使用P19胚胎癌细胞的神经发生

摘要

P19小鼠胚胎癌细胞系(P19细胞系)与体内分析相比,广泛用于神经发生分子机制的研究,具有极大的简化性。在这里,我们提出了P19细胞系中视黄酸引起的神经发生方案。

摘要

从小鼠胚胎衍生的畸虫瘤衍生的P19细胞系具有分化成三个生殖层的能力。在视黄酸(RA)的存在下,悬浮培养的P19细胞系被诱导分化成神经元。这种现象作为体外神经发生模型被广泛研究。因此,P19细胞系对于与神经发生相关的分子和细胞研究非常有用。然而,文献中描述的P19细胞系神经元分化方案非常复杂。本研究开发的方法简单,对阐明神经发育异常和神经退行性疾病的分子机制起到一定的作用。

引言

在胚胎发育过程中,单个细胞层被转化为三个独立的生殖层1,2,3。为了增加在体内发生的现象的研究可能性,已经开发出三维聚集物(胚胎体)作为一种方便的模型。以这种方式形成的细胞聚集体可以暴露在各种导致细胞分化的条件下,这反映了胚胎4、5的发育。P19鼠胚胎癌细胞系(P19细胞系)常用作体外神经发生研究的细胞模型6、7、8。P19细胞系具有典型的多能干细胞特征,在细胞聚集过程中,在视黄酸(RA)存在的情况下可以分化成神经元,随后在粘附条件下生长出神经质。此外,未分化的P19细胞系还能够在二甲基硫酸盐(DMSO)9、10、11、12的影响下形成肌肉和心肌细胞样细胞。

许多方法13,14,15,16已经报告神经元分化,但方法有时很复杂,不容易掌握,只有阅读描述。例如,协议有时需要结合Dulbeco的改性鹰介质(DMEM)介质,辅以小牛血清(CS)和胎儿牛血清(FBS)13的混合物。此外,用于神经元发育的介质通常由神经巴沙和B27补充剂13,14,15,16组成。因此,现有方法在准备时包含复杂性,我们在此的目标是简化协议。在这项研究中,我们证明了使用FBS的DMEM可用于维持P19细胞系(DMEM = 10%FBS)以及神经元发育(DMEM = 5%FBS + RA)。这种使用P19细胞系的神经发生简化方法使我们能够研究神经元如何发育的分子机制。此外,对神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏病)的研究也使用P19细胞系17,18进行,我们相信,本研究中开发的方法将起到阐明神经发育异常和神经退行性疾病的分子机制。

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研究方案

1. 文化维护

1. 培养维护介质中的P19细胞系(Dulbeco的改性Eagle培养基,含有4,500毫克/升葡萄糖,辅以10%FBS、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素)。在37°C和5%CO₂下孵育。

2. 亚培养细胞

1. 当细胞达到约80%汇合时,从细胞培养瓶中取出废培养基(表面积25cm^2)。
2. 用不含钙和镁的2 mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞。
3. 在细胞单层上加入1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)。
4. 将烧瓶放入CO2培养箱(37°C和5%CO2)2-3分钟。
5. 评估与烧瓶表面的细胞附件。确保所有单元格都分离并浮动在介质中。
6. 加入9 mL的维护介质,以阻止胰蛋白酶的酶活性。
7. 在维护介质中重新挂起单元格。
8. 将细胞转移到15 mL管和离心机5分钟,在200 x g和室温(RT)。
9. 丢弃上清液,在 15 mL 管中加入 10 mL 的新鲜维护介质。
10. 使用细胞悬架根据制造商的说明使用细胞计数器确定细胞编号。
11. 种子细胞在2 x 10⁴细胞/cm2在新的25^厘米2烧瓶。
12. 将维护介质添加到 10 mL。
13. 将装有细胞的烧瓶放入CO2培养箱(37°C和5%CO2)2-3天。

3. 胰蛋白酶消化

1. 从电池瓶中吸气维持介质。用2 mL的钙和无镁PBS清洗细胞一次。
2. 添加 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。
3. 将装有细胞的烧瓶在37°C下放入CO2培养箱2-3分钟。
4. 使用 1 mL 移液器通过移液细胞分离细胞 10 次。
5. 通过在细胞中加入9 mL的分化介质(Dulbeco的改性Eagle的培养基,4500mg/L葡萄糖辅以5%FBS、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素)来中和胰蛋白酶,而不向细胞中添加RA。
6. 将细胞转移到15 mL管和离心机5分钟,在200 x g和RT。
7. 丢弃上清液,加入1 mL的分化介质,不含视黄酸(RA)。重新悬浮细胞颗粒。
8. 使用细胞悬架根据制造商的说明使用细胞计数器确定细胞编号。

