puits à doser (des cellules de donneur et cible). Resuspendant 1 x 10⁶ cellules/mL dans RPMI complet sans la puromycine.
   2. Dans une assiette, ajouter 25 µL de la suspension de cellules de donneur à chaque puits ; dans une autre assiette, ajouter 25 µL de cellules cibles.
   3. Dans chaque puits, ajouter 25 µL de la substance d’essai dilué dans un milieu RPMI complète à la concentration appropriée. Incuber les cellules de donneur et la cible avec le composé pendant 30 min.
      Remarque : La concentration varie par médicament. Si elle a un connu IC₅₀, utilisez-le comme point de départ, titrage au-dessus et en dessous. Si on ne connaît pas la ci₅₀ , préparation d’un stock µM 200 pour une concentration finale de 10 µM.
   4. Après le prétraitement, combiner les cellules du donneur avec les cellules cibles en pipettant également, dans l’autre, le contenu d’un plat et incuber les cellules pendant 40 h dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂à culture de tissus.
4. Cytométrie en flux
   1. Ajouter paraformaldéhyde (PFA) dans chaque puits à une concentration finale de 2 %.
      Remarque : Pour une solution mère de 16 %, c’est 14 µL par 100 µL.
   2. ATTENTION : PFA est nocif pour les yeux et la peau exposée. Porter une blouse, des gants et des lunettes de sécurité et manipuler la solution mère dans un capot de sécurité.
   3. Lire les cellules sur un cytomètre en flux avec mCherry et canaux FITC.
      Remarque : Il est possible de voir de 5 à 20 % des cellules exprimant la GFP au-dessus de fond dans les cellules infectées vs. cellules non infectées.
   4. Visualiser le signal de la GFP par microscopie de fluorescence (40 X) sur des canaux spécifiques à GFP (avec un filtre d’excitation de 400 nm et un filtre d’émission de 508 nm).

3. autre protocole pour une infection par le Virus sans cellule

1. Préparation des cellules cibles
   1. Flacon du dégel un 500 µL de cellules journaliste Jurkat RG en plaçant dans un bain-marie à 37 ° C. Pipetter les cellules à partir du flacon dans 10 mL de milieu complet RPMI et puis centrifuger le milieu complet RPMI à 800 x g pendant 5 min à 23 ° C. Resuspendre le culot dans 20 mL de milieu complet RPMI dans une fiole de T-75. Incuber le ballon pendant la nuit (37 ° C et 5 % CO₂).
   2. Le lendemain, ajouter 0,5 µg/mL de puromycine (1 µL d’un stock de 2 mg/mL par 8 mL de médias). La culture des cellules, maintien d’une densité de 200 000-800 000 cellules/mL (comptés par hémocytomètre).
   3. La veille de la mise en place de l’essai de transfert, fractionner les cellules jusqu'à 200 000 – 400 000 cellules/mL dans un milieu RPMI frais contenant 0,5 µg/mL de puromycine.
2. Production d’un virus sans cellule
   1. Transfecter une plaque confluentes de 10 cm de 70 % de cellules 293 t¹¹ (dans 10 mL de DMEM avec 10 % FBS) avec 5 µg de plasmide de¹ Gag-iCre à l’aide de transfection calcium-base¹³.
      Remarque : Cette échelle permet d’obtenir 10 mL du virus, ce qui est suffisant pour environ deux à quatre plaques à 96 puits, selon l’efficacité de la transfection.
   2. Récolter le surnageant viral entier à 48 h en pipettant également, les médias de la plaque dans un tube conique de 15 mL et centrifugation du tube à 3 000 x g pendant 5 min granuler tous les débris cellulaires.
   3. Fixer un filtre de 0,45 µm à une seringue de 10 mL. Après centrifugation, prenez tout le surnageant et charger la seringue. Traversent l’échantillon dans un tube propre de 15 mL.
   4. Utilisez le virus pour infecter les cellules cibles immédiatement (étape 3.3) ou congeler et stocker le virus à-80 ° C (dégel l’échantillon au besoin avant utilisation).
3. Infection
   1. Compter les cellules Jurkat RG de cible (de l’étape 3.1.3) à l’aide d’un hémocytomètre et spin down 50 000 cellules cibles par puits à 800 x g pendant 5 min, resuspendant les cellules à 1 x 10⁶ cellules/mL dans le RPMI complet moyen sans la puromycine.
   2. Dans une assiette, ajouter 25 µL de cellules cibles RG Jurkat dans chaque puits ; dans une assiette, ajouter 25 µL (2 ng) virus dans chaque puits.
   3. Dans chaque puits, ajouter 25 µL de la substance, à tester dilué dans les médias à la concentration appropriée. Incuber les cellules et le virus avec les composés pendant 30 min.
      Remarque : La concentration d’essai varie par médicament. Si elle a un connu IC₅₀, utilisez-le comme point de départ, titrage au-dessus et en dessous. Si inconnu, préparer un milieu stock de 200 µM pour une concentration finale de 10 µM.
   4. Après le prétraitement, ajouter tout le contenu (50 µL) du mélange virus/composés provenant des puits dans les cellules cibles et incuber tout pendant 40 h dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂à culture de tissus.
4. Cytométrie en flux
   1. Ajouter PFA dans chaque puits à une concentration finale de 2 %.
      Remarque : Pour une solution mère de 16 %, c’est 14 µL par 100 µL.
   2. Lire les cellules sur un cytomètre en flux avec mCherry et canaux FITC. Le signal GFP peut également être visualisées par microscopie de fluorescence sur des canaux GFP.
      Remarque : Une fois peuvent s’attendre à voir de 5 à 20 % des cellules exprimant la GFP au-dessus de fond dans les cellules infectées vs. les cellules non infectées.

Résultats

Les cellules Jurkat RG non infectées présentent un faible niveau de signal de fond GFP (0,3 %) avec un signal très fort de DP (Figure 2 a, colonne non infecté). L’infection avec Gag-iCre entraîne une augmentation du signal GFP (24,9 %), tandis que la présence de l’inhibiteur de fusion du VIH-1 AMD3100 (20 µM) inhibe le développement de ce signal, ramenant à des niveaux de fond non infectées (0,34 %). Quand un inhibiteur d’un événement post f...

Discussion

Le dosage de Gag-iCre s’est avéré pour être très utile pour le dépistage des candidats-médicaments qui peuvent inhiber l’étape de fusion de réplication virale. Lorsque vous effectuez ce test, les étapes les plus importantes pour obtenir un bon signal sont semblables à des essais d’infection virales plus. La première étape essentielle est la production des titres élevés de virus de bonne qualité. Cette étape nécessite que les cellules 293 t sont repiquées fréquemment (au moins 1 x tous les 48 h), ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).