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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La linea cellulare del carcinoma embrionale del topo P19 (linea cellulare P19) è ampiamente utilizzata per studiare il meccanismo molecolare della neurogenesi con grande semplificazione rispetto all'analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo per la neurogenesi indotta da acido retinoico nella linea cellulare P19.

Abstract

La linea cellulare P19 derivata da un teratocarcinoma derivato da un embrione di topo ha la capacità di differenziarsi nei tre strati germinali. In presenza di acido retinoico (RA), la linea cellulare P19 coltivata in sospensione è indotta a differenziarsi in neuroni. Questo fenomeno è ampiamente studiato come un modello di neurogenesi in vitro. Pertanto, la linea cellulare P19 è molto utile per gli studi molecolari e cellulari associati alla neurogenesi. Tuttavia, i protocolli per la differenziazione neuronale della linea cellulare P19 descritti nella letteratura sono molto complessi. Il metodo sviluppato in questo studio è semplice e giocherà un ruolo nel chiarire i meccanismi molecolari nelle anomalie del neurosviluppo e nelle malattie neurodegenerative.

Introduzione

Durante lo sviluppo embrionale, uno strato a cella singola viene trasformato in tre strati germinali separati1,2,3. Per aumentare le possibilità di ricerca dei fenomeni che si verificano in vivo, la generazione di aggregati tridimensionali (corpi embrionali) è stata sviluppata come un modello conveniente. Gli aggregati cellulari formati in questo modo possono essere esposti a varie condizioni causando differenziazione cellulare, che riflettono lo sviluppo dell'embrione4,5. La linea cellulare p19 murina carcinoma embrionale (linea cellulare P19) è comunemente usata come modello cellulare per studi di neurogenesi in vitro6,7,8. La linea cellulare P19 presenta le caratteristiche tipiche delle cellule staminali pluripotenti e può differenziarsi in neuroni in presenza di acido retinoico (RA) durante l'aggregazione cellulare seguita da escrescenza neurite in condizioni aderenti. Inoltre, la linea cellulare P19 indifferenziata è anche in grado di formare cellule muscolo-e cardiomiociti-come sotto l'influenza di solforo dimetilo (DMSO)9,10,11,12.

Molti metodi13,14,15,16 sono stati segnalati per la differenziazione neuronale, ma la metodologia è a volte complicata e non facile da comprendere leggendo solo le descrizioni. Ad esempio, i protocolli a volte richiedono una combinazione del mezzo DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco,minedante, integrato con una miscela di siero di vitello (CS) e siero bovino fetale (FBS)13. Inoltre, i media utilizzati per lo sviluppo neuronale sono spesso composti da Neurobasal e B27 integratori13,14,15,16. Come tale, i metodi esistenti contengono complessità nella loro preparazione e il nostro obiettivo qui è quello di semplificare i protocolli. In questo studio, abbiamo dimostrato che DMEM con FBS può essere utilizzato per mantenere la linea cellulare P19 (DMEM - 10% FBS) così come per lo sviluppo neuronale (DMEM - 5% FBS - RA). Questo metodo semplificato per la neurogenesi utilizzando la linea cellulare P19 ci permette di studiare il meccanismo molecolare di come vengono sviluppati i neuroni. Inoltre, la ricerca sulle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer è condotta anche utilizzando la linea cellulare P1917,18, e crediamo che il metodo sviluppato in questo studio giocherà un ruolo nel chiarire il meccanismi molecolari nelle anomalie del neurosviluppo e nelle malattie neurodegenerative.

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Protocollo

1. Manutenzione della cultura

  1. Cultura la linea cellulare P19 in Maintenance Medium (il mezzo di Aquila modificato di Dulbecco con 4.500 mg/L di glucosio integrato con 10% FBS, 100 unità / mL penicillina e 100 unità / mL streptomicina). Incubare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.

2. Cellule sottocoltura

  1. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, rimuovere il mezzo esaurito dai flaconi di coltura cellulare (superficie 25 cm2).
  2. Lavare le cellule con 2 mL di fosfato tamponato salina (PBS) senza calcio e magnesio.
  3. Aggiungere 1 mL di 0,25% di trypsin-EDTA (acido etilenediaminetracetico) sul monostrato cellulare.
  4. Mettere il pallone nell'incubatrice di CO2 (37 e 5% CO2)per 2-3 min.
  5. Valutare l'attaccamento cellulare alla superficie del pallone. Assicurarsi che tutte le celle siano scollegate e galleggianti nel mezzo.
  6. Aggiungere 9 mL di Manutenzione Media per interrompere l'attività ezimatica della trypsin.
  7. Risospendere le celle in Maintenance Medium.
  8. Trasferire le cellule in un tubo da 15 mL e centrifugare per 5 min a 200 x g e temperatura ambiente (RT).
  9. Scartare il supernatante e aggiungere 10 mL di fresco mezzo di manutenzione nel tubo da 15 mL.
  10. Utilizzare la sospensione cellulare per determinare il numero di cella utilizzando un contatore di celle in base alle istruzioni del produttore.
  11. Cellule di semi a 2 x 104 cellule/cm2 in un nuovo flacone di 25 cm2.
  12. Aggiungere il mezzo di manutenzione fino a 10 mL.
  13. Mettere il pallone con le cellule nell'incubatrice di CO2 (37 e 5% di CO2)per 2-3 giorni.

3. Digestione di Trypsin

  1. Mezzo di manutenzione aspirato dal pallone cellulare. Lavare le cellule una volta con 2 mL di calcio e PBS senza magnesio.
  2. Aggiungere 1 mL di 0,25% trypsin-EDTA.
  3. Mettere il flacone con le cellule nell'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 2-3 min.
  4. Utilizzare 1 mL pipette per dissociare le cellule convogliando le cellule dieci volte.
  5. Neutralizza la trippsina aggiungendo 9 mL di Differentiation Medium (il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco con 4500 mg/L di glucosio integrato con 5% FBS, 100 unità / mL penicillina e 100 unità / streptomicina) senza RA alle cellule.
  6. Trasferire le cellule in un tubo da 15 mL e centrifugare per 5 min a 200 x g e RT.
  7. Scartare il supernatante e aggiungere 1 mL di Differenziazione Media senza acido retinoico (RA). Risospendere il pellet cellulare.
  8. Utilizzare la sospensione cellulare per determinare il numero di cella utilizzando un contatore di celle in base alle istruzioni del produttore.

4. Generazione aggregata

  1. Aggiungete 5-L di RA (1 mM disciolto nel 99,8% di etanolo, immagazzinato a -20 gradi centigradi) ai 10 mL di Differenziazione Media e mescolate bene (concentrazione finale di 0,5 gradi RA).
    NOT: L'AR è sensibile alla luce. La bassa concentrazione di EtOH non influisce sulla differenziazione cellulare19,20,21.
  2. Aggiungere 10 mL di Mezzo di differenziazione (con RA) al piatto di coltura non trattato di 100 mm (dedicato alla coltura delle sospensioni).
  3. Seme 1 x 106 celle nel piatto da 100 mm (area di superficie del piatto 56,5 cm2).
  4. Mettere il pallone con le cellule nell'incubatrice a 37 e 5% di CO2 per 2 giorni al fine di promuovere la formazione di aggregati.
  5. Dopo 2 giorni, scambiare il mezzo di differenziazione. Mezzo aspirato contenente aggregati utilizzando una pipetta da 10 mL e trasferito in un tubo da 15 mL a RT.
  6. Lasciare che gli aggregati si stabilizzino per gravità per 1,5 min a RT.
  7. Scartare il super-attardato.
  8. Aggiungere un nuovo 10 mL di differenziazione Media con 0,5 M RA utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
    ATTENZIONE: Non pipette la cella aggrega su e giù.
  9. Seme gli aggregati in nuovo piatto di coltura non trattata 100 mm (dedicato alla coltura delle sospensioni).
  10. Collocare la piastra nell'incubatrice (a 37gradi centigradi e al 5% di CO 2) per 2 giorni.

5. Dissociazione aggregato

  1. Aspirare gli aggregati cellulari utilizzando una pipetta da 10 mL.
  2. Trasferire gli aggregati in un tubo da 15 mL. Consentire agli aggregati cellulari di stabilirsi per gravità per 1,5 min.
  3. Togliete il super-acletterante.
  4. Lavare gli aggregati con DMEM da solo (senza siero e antibiotici).
  5. Consentire agli aggregati cellulari di stabilirsi per sedimentazione gravitazionale per 1,5 min a RT.
  6. Aspirare il supernatante e aggiungere 2 mL di trypsin-EDTA (0,25%).
  7. Mettere gli aggregati cellulari in un bagno d'acqua (37 gradi centigradi) per 10 min. Agitte gli aggregati delicatamente ogni 2 min toccando con una mano.
  8. Interrompere il processo di prova con l'aggiunta di 4 mL di Manutenzione Media.
  9. Pipette si aggrega su e giù 20 volte utilizzando 1 mL pipette.
  10. Centrifuga cellule per 5 min a 200 x g e RT.
  11. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di Manutenzione Media.
  12. Determinare il numero di cella con un contatore di celle.

6. Cellule di placcatura

  1. Aggiungere 3 mL per pozzetto di Manutenzione Media a una piastra a 6 pozzetti.
  2. Cellule di semi nella piastra di coltura a 6 pozze a una densità di 0,5 x 106/well.
  3. Incubare a 37 gradi centigradi con concentrazione di CO2 del 5%.
  4. Semina le cellule sul vetro di copertura in 6 piastra di coltura del pozzo ed esegue l'immunostaining con anticorpi anti-MAP2 (20% di confluenza). Utilizzare la piastra 6-well per isolare l'RNA ed eseguire RT-PCR per Map2, NeuN, Oct4, Nanoge Gapdh (20% di confluenza).

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Risultati

Lo schema semplificato del protocollo per l'induzione della neurogenesi nella linea cellulare P19 è presentato nella Figura 1. Per definire il carattere della linea cellulare P19 in uno stato indifferenziato e durante la neurogenesi, è stato utilizzato il metodo RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction). La linea cellulare P19 indifferenziata esprimeva i geni di pluripotenza come cation organica/carnitina trasportatore4 (Oct4) e Omeo...

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Discussione

Qui, descriviamo un semplice protocollo per la neurogenesi usando la linea cellulare P19. Anche se molti rapporti sono stati pubblicati a questo proposito, una metodologia dettagliata per l'induzione della neurogenesi utilizzando la linea cellulare P19 rimane poco chiara. Inoltre, abbiamo utilizzato un semplice mezzo DMEM ad alto glucosio (4.500 mg/L) con 10% FBS per l'intero esperimento. Questo ci ha permesso di eseguire l'esperimento neurogenico in modo user-friendly ed espandere l'uso di questo metodo per il futuro.

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Lo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Centro nazionale di scienze, Polonia (n. di sovvenzione. UMO-2017/25/N/N/N-N/3/01886) e KNOW (Leading National Research Centre) Consorzio scientifico "Animale sano - Cibo sicuro", decisione del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore n. 05-1/KNOW2/2015

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
6x DNA Loading DyeEURxE0260-01
AgaroseSigma- AldrichA9539
cDNA synthesis kitEURxE0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride)Sigma- Aldrich10236276001Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamineLonzaBE12-604Q
Ethanol 99.8%ChempurCHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS)EURxE5050-03
MAP2 antibodyThermo Fisher ScientificPA517646Dilution 1:100
PCR reaction kitEURxE0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10KLonzaDE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+LonzaBE17- 517Q
Retinoic acidSigma- AldrichR2625-50MG dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)Thermo Fisher ScientificA11034Dilution 1:500
Skim milkSigma- Aldrich1153630500
TBE BufferThermo Fisher ScientificB52
Triton-X 100Sigma- AldrichT8787-100ML
Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol RedbioseraLM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological PipettesProfilab515.01
10 mL Serological PipettesProfilab515.10
100 mm dish dedicated for suspension cultureCorningC351029
15 mL centrifuge tubesSigma- AldrichCLS430791-500EA
5 mL Serological PipettesProfilab515.05
6-well plateCorningCLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2Sigma- AldrichCLS430639-200EA

Riferimenti

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