נוירוגנזה באמצעות P19 Embryonal קרצינומה של תאים

Summary

העכבר P19 מתחלקים קרצינומה של קו התא (קו התא P19) משמש רבות לחקר המנגנון המולקולרי של נוירוגנזה עם פישוט גדול בהשוואה לניתוח vivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוירוגנזה הנגרמת חומצה המושרה P19 קו התא.

Abstract

קו התא P19 נגזר העובר העכבר הנגזר teratocarcinoma יש את היכולת להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט. בנוכחות חומצה retinoic (RA), ההשעיה תרבותי P19 קו התא הוא המושרה להבדיל לנוירונים. תופעה זו נחקר בהרחבה כמודל נוירוגנזה בתוך מבחנה. לכן, קו התא P19 הוא מאוד שימושי עבור המחקרים המולקולריים והסלולריים הקשורים נוירוגנזה. עם זאת, פרוטוקולים עבור הבחנה עצבית של קו התא P19 המתואר בספרות הם מורכבים מאוד. השיטה המפותחת במחקר זה פשוטה והיא תשחק תפקיד בהסבר למנגנון המולקולרי בחריגות נוירונטיות ומחלות ניווניות.

Introduction

במהלך embryonal פיתוח, שכבת תא אחת הופכת לשלוש שכבות הנבט הנפרדות^1,2,3. כדי להגביר את אפשרויות המחקר של תופעות המתרחשות בvivo, התפתחו הדור של אגרגטים תלת-ממדיים (גופים עובריים) כמודל נוח. אגרגטים סלולריים שנוצרו בדרך זו ניתן לחשוף לתנאים שונים גרימת בידול התא, אשר משקפים את ההתפתחות של העובר^4,5. קו קרצינומה עובריים P19 murine (קו תא P19) משמש בדרך כלל כמודל הסלולר ללימודי נוירוגנזה ב מבחנה^6,7,8. קו התא P19 מציג תכונות מסוימות של תא גזע בעוצמה pluripotent והוא יכול להבדיל לנוירונים בנוכחות של חומצה retinoic (RA) במהלך צבירת תאים ואחריו neurite מוצלח תחת תנאים חסיד. יתר על כן, קו תא P19 מובחן הוא גם מסוגל להרכיב תאים שרירים וקרדיולציט בדומה תחת השפעת diמתיל סולפוקסיד (dmso)^9,10,11,12.

שיטות רבות שונות^13,14,¹⁵,¹⁶ דווחו על בידול עצבי, אבל המתודולוגיה היא לפעמים מסובכת ולא קל לתפוס רק על ידי קריאת התיאורים. לדוגמה, פרוטוקולים דורשים לפעמים שילוב של מדיום הנשר המתוקן של Dulbecco (DMEM) בינוני עם תערובת של סרום עגל (CS) וסרום של שור עוברי (FBS)¹³. יתרה מזאת, מדיה המשמשת להתפתחות עצבית מורכבת לעתים קרובות מנוירוסיס ותוספי B27^13,14,¹⁵,¹⁶. ככאלה, שיטות קיימות מכילות את המורכבות שבהכנות והמטרה שלנו כאן היא לפשט את הפרוטוקולים. במחקר זה, הדגמנו כי DMEM עם FBS יכול להיות מנוצל עבור שמירה על קו התא P19 (Dמאמ + 10% FBS), כמו גם עבור פיתוח עצבי (DMEM גברת + 5% FBS + RA). זו שיטה פשוטה עבור נוירוגנזה באמצעות קו התא P19 מאפשר לנו ללמוד את המנגנון המולקולרי של איך הנוירונים מפותחים. יתר על כן, מחקר על מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר מתנהל גם באמצעות P19 cell קו^17,18, ואנו מאמינים כי השיטה שפותחה במחקר זה ישחק חלק בהסבר לצאת ה מנגנונים מולקולריים בחריגות נוירו-התפתחותיות ומחלות ניווניות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תחזוקת התרבות

1. תרבות קו התא P19 בינונית תחזוקה (מדיום הנשר שונה של מאוד עם 4,500 mg/L של גלוקוז שיושלם עם 10% FBS, 100 יחידות/מ"ל פניצילין ו 100 יחידות/mL סטרפטומיצין). מודטה ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.

2. תאים תת-משניים

1. כאשר התאים מגיעים כ 80% המפגש, להסיר את המדיום המושקע מבחנות תרבות התא (שטח המשטח 25 ס מ²).
2. לשטוף את התאים עם 2 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) ללא סידן ומגנזיום.
3. להוסיף 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA (חומצה אטיליאדיאמאאת) אל התא מונאולייר.
4. שים את הבקבוקון בחממה CO₂ (37 ° צ' ו 5% CO₂) עבור 2-3 דקות.
5. העריכו את התא המצורף למשטח הבקבוקון. ודא שכל התאים מנותקים וצפים במדיום.
6. הוסף 9 מ ל של מדיום תחזוקה כדי להפסיק את הפעילות האנזימטית של טריפסין.
7. השהה מחדש את התאים במדיום תחזוקה.
8. העבר תאים לצינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g וטמפרטורת החדר (RT).
9. השמט את הסופרנטאנט והוסף 10 מ ל של מדיום תחזוקה רעננה לתוך השפופרת של 15 מ ל.
10. השתמש בהשעיה של התא כדי לקבוע את מספר התא באמצעות מונה תאים בהתאם להוראות היצרן.
11. תאי הזרע ב 2 x 10⁴ תאים/cm2 בבקבוקון 25 ס מ חדש² .
12. הוסיפו את מדיום התחזוקה עד 10 מ ל.
13. לשים את הבקבוקון עם תאים בחממה CO₂ (37 ° צ' ו 5% CO₂) עבור 2-3 ימים.

3. טריפסין העיכול

1. . מתוך הבקבוקון של התא לשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ ל של סידן ומגנזיום חינם PBS.
2. הוסף 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA.
3. לשים את הבקבוקון עם תאים לתוך החממה CO₂ ב 37 ° c עבור 2-3 דקות.
4. השתמש בפיפטה משנת 1 mL כדי לנתק את התאים על ידי מלטף תאים עשר פעמים.
5. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 9 מ ל של בידול בינונית (מדיום הנשר שונה של בינוני עם 4500 mg/L של גלוקוז שיושלם עם 5% FBS, 100 יחידות/מחלת הפניצילין ו 100 יחידות/mL סטרפטומיצין) ללא RA לתאים.
6. העבר תאים לצינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g ו RT.
7. להיפטר supernatant ולהוסיף 1 מ ל של בידול בינונית ללא חומצה retinoic (RA). . השהה מחדש את הגלולה הסלולרית
8. השתמש בהשעיה של התא כדי לקבוע את מספר התא באמצעות מונה תאים בהתאם להוראת היצרן.

4. הדור המצטבר

1. הוסף 5 μL של RA (במלאי 1 מ"מ הומס 99.8% אתנול, מאוחסן ב-20 ° c) ל 10 מ ל של הבדלה בינונית ומערבבים היטב (הריכוז הסופי של 0.5 μM RA).
   הערה: . רה א רגיש באור ריכוז נמוך של אטוה אינו משפיע על בידול תא^19,20,21.
2. הוסף 10 מ ל של בידול בינוני (עם RA) אל מאכל התרבות 100 מ"מ (מוקדש תרבות ההשעיה).
3. הזרע את 1 x 10⁶ תאים במנה 100 מ"מ (שטח המשטח 56.5 ס"מ²).
4. לשים את הבקבוקון עם תאים לתוך החממה ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ עבור 2 ימים כדי לקדם את היווצרות אגרגטים.
5. לאחר יומיים, החלף את המדיום בידול. משוכי מדיום המכיל אגרגטים באמצעות מנקז 10 מ ל ולהעביר לצינור 15 מ ל ב-RT.
6. לאפשר לאגרגטים להתיישב על ידי כוח הכבידה עבור 1.5 דקות ב RT.
7. . מחק את הסופרנטאנט
8. הוסף חדש 10 מ ל של בידול בינוני עם 0.5 μm RA באמצעות הצינורות 10 mL סרולוגית.
   זהירות: אין לנקות את מצרפים את התאים למעלה ולמטה.
9. הזרע האגרגטים לתוך המנה החדשה 100 mm לא מטופלים התרבות (מוקדש תרבות ההשעיה).
10. מניחים את הצלחת בחממה (ב 37 ° צ' ו 5% CO₂) במשך יומיים.

5. אגרגטים דיסוציאציה

1. מתיף את האגרגטים בתאים. באמצעות פיפטה של 10 מ ל
2. העבירו את האגרגטים. לשפופרת של 15 מ ל לאפשר לאגרגטים תאים להתיישב על ידי כוח הכבידה עבור 1.5 דקות.
3. . הסר את הסופרנטאנט
4. רוחצים את האגרגטים בלבד (סרום-וללא אנטיביוטיקה).
5. לאפשר לאגרגטים תאים להתפשר על ידי משקעי כוח הכבידה עבור 1.5 דקות ב RT.
6. הוסיפו את הסופרנטנט ומוסיפים 2 מ ל טריפסין-אדטה (0.25%).
7. מניחים את אגרגטים התא לתוך אמבט מים (37 ° c) במשך 10 דקות. מתפרעים את האגרגטים בעדינות כל 2 דקות על ידי הקשה עם יד.
8. להפסיק את תהליך הטריסינוניזציה על ידי הוספת 4 מ ל של מדיום תחזוקה.
9. פיפטה מגיע למעלה ולמטה 20 פעמים. באמצעות פיפטה 1 מ ל
10. תאים צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g ו RT.
11. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-5 מ ל של אמצעי תחזוקה.
12. קבע את מספר הטלפון באמצעות מונה תאים.

6. ציפוי תאים

1. הוסף 3 מ ל לכל טוב של תחזוקה בינונית לצלחת 6.
2. תאי הזרע בצלחת התרבות 6-היטב בצפיפות של 0.5 x 10⁶/well.
3. מודטה ב 37 ° c עם 5% CO₂ ריכוז.
4. זרע את התאים על זכוכית לכסות ב 6 היטב לוחית התרבות ולבצע הכתמים עם נוגדן anti-MAP2 (20% המפגש). השימוש בצלחת 6-הבאר כדי לבודד RNA ולבצע RT-PCR עבור Map2, neun, Oct4, ננוg, ו-הגנד (20% המפגש).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הערכה פשוטה של פרוטוקול אינדוקציה נוירוגנזה ב P19 קו התא מוצג באיור 1. על מנת להגדיר את האופי של קו התא P19 במצב מובחן ובמהלך נוירוגנזה, RT-PCR (הפוכה שרשרת של תגובת השרשרת) שימוש. קו התאים P19 מובחן הביע את גנים הפלדה כגון קטיון אורגני/carnitine transporter4 (Oct4) ו nanog הומ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור נוירוגנזה באמצעות קו התא P19. למרות דיווחים רבים פורסמו בהקשר זה, מתודולוגיה מפורטת עבור אינדוקציה נוירוגנזה באמצעות קו P19 line נשאר ברור. יתר על כן, אנו מנוצלים גלוקוז גבוה פשוט (4,500 mg/L) DMEM בינוני עם 10% FBS עבור הניסוי כולו. הדבר איפשר לנו לבצע את הניסוי הנוירוגנ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6x DNA Loading Dye	EURx	E0260-01
Agarose	Sigma- Aldrich	A9539
cDNA synthesis kit	EURx	E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride)	Sigma- Aldrich	10236276001	Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine	Lonza	BE12-604Q
Ethanol 99.8%	Chempur	CHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS)	EURx	E5050-03
MAP2 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA517646	Dilution 1:100
PCR reaction kit	EURx	E0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
Retinoic acid	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	Dilution 1:500
Skim milk	Sigma- Aldrich	1153630500
TBE Buffer	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol Red	biosera	LM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological Pipettes	Profilab	515.01
10 mL Serological Pipettes	Profilab	515.10
100 mm dish dedicated for suspension culture	Corning	C351029
15 mL centrifuge tubes	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
5 mL Serological Pipettes	Profilab	515.05
6-well plate	Corning	CLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA