压力增强恐惧学习--创伤后应激障碍的健壮啮齿动物模型

摘要

在这里, 我们描述了进行压力增强恐惧学习 (大我) 实验所需的详细方法, 这是在大鼠和小鼠创伤后应激障碍的临床前模型。该模型利用巴甫洛夫恐惧调理和冻结的各个方面作为对啮齿动物增强恐惧的指标。

摘要

恐惧行为对于生存是重要的, 但过高的恐惧会增加患精神疾病的脆弱性, 如创伤后应激障碍 (PTSD)。要了解 PTSD 中恐惧失调的生物学机制, 首先必须从有效的疾病动物模型入手。本议定书描述了在大鼠和小鼠中进行压力增强恐惧学习 (大我) 实验的方法, 即 PTSD 的临床前模型。大我被开发来重述 PTSD 的关键方面, 包括对急性压力源引起的恐惧学习的长期敏感性。大我使用巴甫洛夫恐惧调理的一些方面, 但产生明显的和强健的敏感的恐惧反应远远大于正常条件恐惧反应。创伤程序包括将啮齿动物放置在调理室中, 并在90分钟内随机分布15非终止状态冲击 (用于大鼠实验; 对于小鼠实验, 使用10非终止状态随机分布60分钟以上的冲击).在2天, 啮齿类动物被放置在一个新的调理环境中, 他们收到一个单一的冲击;然后, 在3天, 它们被放回与2天相同的上下文中, 并测试了冻结级别的变化。与第一天没有受到冲击的人相比, 以前受到创伤的啮齿类动物在测试日的冻结水平有所提高。因此, 这种模式下, 单一的高度紧张的经验 (创伤) 产生极端恐惧与创伤事件相关的刺激。

引言

恐惧是生存的关键行为, 使个人能够识别和应对威胁。然而, 夸张的恐惧反应可能有助于精神障碍的发展, 如创伤后应激障碍 (PTSD)。PTSD 的一个特点是对轻度压力源的夸张反应, 特别是那些让人想起最初的创伤, 以及发展新恐惧的倾向^1,2。在实验室里, 恐惧通常是通过冰冻行为来衡量的, 这是人类和啮齿类动物^3、4的可靠和 ethologically 有效的恐惧指数。虽然众所周知, ptsd 涉及恐惧和增强恐惧表达的失调, 但缺乏强有力的创伤后应激障碍动物模型, 可靠地捕捉到相对无害刺激的这种增强恐惧反应。

本议定书提供了在大鼠和小鼠中进行压力增强恐惧学习 (大我) 实验的详细方法, 这是一种可靠和稳健的创伤后应激障碍临床前模型。大我利用巴甫洛夫恐惧调理的一些方面, 但它产生了不同的反应从正常恐惧调理和概括创伤后应激障碍患者的增强恐惧^5,6。在这个模型中, 单一的高度紧张的经验 (称为创伤) 导致持久的行为改变, 包括与创伤事件相关的刺激的极端恐惧, 增加的焦虑, 增加惊吓反应性, 并改变糖皮质激素信号^7,8。大我的主要特点是, 在不同的环境下接触创伤性压力源 (一系列非终止状态冲击) 后, 动物对轻度压力源 (例如, 单次休克) 在另一背景下表现出夸大的恐惧反应。重要的是, 大我效应不是由于从创伤语境到新的语境或增加的休克敏感性⁵的泛化。在我们的模型中, 我们有针对性地利用程序, 减少任何泛化到一个新的背景, 如独特的运输, 气味和网格地板模式。因此, 与正常的恐惧调理不同, 大我是一个非关联的过程, 导致一种新的恐惧学习, 这与与创伤经验不直接相关的环境线索不成比例地相关。广泛的工作表明, 一个90分钟的会话包含15个不可预知的冲击在大鼠 (或一个单一的60分钟的会话包含10个不可预知的冲击, 小鼠), 导致长期持续的警觉性恐惧调理随着焦虑和失调基底皮质酮的昼夜节律。相比之下, 对单个电击的预曝光不会产生大我⁹。此外, 大我可在大鼠和小鼠中可靠地使用。

因此, ptsd 的大我模型是一个强大的工具, 用于探讨创伤后应激障碍病理生理学的生物学机制。使用大我, 研究人员可以研究如何暴露于创伤会影响未来的恐惧学习。此外, 此模型可用于调查可能涉及的特定细胞和分子机制, 以调节在 PTSD 中观察到的增强的恐惧表达。

研究方案

1. 主题

1. 大 鼠
   1. 命令老鼠在大约90天后到达, 并在标准鼠笼中单独安置。
      注: 建议单壳体, 因为由于家庭笼中动物之间的相互作用, 群体住房产生变异性, 特别是在压力暴露之后。大我在雄性和雌性大鼠, 在长埃文斯和杜勒大鼠, 和在大鼠19天老^7,10。
   2. 随机分配动物至少两个条件: 创伤 (n = 8) 和没有外伤 (n = 8) (见劳等。⁵用于额外的控制条件)。
2. 小 鼠
   1. 订购小鼠在大约60天的时间到达, 并在标准的老鼠笼中单独安置。单个房子的小鼠在创伤前至少4周以及整个实验期间。
   2. 随机将动物分配到至少两个条件: 外伤 (n = 8) 和没有外伤 (n = 8)。

2. 设备设置

1. 设置一套恐惧调理室作为上下文 a 和第二组恐惧调理室作为上下文 B (见材料表)。将每个恐惧调理室放在一个声音衰减的隔间内, 防止外界噪音的侵入 (参见材料表)。
   1. 确保用可见光 (如白色架空房屋灯) 照亮腔室的方法存在于作为上下文 a 的腔室 (见材料表)。
   2. 确保不同的解决方案可用于清洁每种动物之间的腔室, 并为每个腔室(例如, 稀释清洗液和1% 乙酸) 提供不同的气味。
      注意: 动物产生的气味必须消除¹¹, 这是至关重要的。
   3. 将塑料刀片放置在上下文 B 中, 以区分两个上下文的内部布局。建议使用黑色有机玻璃三角刀片。或者, 使用白色塑料板材创建弧形后壁 (参见材料表)。
   4. 将栅格地板放置在每个恐惧调理室中, 以电击交付, 每个上下文使用不同的网格模式来区分上下文之间的楼板纹理 (请参见材料表)。
      注: 完全不同的网格模式包括扁平网格 (在单个水平平面中排列的所有条形)、交错网格 (在两个偏移水平平面中排列的条形) 和交替网格 (在单个水平平面上排列的条形, 但变化直径)。
   5. 将干净的金属平底锅放在每个格子地板下面收集粪便。使用清洁解决方案 (参见材料表) 的香味锅。
2. 为每个上下文提供准确的电击传递时间和振幅。
   1. 连接一个冲击发生器和扰频器能够提供 1 mA 或更低的振幅冲击到每个电网地面电击交付 (参见材料表)。
      注: 冲击发生器和扰频器应位于声音衰减室的外部, 电缆通过声音衰减室中的开口连接发电机和扰频器到网格层。这将防止由于咀嚼, 清洁溶液等造成的损害。
   2. 使用万用表通过将每个探头放置在栅格底板的不同柱上, 并确认所需的冲击振幅产生 (参见材料表), 来测试冲击发生器传递的电流。
   3. 确保提供用于控制冲击传递 (如计算机软件) 的时序和振幅的方法 (参见材料表)。
3. 确保每种动物在每个实验会话期间的视频录制方法可用 (参见材料表)。
   注: 当腔室处于黑暗中时, 有必要记录两个 1), 当分庭被可见光照射和 2)。后者可以通过使用夜视摄像头或使用红外线或近红外光照明和记录暗腔来实现。
4. 确保将动物从谢切诺夫运输到上下文 B 的独特方法可进一步区分这两种情况。
   注: 虽然将黑色塑料桶 (38 x 30 x 24 厘米) 分成四个隔层或干净的空笼等方法已成功使用, 但任何与主笼截然不同的运输箱都可以使用。

3. 大鼠和小鼠的大我程序

1. 每天处理所有啮齿动物, 轻轻地将它们从 homecage 中移除, 并在开始大我程序前至少7天保持60-90 秒。
2. 在大我程序的1天, 将受试者放在上下文 A 中, 在那里他们将接受创伤性压力源。
   1. 使用一组网格地板 (e.、扁平网格) 设置上下文 A, 并用可见光照亮房间。
   2. 使用万用表通过将每个探头放置在栅格底板的不同柱上, 并确认所需的冲击振幅产生, 从而测试冲击发生器传递的电流。
      注: 钢筋损坏或腐蚀可能导致冲击传递不稳定或不均匀。液体, 包括尿接触沿墙的网格也会对冲击传递产生不利影响。
   3. 擦拭室内墙壁和门, 用一个溶液 (如稀释的清洁液) 在网格地板下喷洒平底锅。
      注意: 这是必要的, 以消除以前的动物的气味。
   4. 将动物从谢切诺夫运送到实验室, 在自家笼子里放置在推车上, 单独放入恐惧调理室。一次只带一轮价值的动物 (由恐惧调理室的数量决定) 到实验室。
      注意: 为了避免混淆由于秩序或时间, 每回合应包含在创伤和没有创伤条件的动物。
   5. 对于大鼠实验, 使用休克发生器和扰频器提供 15 1 秒, 1 mA footshocks 随机呈现超过90分钟 (平均 ISI = 6 分钟) 通过在包含创伤条件的室的格子栏。在90分钟内将无创伤控制暴露在相同的环境下, 无需电击。
   6. 对于鼠标实验, 使用休克发生器和扰频器提供 10 1-秒, 1 mA footshocks 随机呈现超过60分钟 (平均 ISI = 6 分钟) 通过在包含创伤条件的房间的网格地板。在60分钟内将无创伤控制暴露在相同的环境下, 无需电击。
   7. 经过90分钟 (大鼠实验) 或60分钟 (小鼠实验), 将所有动物返回 homecages, 并迅速返回谢切诺夫。
3. 在大我程序的2天, 如果需要, 评估对创伤上下文的恐惧。
   1. 将上下文 A 设置为1天完成。
   2. 将动物送到室内笼子里的实验室, 如1天。
   3. 将动物放在上下文 A 中8分钟, 不带冲击传递, 视频记录整个会话期间的行为。
   4. 8分钟后, 返回所有动物 homecages, 并迅速返回谢切诺夫。
4. 在大我程序的3天, 将所有受试者暴露在上下文 B 中的轻度压力源上。
   注意: 此过程可能发生在24小时到创伤性压力源⁹后90天。
   1. 将上下文 B 设置为与上下文 a (例如,交替或交错的网格层) 和黑色三角形或白色弯曲的有机玻璃嵌套不同的网格层。不要用可见光照亮房间;虽然红外线或近红外光可以根据需要使用。
   2. 使用万用表通过将每个探头放置在栅格底板的不同柱上, 并确认所需的冲击振幅产生, 从而测试冲击发生器传递的电流。使用万用表通过将每个探头放置在栅格底板的不同柱上, 并确认所需的冲击振幅产生, 从而测试冲击发生器传递的电流。
      注: 钢筋损坏或腐蚀可能导致冲击传递不稳定或不均匀。液体, 包括尿接触沿墙的网格也会对冲击传递产生不利影响。
   3. 擦拭房间并在网格地板下喷洒平底锅, 并在上下文 A (e.、1% 乙酸) 中不使用该溶液。
   4. 将动物从谢切诺夫运输到实验室, 方法有别于上下文 a (例如,黑色塑料桶) 的方法, 并将它们单独放入恐惧调理室。一次只带一轮价值的动物到实验室 (由恐惧调理室的数量决定)。
   5. 将所有动物暴露在温和的压力源 (如下所述) 和视频记录冻结和活动在会话期间。
      1. 在180秒的基线周期后, 为所有动物提供单个1秒、1 ma 电击 (大鼠) 或单个2秒、1 mA 电击 (小鼠)。
         注: 确保在 180-s 基线期间冻结不应超过 5%¹²。
      2. 在休克后30秒内移除所有动物, 并立即返回谢切诺夫。
5. 在大我程序的4天, 测试对轻度压力源上下文的恐惧。
   1. 将上下文 B 设置为在3天完成。
   2. 运输动物从谢切诺夫到实验室在相同的交通在3天完成。
   3. 将动物放在上下文 B 中8分钟, 在整个会议期间不发生电击和录像记录冻结。
   4. 8分钟后移除所有动物, 并迅速返回谢切诺夫。

4. 数据分析

1. 在记录的实验会话中使用冷冻测量恐惧, 定义为缺乏所有运动, 除了呼吸所需。
   注意: 一个盲人射手最准确地得分, 但有几个自动程序执行良好。然而, 所有的自动化系统必须校准到人类观察者, 才能准确地¹³。
   1. 为了用手来进行冷冻, 有一个实验者对试验条件视而不见, 每隔4秒观察一次主题, 整个时间段的³。在每次观察时, 将主体归类为 "冻结" 或 "不冻结"。将冻结观测次数与观测总数进行比较, 以确定冻结所用的时间百分比。
   2. 要使用自动视频分析来评分冻结, 首先要验证自动视频分析的结果是否与从手动评分中获得的结果相匹配, 因为从自动分析得出的显著不同的冻结分数可能会产生不准确的结果。
      注意: 一只老鼠或一只老鼠, 从来没有被震惊应该显示在0和5% 之间的冻结, 而较高的值表明设备校准差
2. 使用上面描述的方法在感兴趣的时间段内测量恐惧 (如下所述)。
   1. 在2天的整个8分钟的测试会话中, 将恐惧度量为创伤上下文的百分比时间。
   2. 从创伤语境到轻度压力源上下文, 将恐惧的泛化程度作为在休克交付前3天的3分钟基线期间冻结的百分比时间。
      注意: 对于大我, 区分上下文足够好, 以便没有实质性的泛化是很重要的。
   3. 在3天的休克后立即测量恐惧, 这是在休克发生30秒期间冻结的百分比时间。
   4. 在4天的整个8分钟测试会话中, 将恐惧度量为轻度压力源上下文。
3. 在3天的休克期间和紧接着的3秒内, 通过运动的数量或速度来测量冲击反应性。
   注意: ANOVAs 建议用于所有数据分析, 因为其他组 (例如, 药物治疗) 可以根据需要添加。

结果

2天创伤上下文测试的结果如图 1所示。与无外伤对照相比, 创伤状态下的动物的冰冻程度明显较高, 表明对创伤情境的恐惧感 [大鼠: f(117) = 23.58, p < 0.01; 小鼠: f(114) = 666.50, p< 0.0001]。图 2所示, 在3天的小说语境中的单一冲击之前的基线期间冻结。创伤和没有外伤的动物都显示出最小的冰冻水平, 它们没有区别 [老鼠:

讨论

大我是一种强大的创伤后应激障碍行为模型, 可在大鼠和小鼠中概括, 可用于研究创伤后应激障碍的致敏性恐惧反应。在创伤后的压力下, 啮齿动物在截然不同的语境中表现出增加的恐惧反应, 只有在这种情况下, 与温和的压力源配对, 才能提醒人们以前的创伤经历。在创伤性压力下, 啮齿类动物在2天返回创伤性压力语境时毫不意外地表现出高水平的恐惧感, 这表明创伤性压力的记忆是完整的 (

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear Conditioning Chamber for Low Profile Floors	Med Associates Inc.	VFC-008-LP	Fear conditioning chamber
Sound Attenuating Cubicle	Med Associates Inc.	NIR-022SD	Sound-attentuaing cubicle to prevent intrusion of outside noise
NIR/White Light Control Box	Med Associates Inc.	NIR-100VR	Light control box capable of delivering white and near-infrared light
NIR VFC Light Box	Med Associates Inc.	NIR-100L2	White overhead houselight
Windex Original Glass Cleaner	Windex		Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals
Acetic acid	Fisher Scientific	A38-212	Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals
A-Frame Chamber Insert	Med Associates Inc.	ENV-008-IRT	Black Plexiglas triangular insert to differentiate internal layout of Contexts A and B
Curved Wall Insert	Med Associates Inc.	VFC-008-CWI	White plastic sheet to differentiate internal layout of Contexts A and B
Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Grid Rods for Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005A	Flat grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 1/8" & 3/16" Grid Rods Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005-S	Staggered grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Staggered Grid Rods for Mouse	Med Associates Inc.	VFC-005A-L	Alternating grid floor for mice
Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Grid Rods for Rat	Med Associates Inc.	VFC-005	Flat grid floor for rats
Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 3/16" & 3/8" Grid Rods	Med Associates Inc.	VFC-005-L	Alternating grid floor for rats
Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Staggered Grid Rods for Rat	Med Associates Inc.	VFC-005-S	Staggered grid floor for rats
Metal pans	Med Associates Inc.		Metal pans to catch droppings underneath grid floors
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler	Med Associates Inc.	ENV-414S	Shock generator and scrambler for footshock delivery
Multimeter	Fluke	87-5	Tool for measuring footshock amplitude
VideoFreeze Software	Med Associates Inc.	SOF-843	VideoFreeze software for controlling shock delivery
High Speed Firewire Monochrome Video Camera	Med Associates Inc.	VID-CAM-MONO-4	Video camera capable of recording in near-infrared light