4. 聚合生成

1. 将 5 μL RA(1 mM 库存溶解在 99.8% 乙醇中,储存在 -20°C) 添加到 10 mL 的分化介质中,并混合良好(最终浓度为 0.5 μM RA)。
   注:RA 是光敏的。EtOH的低浓度不影响细胞分化19,20,21。
2. 在 100 mm 未经处理的培养皿(专用于悬浮培养)中添加 10 mL 的分化介质(带 RA)。
3. 在 100 mm 盘中播种 1 x 10⁶细胞(碟面面积 56.5 厘米²)。
4. 将装有细胞的烧瓶在37°C和5%CO2的培养箱中放置2天,以促进聚集的形成。
5. 2天后,交换分化介质。使用 10 mL 移液器的包含集料的吸气介质,在 RT 处转移到 15 mL 管中。
6. 允许聚合在 RT 下按重力沉降 1.5 分钟。
7. 丢弃上清液。
8. 使用 10 mL 血清移液器使用 0.5 μM RA 添加新的 10 mL 分化介质。
   警告:请勿上下移液细胞聚集。
9. 将料料播种到新的 100 mm 未经处理的培养盘中(专用于悬浮培养)。
10. 将板放入培养箱(在37°C和5%CO2)中2天。

5. 聚合分离

1. 使用 10 mL 移液器吸气细胞聚集体。
2. 将骨料转移到 15 mL 管中。允许细胞聚合按重力沉降 1.5 分钟。
3. 拆下上清液。
4. 单独用DMEM清洗骨料(无血清和抗生素)。
5. 在RT处,允许细胞聚集物通过重力沉降沉降1.5分钟沉降。
6. 吸出上清液,加入2 mL的胰蛋白酶-EDTA(0.25%)。
7. 将细胞聚集体放入水浴(37°C)10分钟,用手敲击,每2分钟轻轻搅拌一次。
8. 通过添加 4 mL 的维护介质,停止胰蛋白酶化过程。
9. 移液器使用 1 mL 移液器向上和向下聚合 20 次。
10. 离心细胞在200 x g和RT下5分钟。
11. 取出上清液,在5 mL的维护介质中重新悬浮细胞颗粒。
12. 使用单元格计数器确定单元格编号。

6. 电镀电池

1. 将维护介质每孔 3 mL 添加到 6 孔板中。
2. 6 孔培养板中的种子细胞密度为 0.5 x 10⁶/孔。
3. 在37°C孵育,CO2浓度为5%。
4. 将细胞播种在6孔培养板上的盖玻璃上,用抗MAP2抗体(20%汇合)进行免疫染色。使用6孔板分离RNA,并对Map2、NeuN、Oct4、Nanog和Gapdh(20%汇合)执行RT-PCR。

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结果

图1给出了P19细胞系神经发生诱导方案的简化方案。为了在未分化状态和神经发生期间定义P19细胞系的特征,采用了RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)方法。未分化的P19细胞系表示多能基因,如有机阳离子/肉碱转运体4(Oct4)和Nanog主源盒(Nanog)。在RA存在的情况下,悬浮培养细胞聚集引起的神经发生导致Oct4和Nanog表达的迅速减少。相反,神?...

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讨论

在这里,我们描述了使用P19细胞系的神经发生的简单方案。虽然在这方面已经发表了许多报告,但使用P19细胞系进行神经发生诱导的详细方法仍不清楚。此外,我们在整个实验中使用了简单的高葡萄糖(4,500mg/L)DMEM培养基,10%FBS。这使我们能够以用户友好的方式进行神经生成实验,并在未来扩展此方法的使用范围。

该协议中最重要的点是RA浓度以及在悬浮培养液中生成细胞聚集。P19细?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6x DNA Loading Dye	EURx	E0260-01
Agarose	Sigma- Aldrich	A9539
cDNA synthesis kit	EURx	E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride)	Sigma- Aldrich	10236276001	Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine	Lonza	BE12-604Q
Ethanol 99.8%	Chempur	CHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS)	EURx	E5050-03
MAP2 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA517646	Dilution 1:100
PCR reaction kit	EURx	E0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
Retinoic acid	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	Dilution 1:500
Skim milk	Sigma- Aldrich	1153630500
TBE Buffer	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol Red	biosera	LM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological Pipettes	Profilab	515.01
10 mL Serological Pipettes	Profilab	515.10
100 mm dish dedicated for suspension culture	Corning	C351029
15 mL centrifuge tubes	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
5 mL Serological Pipettes	Profilab	515.05
6-well plate	Corning	CLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA