JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Линия эмбриональной карциномы P19 мыши (линия клеток P19) широко используется для изучения молекулярного механизма нейрогенеза с большим упрощением по сравнению с анализом in vivo. Здесь мы представляем протокол для ретинойной кислоты индуцированного нейрогенеза в линии клеток P19.

Аннотация

Линия клеток P19, полученная из тератокарциномы эмбриона, полученного из эмбриона мыши, имеет способность дифференцироваться в три слоя микробов. При наличии ретинойной кислоты (РА), суспензия культивируемая линия клеток P19 индуцируется, чтобы дифференцироваться в нейроны. Это явление широко исследуется как модель нейрогенеза in vitro. Таким образом, линия клеток P19 очень полезна для молекулярных и клеточных исследований, связанных с нейрогенезом. Тем не менее, протоколы для нейрональной дифференциации линии клеток P19, описанные в литературе, очень сложны. Метод, разработанный в этом исследовании, прост и будет играть определенную роль в выяснении молекулярных механизмов в нейроразвития аномалий и нейродегенеративных заболеваний.

Введение

Во время эмбрионального развития одноклеточный слой превращается в три отдельных слоя зародыша1,2,3. Для расширения возможностей исследований явлений, происходящих в vivo, в качестве удобной модели были разработаны генерации трехмерных агрегатов (эмбриональных тел). Сотовые агрегаты, образующиеся таким образом, могут подвергаться воздействию различных условий, вызывающих дифференциацию клеток, которые отражают развитие эмбриона4,5. P19 murine эмбриональной линии клеток карциномы (P19 клеточной линии) обычно используется в качестве клеточной модели для нейрогенеза исследований в пробирке6,7,8. Линия клеток P19 демонстрирует типичные плюрипотентные черты стволовых клеток и может дифференцироваться в нейроны в присутствии ретинойной кислоты (РА) во время агрегации клеток, а затем невритовый рост в условиях адепта. Кроме того, недифференцированная линия клеток P19 также способна формировать мышечно-и кардиомиоцитоподобные клетки под воздействием диметилсульфида (ДМСО)9,10,11,12.

Многие методы13,14,15,16 были зарегистрированы для нейронной дифференциации, но методология иногда сложна и не легко понять, только читая описания. Например, протоколы иногда требуют комбинации Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) среды дополнены смесью сыворотки икры (CS) и сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS)13. Кроме того, средства массовой информации, используемые для развития нейронов часто состоят из Neurobasal и B27 добавки13,14,15,16. Таким образом, существующие методы содержат сложность в их подготовке, и наша цель здесь заключается в упрощении протоколов. В этом исследовании мы продемонстрировали, что DMEM с FBS может быть использован для поддержания линии клеток P19 (DMEM и 10% FBS), а также для развития нейронов (DMEM 5% FBS и RA). Этот упрощенный метод нейрогенеза с использованием линии клеток P19 позволяет нам изучать молекулярный механизм развития нейронов. Кроме того, исследования нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера также проводится с использованием P19 клеточной линии17,18, и мы считаем, что метод, разработанный в этом исследовании будет играть определенную роль в выяснении молекулярные механизмы при нейроразвитиях и нейродегенеративных заболеваниях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Содержание культуры

  1. Культура P19 клеточной линии в обслуживании среднего (Dulbecco в модифицированной среде Eagle с 4500 мг / л глюкозы дополнены 10% FBS, 100 единиц / мл пенициллин и 100 единиц / мЛ streptomycin). Инкубировать при 37 градусахПо кв. м и 5% CO 2.

2. Подкультинговые клетки

  1. Когда клетки достигают приблизительно 80% слияния, удалите отработанное средство изколбы клеточной культуры (площадь поверхности 25 см 2).
  2. Вымойте клетки с 2 мл фосфатов буферного солья (PBS) без кальция и магния.
  3. Добавьте 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА (этилэндиаминетететраацетическая кислота) на клеточный монослой.
  4. Положите колбу в инкубатор CO2 (37 градусов по Цельсию и 5% CO2)в течение 2-3 мин.
  5. Оцените привязанность клеток к поверхности колбы. Убедитесь, что все ячейки отделены и плавающие в среде.
  6. Добавьте 9 мл средних эксплуатационных посредственых, чтобы остановить ферментативную активность трипсина.
  7. Повторное приостановку работы ячеек в средстве технического обслуживания.
  8. Перенесите клетки в трубку 15 мл и центрифугу на 5 мин при температуре 200 х и комнатной температуре (RT).
  9. Отбросьте супернатант и добавьте 10 мл свежего среднего обслуживания в трубку 15 мл.
  10. Используйте суспензию ячейки, чтобы определить номер ячейки с помощью счетчика ячейки в соответствии с инструкциями производителя.
  11. Семенные клетки на 2 х 104 клетки/см2 в новой 25 см2 колбы.
  12. Добавьте средний уровень обслуживания до 10 мл.
  13. Положите колбу с клетками в инкубатор CO2 (37 градусов по Цельсию и 5% CO2)в течение 2-3 дней.

3. Трипсин пищеварение

  1. Аспирите Обслуживание Средний из колбы клетки. Вымойте клетки один раз с 2 мл кальция и магния без PBS.
  2. Добавьте 1 мл 0,25% трипсин-EDTA.
  3. Положите колбу с клетками в инкубатор CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение 2-3 мин.
  4. Используйте 1 мл пипетки, чтобы разъединить клетки трубацией клеток в десять раз.
  5. Нейтрализовать трипсин, добавив 9 мл дифференциации Medium (Dulbecco в модифицированной среде Eagle с 4500 мг / л глюкозы дополняется 5% FBS, 100 единиц / мл пенициллин и 100 единиц / мл streptomycin) без РА в клетки.
  6. Перенесите клетки в трубку 15 мл и центрифугу на 5 мин при 200 х г и РТ.
  7. Откажитесь от супернатанта и добавьте 1 мл дифференциации Medium без ретинойной кислоты (РА). Отреприжите клеточные гранулы.
  8. Используйте суспензию ячейки для определения номера ячейки с помощью счетчика ячейки в соответствии с инструкцией производителя.

4. Агрегированное поколение

  1. Добавьте 5 зЛ РА (1 мМ бульона, растворенного в 99,8% этанола, хранящегося при -20 градусах Цельсия) к 10 мл дифференциации Среднего и хорошо перемешайте (окончательная концентрация 0,5 мкм РА).
    ПРИМЕЧАНИЕ: РА светочувствительный. Низкая концентрация EtOH не влияет на дифференциацию клеток19,20,21.
  2. Добавьте 10 мл дифференциации Medium (с РА) в 100 мм необработанное культурное блюдо (посвященное культуре подвески).
  3. Семя 1 х 106 клеток в 100 мм блюдо (Блюдо площадью 56,5 см2).
  4. Положите колбу с клетками в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 2 дней, чтобы способствовать образованию агрегатов.
  5. Через 2 дня обменяйся на средний дифференциация. Аспирная среда, содержащая агрегаты с помощью 10 мл пипетки и переносима на трубку 15 мл на РТ.
  6. Разрешить агрегаты, чтобы поселиться под действием силы тяжести в течение 1,5 мин на RT.
  7. Отбросьте супернатант.
  8. Добавьте свежий 10 мл дифференциации Medium с 0,5 мкм РА с помощью серологического пипетки 10 мл.
    ПРЕДЕКТО: Не пипетка ячейки агрегатов вверх и вниз.
  9. Семя агрегатов в новый 100 мм необработанных культуры блюдо (посвященный подвесной культуры).
  10. Поместите тарелку в инкубатор (при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2)в течение 2 дней.

5. Агрегаты диссоциации

  1. Аспирировать агрегаты ячейки с помощью 10 мл пипетки.
  2. Перенесите агрегаты на трубку объемом 15 мл. Разрешить совокупности клеток, чтобы осесть под действием силы тяжести в течение 1,5 мин.
  3. Удалите супернатант.
  4. Вымойте агрегаты только с DMEM (без сыворотки и антибиотиков).
  5. Разрешить клеточные агрегаты оседать гравитационным осадочным отложением в течение 1,5 мин на RT.
  6. Усилите супернатант и добавьте 2 мл трипсина-ЭДТА (0,25%).
  7. Поместите агрегаты ячейки в водяную ванну (37 градусов по Цельсию) в течение 10 мин. Агитировать агрегаты осторожно каждые 2 минуты, нажав рукой.
  8. Остановите процесс трипсинизации, добавив 4 мл среднего обслуживания.
  9. Пипетка агрегатирует вверх и вниз 20 раз с помощью 1 мл пипетки.
  10. Клетки центрифуги в течение 5 мин при 200 х г и РТ.
  11. Удалите супернатант и resuspend клетки гранулы в 5 мл обслуживания среднего.
  12. Определите номер ячейки с помощью клеточного счетчика.

6. Покрытие ячеек

  1. Добавьте 3 мл на скважину среднего обслуживания в 6-колодную пластину.
  2. Семенные клетки в 6-хорошей культуре пластины при плотности 0,5 х 106/ хорошо.
  3. Инкубировать при 37 градусах Цельсия с концентрацией 5% CO 2.
  4. Семя клетки на крышке стекла в 6 хорошо культуры пластины и выполнять иммуно-пятно с анти-MAP2 антитела (20% слияния). Используйте 6-колодую пластину, чтобы изолировать РНК и выполнить RT-PCR для Map2, NeuN, Oct4, Nanog, и Gapdh (20% слияния).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Упрощенная схема протокола индукции нейрогенеза в линии клеток P19 представлена на рисунке 1. Для определения характера клеточной линии P19 в недифференцированном состоянии и во время нейрогенеза был использован метод RT-PCR (обратная транскрипция-полимер...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы описываем простой протокол нейрогенеза с использованием линии клеток P19. Хотя многие доклады были опубликованы в этой связи, подробная методология индукции нейрогенеза с использованием линии клеток P19 остается неясным. Кроме того, мы использовали простой высокий уровень глюк?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование было финансово поддержано Национальным научным центром, Польша (грант нет. УМО-2017/25/N/N/N/01886) и KNOW (Ведущий национальный исследовательский центр) Научный консорциум "Здоровое животное - безопасная пища", решение Министерства науки и высшего образования No 05-1/KNOW2/2015

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6x DNA Loading DyeEURxE0260-01
AgaroseSigma- AldrichA9539
cDNA synthesis kitEURxE0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride)Sigma- Aldrich10236276001Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamineLonzaBE12-604Q
Ethanol 99.8%ChempurCHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS)EURxE5050-03
MAP2 antibodyThermo Fisher ScientificPA517646Dilution 1:100
PCR reaction kitEURxE0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10KLonzaDE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+LonzaBE17- 517Q
Retinoic acidSigma- AldrichR2625-50MG dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)Thermo Fisher ScientificA11034Dilution 1:500
Skim milkSigma- Aldrich1153630500
TBE BufferThermo Fisher ScientificB52
Triton-X 100Sigma- AldrichT8787-100ML
Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol RedbioseraLM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological PipettesProfilab515.01
10 mL Serological PipettesProfilab515.10
100 mm dish dedicated for suspension cultureCorningC351029
15 mL centrifuge tubesSigma- AldrichCLS430791-500EA
5 mL Serological PipettesProfilab515.05
6-well plateCorningCLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2Sigma- AldrichCLS430639-200EA

Ссылки

  1. Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488(2011).
  2. Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
  3. Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 233-262 (2004).
  4. Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).
  5. ten Berge, D., et al. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
  6. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).
  7. Lin, Y. T., et al. YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway. Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).
  8. Neo, W. H., et al. MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression. Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).
  9. Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
  10. McBurney, M. W., Rogers, B. J. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).
  11. Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).
  12. Jasmin,, Spray, D. C., Campos de Carvalho, A. C., Mendez-Otero, R. Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells. Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).
  13. Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity. Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).
  14. Babuska, V., et al. Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation. Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).
  15. Monzo, H. J., et al. A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).
  16. Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity. BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42(2017).
  17. Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).
  18. Tsukane, M., Yamauchi, T. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).
  19. Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).
  20. Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
  21. Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).
  22. Hamada-Kanazawa, M., et al. Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid. FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).
  23. Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons. Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051(2013).
  24. Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters. Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).
  25. MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).
  26. Hong, S., et al. Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).
  27. Wenzel, M., et al. Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells. FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).
  28. Harada, Y., et al. Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).
  29. Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum. Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).
  30. Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line. Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

146P19

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены