Neurogenese mit P19 Embryonalkarzinomzellen

Zusammenfassung

Die p19 Maus embryonale Karzinom-Zelllinie (P19-Zelllinie) ist weit verbreitet für die Untersuchung des molekularen Mechanismus der Neurogenese mit großer Vereinfachung im Vergleich zur In-vivo-Analyse verwendet. Hier stellen wir ein Protokoll zur Retinosäure-induzierten Neurogenese in der P19-Zelllinie vor.

Zusammenfassung

Die P19-Zelllinie, die von einem von Einem Mausembryon abgeleiteten Teratokarzinom abgeleitet wurde, hat die Fähigkeit, sich in die drei Keimschichten zu differenzieren. In Gegenwart von Retinsäure (RA) wird die suspensionskultivierte P19-Zelllinie induziert, um sich in Neuronen zu differenzieren. Dieses Phänomen wird als Neurogenese-Modell in vitro ausgiebig untersucht. Daher ist die P19-Zelllinie sehr nützlich für molekulare und zelluläre Studien im Zusammenhang mit Neurogenese. Protokolle zur neuronalen Differenzierung der in der Literatur beschriebenen P19-Zelllinie sind jedoch sehr komplex. Die in dieser Studie entwickelte Methode ist einfach und wird eine Rolle bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen bei neuroentwicklungsbedingten Anomalien und neurodegenerativen Erkrankungen spielen.

Einleitung

Während der embryonalen Entwicklung wird eine einzellige Schicht in drei separate Keimschichten^1,2,3umgewandelt. Um die Forschungsmöglichkeiten von Phänomenen zu erhöhen, die in vivo vorkommen, wurde die Erzeugung dreidimensionaler Aggregate (embryonale Körper) als praktisches Modell entwickelt. Zellaggregate, die auf diese Weise gebildet werden, können verschiedenen Bedingungen ausgesetzt werden, die eine Zelldifferenzierung verursachen, die die Entwicklung des Embryos^4,5widerspiegeln. Die p19 murinische embryonale Karzinom-Zelllinie (P19-Zelllinie) wird häufig als zelluläres Modell für Neurogenese-Studien in vitro^6,7,8verwendet. Die P19-Zelllinie weist typische pluripotente Stammzellmerkmale auf und kann sich in Gegenwart von Retinsäure (RA) während der Zellaggregation in Neuronen differenzieren, gefolgt von Neuritenwachstum unter anhaftenden Bedingungen. Darüber hinaus ist die undifferenzierte P19-Zelllinie auch in der Lage, unter dem Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO)^9,10,11,12muskel- und kardiomyozytenähnliche Zellen zu bilden.

Viele Methoden^13,14,15,16 wurden für die neuronale Differenzierung berichtet, aber die Methodik ist manchmal kompliziert und nicht leicht zu erfassen, indem man nur die Beschreibungen liest. Beispielsweise erfordern Protokolle manchmal eine Kombination aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medium, ergänzt durch eine Mischung aus Kalbsserum (CS) und fetalem Rinderserum (FBS)¹³. Darüber hinaus, Medien für die neuronale Entwicklung verwendet werden oft aus neurobasalen und B27 Ergänzungen^13,14,15,16. Daher enthalten bestehende Methoden Komplexität in ihrer Vorbereitung und unser Ziel ist es, die Protokolle zu vereinfachen. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass DMEM mit FBS zur Aufrechterhaltung der P19-Zelllinie (DMEM + 10% FBS) sowie zur neuronalen Entwicklung (DMEM + 5% FBS + RA) eingesetzt werden kann. Diese vereinfachte Methode für die Neurogenese mit der P19-Zelllinie ermöglicht es uns, den molekularen Mechanismus zu untersuchen, wie Neuronen entwickelt werden. Darüber hinaus wird die Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit auch mit P19-Zelllinie^17,18durchgeführt, und wir glauben, dass die in dieser Studie entwickelte Methode eine Rolle bei der Aufklärung der molekulare Mechanismen bei neuroentwicklungsbedingten Anomalien und neurodegenerativen Erkrankungen.

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Protokoll

1. Kulturpflege

1. Kultur der P19-Zelllinie im Wartungsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 4.500 mg/L Glukose, ergänzt durch 10% FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Einheiten/ml Streptomycin). Bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.

2. Unterkultivierungszellen

1. Wenn Zellen etwa 80 % Zusammenfluss erreichen, entfernen Sie das verbrauchte Medium aus den Zellkulturkolben (Oberfläche 25 cm²).
2. Waschen Sie die Zellen mit 2 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) frei von Kalzium und Magnesium.
3. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) auf die Zellmonoschicht geben.
4. Legen Sie den Kolben 2-3 min in den CO2-Inkubator (37 °C und 5% CO₂).
5. Bewerten Sie die Zellbefestigung an der Kolbenoberfläche. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen getrennt und im Medium schwebend sind.
6. Fügen Sie 9 ml Wartungsmedium hinzu, um die enzymatische Aktivität von Trypsin zu stoppen.
7. Setzen Sie die Zellen in Maintenance Medium wieder aus.
8. Übertragen Sie Zellen in ein 15 ml Rohr und Zentrifuge für 5 min bei 200 x g und Raumtemperatur (RT).
9. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml frisches Wartungsmedium in das 15 ml-Rohr ein.
10. Verwenden Sie die Zellsuspension, um die Zellnummer anhand eines Zellzählers gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.
11. Samenzellen bei 2 x 10⁴ Zellen/cm2 in einem neuen 25 cm² Kolben.
12. Fügen Sie das Wartungsmedium bis zu 10 ml hinzu.
13. Legen Sie den Kolben mit Zellen in den CO2-Inkubator (37 °C und 5% CO2 ) für 2-3 Tage.

3. Trypsin Verdauung

1. Aspirate Maintenance Medium aus dem Zellkolben. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 ml Calcium und Magnesium-freiem PBS.
2. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen.
3. Den Kolben mit Zellen bei 37 °C für 2-3 min in den CO2-Inkubator stellen.
4. Verwenden Sie 1 ml Pipette, um die Zellen durch zehnfache Pipettierzellen zu dissoziieren.
5. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 9 ml Differenzierungsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 4500 mg/L Glukose, ergänzt durch 5% FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Einheiten/ml Streptomycin) ohne RA zu den Zellen hinzufügen.
6. Übertragen Sie Zellen für 5 min bei 200 x g und RT in ein 15 ml-Rohr und eine Zentrifuge.
7. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml Differenzierungsmedium ohne Retinsäure (RA) hinzu. Setzen Sie das Zellpellet wieder auf.
8. Verwenden Sie die Zellsuspension, um die Zellnummer mithilfe eines Zellzählers gemäß der Anweisung des Herstellers zu bestimmen.

4. Aggregaterzeugung

1. Fügen Sie 5 l RA (1 mM In 99,8% Ethanol gelöst, bei -20 °C gelagert) zu den 10 ml Differenzierungsmedium hinzu und mischen Sie gut (Endkonzentration von 0,5 m RA).
   HINWEIS: RA ist lichtempfindlich. Eine niedrige Konzentration von EtOH hat keinen Einfluss auf die Zelldifferenzierung^19,20,21.
2. Fügen Sie 10 ml Differenzierungsmedium (mit RA) in das 100 mm unbehandelte Kulturgericht (für Diefederkultur) ein.
3. Säen Sie die 1 x 10⁶ Zellen in der 100 mm Schale (Dish Oberfläche 56,5 cm²).
4. Setzen Sie den Kolben mit Zellen bei 37 °C und 5% CO2 für 2 Tage in den Inkubator, um die Bildung von Aggregaten zu fördern.
5. Tauschen Sie nach 2 Tagen das Differenzierungsmedium aus. Aspiratmittel, das Aggregate mit einer 10 ml Pipette enthält und bei RT in ein 15 ml-Rohr überträgt.
6. Lassen Sie die Aggregate durch Schwerkraft für 1,5 min bei RT abgleichen.
7. Entsorgen Sie den Überstand.
8. Fügen Sie eine frische 10 ml Differenzierungsmedium mit 0,5 m RA mit einer 10 ml serologischen Pipette.
   ACHTUNG: Pipette die Zellaggregate nicht nach oben und unten.
9. Säen Sie die Aggregate in neue 100 mm unbehandelte Kulturschale (für Suspensionskultur).
10. Legen Sie die Platte 2 Tage lang in den Inkubator (bei 37 °C und 5% CO₂).

5. Aggregate Dissoziation

1. Aspirieren Sie die Zellaggregate mit einer 10 ml Pipette.
2. Übertragen Sie die Aggregate in ein 15 ml Rohr. Lassen Sie die Zellaggregate durch Schwerkraft für 1,5 min abgleichen.
3. Entfernen Sie den Überstand.
4. Waschen Sie die Aggregate allein mit DMEM (serum- und antibiotikafrei).
5. Lassen Sie die Zellaggregate durch Gravitationssedimentation für 1,5 min bei RT absetzen.
6. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml Trypsin-EDTA (0,25%).
7. Legen Sie die Zellaggregate 10 min in ein Wasserbad (37 °C). Rühren Sie die Aggregate alle 2 min vorsichtig, indem Sie mit einer Hand tippen.
8. Beenden Sie den Trypsinisierungsprozess, indem Sie 4 ml Wartungsmedium hinzufügen.
9. Pipette aggregiert 20 Mal mit 1 ml Pipette nach oben und unten.
10. Zentrifugenzellen für 5 min bei 200 x g und RT.
11. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 5 ml Wartungsmedium wieder auf.
12. Bestimmen Sie die Zellennummer mit einem Zellenzähler.

6. Plattieren von Zellen

1. Fügen Sie 3 ml pro Bohrgut von Maintenance Medium zu einer 6-Well-Platte hinzu.
2. Samenzellen in der 6-Well-Kulturplatte mit einer Dichte von 0,5 x 10⁶/well.
3. Bei 37 °C mit 5% CO2-Konzentration inkubieren.
4. Säen Sie die Zellen auf Deckglas in 6 Brunnenkulturplatte und führen Sie Immunfärbung mit Anti-MAP2-Antikörper (20% Zusammenfluss). Verwenden Sie 6-Well-Platte, um RNA zu isolieren und RT-PCR für Map2, NeuN, Oct4, Nanogund Gapdh (20% Zusammenfluss) durchzuführen.

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Ergebnisse

Das vereinfachte Schema des Protokolls für die Neurogenese-Induktion in Der P19-Zelllinie ist in Abbildung 1dargestellt. Um den Charakter der P19-Zelllinie in einem undifferenzierten Zustand und während der Neurogenese zu definieren, wurde die RT-PCR-Methode (Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion) verwendet. Die undifferenzierte P19-Zelllinie exprimierte die Pluripotenzgene wie organischekation/carnitin transporter4 (Oct4) und Nanog homeo...

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Diskussion

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Neurogenese mit der P19-Zelllinie. Obwohl viele Berichte in dieser Hinsicht veröffentlicht wurden, eine detaillierte Methodik für Neurogenese Induktion mit P19-Zelllinie bleibt unklar. Darüber hinaus haben wir ein einfaches hochglukose (4.500 mg/L) DMEM-Medium mit 10% FBS für das gesamte Experiment verwendet. Dies ermöglichte es uns, das neurogene Experiment benutzerfreundlich durchzuführen und die Anwendung dieser Methode für die Zukunft zu erweitern.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6x DNA Loading Dye	EURx	E0260-01
Agarose	Sigma- Aldrich	A9539
cDNA synthesis kit	EURx	E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride)	Sigma- Aldrich	10236276001	Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine	Lonza	BE12-604Q
Ethanol 99.8%	Chempur	CHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS)	EURx	E5050-03
MAP2 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA517646	Dilution 1:100
PCR reaction kit	EURx	E0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
Retinoic acid	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	Dilution 1:500
Skim milk	Sigma- Aldrich	1153630500
TBE Buffer	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol Red	biosera	LM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological Pipettes	Profilab	515.01
10 mL Serological Pipettes	Profilab	515.10
100 mm dish dedicated for suspension culture	Corning	C351029
15 mL centrifuge tubes	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
5 mL Serological Pipettes	Profilab	515.05
6-well plate	Corning	CLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA